| Приоритеты: |
Рисунки к патенту РФ 2130318
Изобретение относится к области медицины, конкретно к лекарствам и медикаментам (к иммуноглобулинам) для терапевтических целей, и может быть использовано при экстренной профилактике лихорадки Эбола.
Уровень техники
В настоящее время эффективные средства, методы лечения и профилактики лихорадки Эбола, являющейся тяжелым, особо опасным заболеванием с летальностью до 88%, отсутствуют.
Препарата, аналогичного предлагаемому, в мировой практике здравоохранения нет.
Сыворотка крови людей, переболевших лихорадкой Эбола, в сочетании с большими дозами интерферона была использована для лечения больного лихорадкой Эбола, заразившегося в результате случайного укола пальца [1].
Последующее экспериментальное изучение на обезьянах показало, что интерферон не защищал их от гибели [2].
Недостатком сыворотки реконвалесцентов является то, что она может быть контаминирована вирусами иммунодефицита и гепатита B, кроме того, наша страна не обладает ее запасами. Действительная же эффективность сыворотки нуждается в дальнейшем изучении.
Известна способность ряда животных (морских свинок, овец, коз) отвечать выработкой специфических антител на введение им препаратов вируса Эйбола [3,4].
Недостатком вышеперечисленных доноров является то, что они или не обеспечивают необходимого количества иммунной сыворотки, или их сыворотка может быть контаминирована посторонними вирусами (скрепи у овец) [5].
Известна также способность лошадей продуцировать специфические антитела после введения им нативного вируса Эбола [6].
Имеется опыт использования лошади как продуцента при получении иммуноглобулиновых препаратов против ряда вирусных инфекций [7,8].
Лошадь, обладающая высокой иммунологической реактивностью и обеспечивающая большие объемы сыворотки, была выбрана в качестве продуцента гипериммунной сыворотки к вирусу Эбола. Сыворотка лошадей лишена недостатков, присущих человеческой иммунной сыворотке, и является реальным сырьем для выделения иммуноглобулиновых препаратов.
Прототип иммуноглобулина Эбола - иммунная сыворотка крови реконвалесцентов, содержащая антитела к вирусу Эбола.
Сущность изобретения
Цель изобретения - иммуноглобулин против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкий, предназначенный для экстренной профилактики лихорадки Эбола.
При внутримышечном введении он оказывает выраженное профилактическое действие при лихорадке Эбола.
По сенсибилизирующим свойствам иммуноглобулин Эбола не отличается от других коммерческих иммуноглобулинов из сыворотки крови лошадей и по физико-химическим показателям соответствует требованиям, предъявляемым к гетерологичным иммуноглобулинам.
Сырьем для получения иммуноглобулина является гипериммунная лошадиная сыворотка, содержащая антитела к вирусу Эбола. Забор крови от продуцента осуществляют на 28-42 сутки после 3-ей и последующих иммунизаций (с учетом грунд-иммунизации) лошадей нативным вируссодержащим материалом, когда антитела достигают максимального уровня.
Выделение иммуноглобулина Эбола проводят методом спиртового фракционирования на холоду по Кону [9].
Сведения подтверждающие возможность осуществления изобретения
Было получено 25 серий иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей.
Характеристика препаратов имуноглобулина Эбола представлена в таблице.
Комплект НТД на иммуноглобулин против лихорадки Эбола утвержден в Комитете МИБП 19.05.94 г., а также рассмотрен и одобрен на заседании Президиума Государственной Фармкомитета 22.11.95 г. (ВФС 42-2662-95).
Библиографические данные
1. Emond R. T.D., Evans B., Bower E.T.W. et al.//Brit. Med.J. - 1977.- vol.2., N 6086. - p.541-544.
2. Ebola virus haemorrhagic fever/ Bowen E.T.W., Baskerville A., Contell KL. et al. - Amsterdam, 1978. - p.245-252.
3. Вирусные геморрагические лихорадки. Доклад Комитета экспертов ВОЗ. - М., 1986.
4. Кизимов Н.В., Кудояров Н.М., Калибров С.А. и др.// Вопросы биотехнологии. - Томск, 1991. - ч.2. - с. 31-32.
5. Вирусология /Под ред. Б.Филдса. -М., 1989. - т. 3. - с. 419-430.
6. Краснянский В.П., Михайлов В.В., Борисевич И.В. и др.// Вопр.вирусол. - 1994, N 2. - с. 91-92.
7. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. - М., 1978. - с. 308-321.
8. Пшеничнов В. А., Краснянский В.П., Михайлов В.В. // Вопр.вирусол. - 1992, N 4. - c/ 178-180/
9. Cohn E.J., Strong L., Hugnes W.L. et al.//J.Amer. Chem. Soc. - 1946. - Vol. 68, N 3. - p. 459-464.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вспомним:
Ebolavirus (Вирус Эбо́ла) — род вирусов из семейства филовирусов, вызывающих геморрагическую лихорадку Эбола у высших приматов. Отличается высоким уровнем летальности. Относится к особо опасным вирусным инфекциям.
Краткие исторические сведения
Впервые заболевание зарегистрировано и описано в районе Эбола (Заир) в 1976 г. В это же время из крови у одного из умерших больных выделен возбудитель. Вспышки инфекции в Заире и Судане в 1976-1979 гг., в Заире в 1994-1995 гг., исчисляемые сотнями заболевших, сопровождались высокой летальностью (от 53% до 88%). В 1996 г. вспышка лихорадки Эбола зарегистрирована в Габоне. Данные ретроспективного серологического скрининга населения позволяют утверждать, что эпидемии заболевания отмечали в 1960-1965 гг. в Нигерии, Сенегале, Эфиопии.
Механизм передачи лихорадки Эбола разнообразный. Политропность вируса, многообразие путей его выделения из организма определяют возможность заражения при контакте с кровью больных, половым и аэрозольным путями, при пользовании общими предметами обихода и совместном питании. Установлено, что заражение при лихорадке Эбола в основном реализуется путём прямого контакта с инфицированным материалом. Заболевание очень контагиозно и передаётся при попадании вируса на кожу и слизистые оболочки. Наиболее опасна кровь. Наибольшему риску заражения подвергается медицинский персонал при уходе за больными. Отсутствие заболеваний среди лиц, находившихся с больными в одном помещении, но не имевших с ними тесного контакта, позволило сделать вывод о том, что воздушно-капельная передача маловероятна.
Естественная восприимчивость людей к лихорадке Эбола высокая. Постинфекционный иммунитет стойкий. Повторные случаи заболеваний редки; их частота не превышает 5%.
Инкубационный период составляет от 2 до 21 дня.
Для лихорадки Эбола характерны внезапное повышение температуры тела, выраженная общая слабость, мышечные и головные боли, а также боли в горле. Зачастую это сопровождается рвотой, диареей, сыпью, нарушением функций почек и печени, а в некоторых случаях как внутренними, так и внешними кровотечениями. В лабораторных тестах выявляются низкие уровни белых кровяных клеток и тромбоцитов наряду с повышенным содержанием ферментов печени [12] .
В тяжелых случаях заболевания требуется интенсивная заместительная терапия, так как пациенты часто страдают от обезвоживания и нуждаются во внутривенных вливаниях или пероральной регидратации с помощью растворов, содержащих электролиты. Лечение проводят в специализированных инфекционных отделениях с режимом строгой изоляции. Применяют методы патогенетической и симптоматической терапии. В большинстве случаев они оказываются малоэффективными. Этиотропная терапия не разработана. В эпидемических очагах может быть получен положительный эффект от применения плазмы реконвалесцентов.
Лихорадка Эбола — это так называемая природно-очаговая болезнь. Географически территории таких инфекций ограничены природными очагами, т. е.экосистемами, где они поддерживаются в каком-то первичном резервуаре. Им может быть только клеточный хозяин, без которого существование таких вирусов в течение миллионов и более лет невозможно. Человек, обезьяны и даже летучие мыши для вирусов геморрагических лихорадок являются биологическим тупиком. Вспышки болезни среди людей возникают в результате нарушения природных экосистем, вмещающих вирус, и при наличии механизма передачи вируса к людям, проживающим на территориях его природных очагов. Это исключительные по своей сложности процессы. Но так сложилось, что они произошли, а на территориях Эболы живут люди, которых мы называем африканцами. Вот и весь секрет.
Нынешняя эпидемическая ситуация, напугавшая ВОЗ, вызревала не один десяток лет, а может быть и дольше. В движение пришли мощные природные силы, о которых мы ничего не знаем. Поэтому и эпидемия носит упорный и длительный в нашем понимании времени характер. Но границы природных очагов лихорадки Эбола давно очерчены учеными-эпидемиологами. А внутри очагов заболевают и африканцы, и белые, живущие, работающие там.
Но обратите внимание, европейцы заболевают именно на территориях этих природных очагов и больными приезжают в Европу. То же и с американцами.
Эпидемиологический надзор
Осуществление Международной системы эпидемиологического надзора за контагиозными геморрагическими лихорадками призвано обеспечить необходимой информацией для своевременного и полного проведения профилактических мероприятий. В связи с трудностью в ряде случаев осуществления полноценной лабораторной диагностики заболеваний важнейшее значение приобретают клинические проявления. С учётом концепции ВОЗ все страны обязаны немедленно уведомлять штаб-квартиру о единичных или групповых тяжёлых заболеваниях, для которых характерен синдром острой геморрагической лихорадки. По определению Комитета экспертов ВОЗ, больной лихорадкой Ласса, Марбург и Эбола - человек с лихорадочным заболеванием, сопровождающимся одним или несколькими из следующих признаков: выделение вируса, 4-кратное нарастание титров антител к вирусу через 1-2 нед после забора. При лихорадке Ласса титры IgG при поступлении не менее 1:512 и позитивные титры IgM, при лихорадках Марбург и Эбола- содержание IgM 1:8 и выше, IgG - 1:64 в РИФ.
Профилактические мероприятия
В результате фундаментальных исследований биологических свойств вируса Эбола созданы предпосылки для разработки вакцины и неспецифических защитных препаратов.
Мероприятия в эпидемическом очаге
Больные геморрагическими лихорадками Ласса, Марбурга и Эбола подлежат немедленной госпитализации в боксовые отделения с соблюдением строгого режима, рекомендуемого в случаях особо опасных инфекций, таких как чума и оспа. Выздоровевших выписывают не ранее 21-го дня от начала болезни при нормализации состояния больных и 3-кратных отрицательных вирусологических исследованиях. Все предметы обихода больного должны быть строго индивидуальными, маркированными. Их хранят и дезинфицируют в боксе. Для лечения применяют инструменты разового пользования; после употребления их авто-клавируют или сжигают. В период текущей дезинфекции применяют 2% раствор фенола [с добавлением 0,5% гидрокарбоната натрия (1:500)], йодоформ (450 г на 1 мл активного йода с добавлением 0,2% натрия нитрата). Выделения больных также обрабатывают соответствующим образом. Обслуживающий персонал должен работать в противочумном костюме 1 типа. Разработаны специальные пластиковые боксы, в которых с помощью вытяжной системы, снабжённой блоком дезактивации, обеспечивается приток воздуха в одном направлении - внутрь бокса. Такие боксы снабжены обычной системой для обеспечения полной безопасности персонала во время медицинских манипуляций. Особую осторожность следует соблюдать при исследованиях крови и других биологических материалов от больных геморрагическими лихорадками и подозрительных на заболевание.
Лиц, находившихся в непосредственном контакте с больным лихорадкой Эбола(или лицом, у которого подозревают развитие заболевания), изолируют в бокс и наблюдают в течение 21 дня. Во всех случаях подозрения на заражение вирусом Эбола вводят специфический иммуноглобулин из сыворотки гипериммунизированных лошадей. Срок действия иммуноглобулин - 7-10 дней
Последние новости
После распространения вируса Эбола в западной Африке прошел один год. В Гвинее, Либерии и Сьерра-Леоне жертвами вируса стали более десяти тысяч человек. Есть мнение, что пик распространения вируса уже позади, однако расслабляться нельзя. Необходимо внимательно следить за ситуацией.
Распространение вируса Эбола наглядно продемонстрировало, сколь мало мировое сообщество готово к появлению опасных вирусов, которые способны распространиться по всему миру. Помимо Эболы есть и другие вирусы, которых следует опасаться: новые гриппы и ближневосточный респираторный синдром. Необходимо создать международную систему, которая будет готова реагировать на вирус, появившийся в любой части мира.
Профессор Университета Тохоку Хитоси Оситани (Hitoshi Oshitani) говорит о том, что Эбола — это вирус, на который сравнительно легко реагировать. Он передается при контакте с выделениями организма. Грипп распространяется воздушно-капельным путем, поэтому с ним сложнее бороться, чем с Эболой. В этот раз на распространение вируса Эбола повлияла запоздалая реакция со стороны Всемирной организации здравоохранения. Во время кризиса проявились слабые места организации: недостаток капитала и сотрудников. В качестве ответной меры появился проект создания фонда с капиталом в 100 миллионов долларов на случай чрезвычайной ситуации. Достаточно ли этого? За распространением вируса стоят социальный хаос и нищета. По всей видимости, мировому сообществу необходимо приложить усилия к тому, чтобы обеспечить стабильную политическую обстановку и медицинскую базу в развивающихся странах. Также необходимо позаботиться о разработке вакцин и лекарств. По расчетам Всемирного банка, в случае повсеместного распространения нового гриппа миру будет нанесен экономический ущерб в размере трех триллионов долларов. Необходима реакция в масштабах всей планеты.
Многие страны и Китай помогли решить проблему Эболы, отправив свои команды в страны, где распространился вирус. Япония отправила около 20 врачей через Всемирную организацию здравоохранения, а также предоставила спецодежду и финансовую помощь в размере 100 миллионов долларов. Тем не менее этого было недостаточно.
Страны, где распространился вирус, находятся далеко от большинства высокоразвитых стран, поэтому сложно реагировать в полную силу. Тем не менее опасные вирусы необходимо изучать, находясь в эпицентре, поэтому очевидно, что был упущен шанс подготовить опытных специалистов.
Следует приложить усилия не только к подготовке кадров внутри отдельной страны, но и создать мировую систему, при которой появится возможность в случае чрезвычайной ситуации направлять специалистов непосредственно к месту событий.
Изобретение относится к способу получения гипериммунной сыворотки для производства лечебного иммуноглобулина против лихорадки Эбола и может быть использовано в медицине для экстренной профилактики лихорадки Эбола.
Известен способ получения гетерологических иммуноглобулинов против вирусных инфекций Марбург и Эбола, включающий иммунизацию животных-продуцентов вирусными антигенами, приготовленными из органов инфицированных животных, периодический забор крови у животных-продуцентов с последующим выделением сыворотки, спиртовое осаждение фракции глобулинов из сыворотки крови при отрицательных температурах и последующую очистку глобулинов (патент РФ №2089217, МПК А61К 39/295, опубл. 10.09.1997 г.). В качестве животных-продуцентов используют овец или коз, а забор крови у этих животных осуществляют при достижении активности индекса нейтрализации 2,0 lg и более в реакции биологической нейтрализации на лабораторных животных при инфицировании животных-продуцентов вирусом Марбург и активности индекса нейтрализации 2,75 lg и более при инфицировании животных-продуцентов вирусом Эбола.
Известен способ получения иммуноглобулина из гипериммунной лошадиной сыворотки, содержащей антитела к вирусу Эбола (патент РФ №2130318, МПК А61К 39/42, опубл. 20.05.1999 г.). Забор крови от продуцента осуществляют на 28-42 сутки после 3-ей и последующих иммунизаций (с учетом грунд-иммунизации) лошадей нативным вируссодержащим материалом, когда антитела достигают максимального уровня. Выделение иммуноглобулина Эбола проводят методом спиртового фракционирования на холоду по Кону.
Однако для формирования у животных пула нейтрализующих антител используется живой вирус Эбола в виде культуральной вируссодержащей жидкости или гомогената печени зараженных вирусом Эбола морских свинок. Использование живого вируса Эбола, относящегося к I группе патогенности по классификации Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Санитарно-эпидемиологические правила, СП 1.3.3118-13 БЕЗОПАСНОСТЬ РАБОТЫ С МИКРООРГАНИЗМАМИ I-II ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ (ОПАСНОСТИ), требует использования вивария для содержания зараженных животных, оборудованного сложнейшими инженерно-техническими системами. Кроме этого, использование живого вируса Эбола в качестве антигена для иммунизации связано с его получением в препаративных количествах, и также как и содержание иммунизированных животных, требует проведение работ в максимально защищенных лабораториях. Такого рода работы с точки зрения биобезопасности связаны с высоким риском заражения для персонала лаборатории.
Известен способ получения рекомбинантных гуманизированных антител, обладающих нейтрализующей активностью в отношении вируса Эбола (Olinger GG Jr, Pettitt J., Kim D., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012; 109:18030-5; Pettitt J., Zeitlin L., Kim K, et al. Therapeutic intervention of Ebola virus infection in rhesus macaques with the MB-003 monoclonal antibody cocktail // Sci. Transl. Med. 2013; 5:199). Например, американской биотехнологической фирмой Марр Biopharmaceutical Inc. (США) разработан препарат ZMapp, который представляет собой композицию трех гуманизированных моноклональных антител, которые производиться в листьях табака (род Nicotiana). Для получения препарата гены, кодирующие химерные моноклональные антитела, были вставлены в вектора, которыми были заражены растения табака. Препарат ZMapp был использован в составе комплексной терапии для лечения людей во время эпидемии лихорадки Эбола в странах северо-западной Африки в 2014-2016 годах.
Однако недостатком такого способа получения рекомбинантных гуманизированных антител является долгий срок получения препарата (несколько месяцев, пока растет растение: Pollack, Andrew (8 August 2014). "In Ebola outbreak, who should get experimental drug?". The New York Times), необходимость строгого выполнения условий выращивания в условиях оранжереи при определенной температуре и освещенности и низкий выход препарата при наработке (из 18 растений можно получить 1 лечебную дозу для человека).
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения иммуноглобулинов против вируса Эбола (патент Китая № CN 104829710, МПК А61К 39/42, опубл. 12.08.2015 г.) путем иммунизации лошадей либо 1) ДНК-препаратом, включающим в свой состав ген, кодирующий GP белок эболавируса Заир, либо 2) ДНК-препаратом, включающим в свой состав ген, кодирующий GP белок эболавируса Судан, либо 3) ДНК-препаратом, включающим в свой состав ген, кодирующий GP белок эболавируса Кот-д’Ивуар, либо 4) смесью перечисленных препаратов в соотношении 1:1:1. Для получения гипериммунной сыворотки против одного из видов эболавируса (эболавируса Заир, эболавируса Судан или эболавируса Кот-д’Ивуар) первую иммунизацию лошадей проводят дозой 1 мг ДНК-препарата, содержащего GP ген любого из указанных эболавирусов; вторую - дозой 1 мг ДНК-препарата, содержащего GP ген любого из указанных эболавирусов; третью - дозой 2 мг ДНК-препарата, содержащего GP ген любого из указанных эболавирусов; и четвертую - дозой 3 мг ДНК-препарата, содержащего GP ген любого из указанных эболавирусов. Для получения гипериммунной сыворотки против 3 видов эболавируса (эболавируса Заир, эболавируса Судан или эболавируса Кот-д’Ивуар) первую иммунизацию лошадей проводят дозой 9 мг смеси ДНК-препаратов, содержащих GP ген каждого из указанных эболавирусов, в пропорции 1:1:1 (по 3 мг каждого ДНК-препарата); вторую - дозой 18 мг смеси ДНК-препаратов, содержащих GP ген каждого из указанных эболавирусов, в пропорции 1:1:1 (по 6 мг каждого ДНК-препарата); третью - дозой 36 мг смеси ДНК-препаратов, содержащих GP ген каждого из указанных эболавирусов, в пропорции 1:1:1 (по 12 мг каждого ДНК-препарата); и четвертую - дозой 72 мг смеси ДНК-препаратов, содержащих GP ген каждого из указанных эболавирусов, в пропорции 1:1:1 (по 24 мг каждого ДНК-препарата). Авторы заявляют также о возможности использования в схемах получения гипериммунных сывороток на лошадях еще 2 препаратов: субъединичной вакцины на основе белка GP эболавирусов Заир, Судан или Кот-д’Ивуар и препаратов на основе вирусоподобных частиц (ВПЧ), сформированных на основе белков GP и VP40 указанных эболавирусов. Гипериммунные сыворотки могут быть получены с использованием как субъединичных вакцин, так и ВПЧ, по схемам, описанным выше для ДНК-препаратов. Кроме этого, авторы заявляют о возможности использования комбинированных схем получения гипериммунных сывороток на лошадях с использованием всех 3 препаратов (ДНК-препараты, субъединичные вакцины и ВПЧ) как против каждого их эболавирусов (эболавирус Заир, Судан или Кот-д’Ивуар) так и против всех 3 видов эболавирусов вместе.
К недостаткам получения гипериммунной сыворотки способом-прототипом можно отнести сложность технологии получения гипериммунной сыворотки, т.к. в схеме вакцинации используется три ДНК-препарата или их смесь, что усложняет схему и увеличивает время иммунизации лошадей. Кроме того, для формирования у животного напряженного иммунного ответа, необходимо получить по 45 мг каждого ДНК-препарата, содержащего кодирующий GP-ген эболавируса, что приводит к увеличению затрат на производство гипериммунной сыворотки и, соответственно, лечебных иммуноглобулинов. По мнению заявителя, это связано с отсутствием коррекции гена GP для получения всех 3-х типов препаратов (ДНК-препарат, субъединичная вакцина и ВПЧ) в способе-прототипе. Известно, что экспрессия GP белка из клетки, в которой находится плазмида, существенно снижена по сравнению с экспрессией этого белка вирус-инфицированной клеткой. На повышение экспрессии GP белка эболавируса влияет замена 2-х аминокислот, находящихся непосредственно рядом с сайтом расщепления, в позициях D637A и Q638V. Особенностью получения ДНК-препарата и ВПЧ-препарата (используемых в предлагаемом заявителем способе иммунизации) является введение мутации D637L в сайте разрезания ТАСЕ-протеазы, что приводит к усилению отщепления GP с поверхности клеток [Escudero-Perez В., Volchkova V.A., Dolnik О. et al. Shed GP of Ebola virus triggers immune activation and increased vascular permeability // PLoS Pathog. 2014, 10(11):e1004509. doi: 10.1371/journal.ppat.l00450].
Техническим результатом предлагаемого изобретения является упрощение технологии получения гипериммунной сыворотки и сокращение затрат на ее получение.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения гипериммунной сыворотки, содержащей гетерологичные иммуноглобулины против лихорадки Эбола, включающем 4-кратную иммунизацию лошадей вирусными антигенными препаратами, не содержащими живой вирус Эбола, с последующим забором крови у животных- продуцентов и выделением гипериммунной сыворотки, согласно изобретения, в качестве вирусных антигенных препаратов используют ДНК-препарат, содержащий ген гликопротеина вируса Эбола, и ВПЧ-препарат, содержащий вирусоподобные частицы, включающие ген гликопротеина вируса Эбола, 3-кратное введение ДНК-препарата осуществляют внутримышечно по следующей схеме: 1-я иммунизация - введение ДНК-препарата в дозе 4 мг/животное на 0 сут, 2-я иммунизация - введение ДНК-препарата в дозе 4 мг/животное на 21-28 сут после 1-го введения препарата, 3-я иммунизация - введение ДНК-препарата в дозе 4 мг/животное на 21-28 сут после 2-го введения препарата, четвертую иммунизацию осуществляют подкожно введением ВПЧ-препарата в дозе 3×10 9 ВПЧ/животное на 56 сут после 3-го введения ДНК-препарата, позволяющие индуцировать у лощадей образование общих специфических антител в титрах не менее 1:75000 и образование нейтрализующих антител к вирусу Эбола в титрах не менее 1:640, а отбор крови для получения гипериммунной сыворотки, содержащей иммуноглобулины, проводят на 10-13-е сутки после иммунизации ВПЧ-препаратом. Общее время иммунизации (от 1-й иммунизации до забора крови) составляет 122 дня.
ДНК-препарат представляет собой ДНК-конструкцию phCMV-GP/D637L, содержащую ген гликопротеина вируса Эбола под контролем промотора цитомегаловируса, а вирусоподобные частицы ВПЧ-препарата получены из среды упаковочных клеток, трансфицированных репликоновой РНК вируса Кунджин, которая содержит ген гликопротеина вируса Эбола.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 приведена физическая и генетическая карта плазмиды phCMV-GP/D637L. На фиг. 2 представлен вектор SP6KUNrep5-GP, используемый для получения репликоновой РНК. На фиг. 3 дана схема получения вирусоподобных частиц. На фиг. 4 приведена схема иммунизации лошадей для получения гипериммунной сыворотки, содержащей иммуноглобулины против вируса Эбола.
Пример 1. Описание состава препаратов, используемых для иммунизации лошадей и получения гипериммунной сыворотки, содержащей гетерологичные иммуноглобулины против лихорадки Эбола
Для первых 3-х иммунизаций используется ДНК-конструкция - phCMV-GP/D637L (Escudero-Perez В et al., PLoS Pathog 2014 10, Reynard O. et al. // J.Infect. Dis. 2011, 204 Suppl 3:s 1060-5), содержащая GP-ген вируса Эбола. Эта ДНК содержит ген гликопротеина вируса Эбола под контролем промотора цитомегаловируса. Введенная мутация (D637L) в сайте разрезания ТАСЕ-протеазы (фиг. 1) приводит к усилению отщепления GP с поверхности клеток, уменьшая присутствие GP на поверхности клеток и тем самым уменьшая цитопатогенный эффект.
Для четвертой иммунизации используется ВПЧ-препарат (Reynard О. et al. // J.Infect. Dis. 2011, 204 Suppl 3:s1060-5; Pyankov O.V. et al. // J.Infect. Dis. 2015, 212 Suppl 2:s368-71) в дозе 3×10 9 ВПЧ/животное. ВПЧ получены из среды упаковочных клеток, трансфицированных репликоновой РНК вируса Куинджи, которая содержит ген гликопротеина (GP/D637L) вируса Эбола. Для получения репликоновой РНК использовали вектор SP6KUNrep5-GP, представленный схематично на фиг. 2 и содержащий следующие элементы: SP6 - промотор РНК полимеразы; 5'UTR, 3'UTR - нетранслируемые области вируса Кунджин; GP/D637L - ген гликопротеина вируса Эбола; Stop - стоп-кодон; IRES - внутренний сайт посадки рибосомы ЕМС вируса; KUN NSPs - неструктурные белки NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5 вируса Кунджин; С20 - первые 20 аминокислот белка сердцевины вируса Кунджин; Е22 - последние 22 аминокислоты Е белка вируса Кунджин; FMDV2A - 2А-автопротеаза вируса FMDV; HDVr - антигеномный рибозим вируса гепатита дельта; рА - сигнал полиаденилирования вируса SV40. Получение ВПЧ частиц проводили по схеме, представленной на фиг. 3.
Пример 2. Способ иммунизации лошадей для получения гипериммунной сыворотки, содержащей гетерологичные иммуноглобулины против лихорадки Эбола
Гипериммунную сыворотку получают после 3 циклов иммунизации животного ДНК-препаратом, содержащей ген, кодирующий гликопротеин (ГП, GP) вируса Эбола и однократной вакцинацией вирусоподобными частицами (ВПЧ), на основе вируса Кунджин, также содержащими ген, кодирующий гликопротеин вируса Эбола [1]. Схема иммунизации лошадей для получения препарата лечебных иммуноглобулинов приведена на фиг. 4.
Для первых 3-х иммунизаций используется ДНК-конструкция - phCMV-GP/D637L (Escudero-Perez В., Volchkova V.A., Dolnik О. et al. Shed GP of Ebola virus triggers immune activation and increased vascular permeability // PLoS Pathog. 2014, 10(11):e1004509. doi: 10.1371/journal.ppat.l004509), содержащая GP-ген вируса Эбола. Эта ДНК содержит ген гликопротеина вируса Эбола под контролем промотора цитомегаловируса. ДНК-препарат вводится внутримышечно в дозе 4 мг/лошадь. Для стимулирования иммунного ответа препарат вводится по следующей схеме: 1-я иммунизация - на 0 сут, 2-я иммунизация - на 21-28 сут после 1-го введения препарата, 3-я иммунизация - на 21-28 сут после 2-го введения препарата.
Через 56 сут после последнего, 3-го введения ДНК-препарата лошадям подкожно вводится ВПЧ-препарат [Reynard О. et al. // J.Infect. Dis. 2011, 204 Suppl 3:s1060-5; Pyankov O.V., Bodnev S.A., Pyankova O.G. et al. A Kunjin Replicon Virus-like Particle Vaccine Provides Protection Against Ebola Virus Infection in Nonhuman Primates // J. Infect. Dis. 2015, 212 Suppl 2:S368-71.] в дозе 3×10 9 ВПЧ/животное. Отбор крови у лошади в объеме 5-15 л проводится на 10-13-е сутки после введения ВПЧ-препарата (см. схему на фиг. 4). Из крови получают плазму или сыворотку, которая используется для получения лечебных иммуноглобулинов.
Пример 3. Изучение эффективности иммуноглобулинов, полученных заявляемым способом из гипериммунной сыворотки лошадей
Читайте также:
Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.
Copyright © Иммунитет и инфекции
