Геном вируса гриппа а птиц

doi: 10.18527/2500-2236-2017-4-1-10-20

Получена: 2017-10-18 Принята к печати: 2017-11-02 Опубликована: 2017-12-06

Р. Н. Гейдаров 1 , Н. Ф. Ломакина 2 , Е. Ю. Боравлева 2 , И.С. Холодилов 2 , А. С. Гамбарян 2# , В. М. Михайлович 1 , Е. Е. Фесенко 3

# Для корреспонденции: Александра Гамбарян: al.gambaryan@gmail.com

Среди изолятов от диких птиц идентифицированы вирусы гриппа субтипов H3N1, H3N6, H3N8, H4N6, H1N1, H5N3 и H11N9. Все они содержали последовательность ESEV на С-конце белка NS1, полноразмерную рамку считывания для белка PB1-F2. Замена N66S в PB1-F2 обнаружена у шести штаммов. Однако такие маркеры патогенности, как последовательность ESEV (лиганд PDZ-домена) в вирусном белке NS1 и замена N66S PB1-F2 в контексте генома вирусов гриппа диких уток, не делали вирус патогенным для мышей. Все изоляты были высокоурожайны в куриных эмбрионах, инфекционны и иммуногенны для мышей, но не вызывали у этих животных клинических симптомов заболевания.

Forty-two strains of avian influenza viruses were isolated from the wild waterfowl’s feces in the city of Moscow. These viruses as well as reference strains and some experimental reassortants were analyzed by microarrays. The used microarrays contained 176 probes to the different segments of influenza virus genome. The microarray allows to determine 1) the hemagglutinin and neuraminidase proteins subtype; 2) the primary structure of the C-terminal sequence of the viral NS1 protein, which serves as a ligand for the PDZ domain; 3) the presence of stop codons and substitution N66S in the reading frame of the viral protein PB1-F2; 4) the presence of the polybasic site for hemagglutinin cleavage. The viruses of H3N1, H3N6, H3N8, H4N6, H1N1, H5N3 and H11N9 subtypes were identified from the group of wild bird’s isolates. All isolates contained the ESEV sequence at the C-terminus of the NS1 protein and the full-length reading frame for the PB1-F2 protein. The replacement of N66S in PB1-F2 was found in six strains. However, the presence of ESEV sequence (ligand of PDZ domain) in the NS1 virus protein and the N66S substitution in PB1-F2 did not lead to the pathogenicity of these viruses for mice. All isolates demonstrated high yield growth in chicken embryos, were infectious and immunogenic for mice, but did not induce any clinical symptoms.

Низкопатогенные вирусы гриппа диких птиц (low pathogenic avian influenza viruses, LPAIV) расположены в основаниях эволюционных ветвей всех субтипов вирусов гриппа А. Они эволюционируют медленно и сохраняют ряд характерных признаков. К таким признакам относятся: консервативное строение рецепторсвязывающего участка в верхушечной части гемагглютинина (НА); строение сайта нарезания, который расщепляется только трипсиноподобными протеазами, секретируемыми в клетках респираторного и желудочно-кишечного тракта, что ограничивает распространение вируса в организме; низкий рН конформационного перехода молекулы НА, обеспечивающий ее высокую устойчивость к кислой среде пищеварительного тракта птиц.

Повышенная патогенность вируса – многофакторная характеристика, которая определяется множественными изменениями в различных генах вируса. Так, в молекуле HA высокопатогенных штаммов присутствует полиосновная последовательность в сайте нарезания [3]. В белке нейраминидазе (NA) появляется делеция в стеблевом участке [4]. Мутация E627K в белке PB2 способствует повышению активности вирусной полимеразы и улучшению репродукции вируса [5–7]. Замена N66S в рамке считывания PB1-F2 ускоряет ядерный транспорт [8–10]. В неструктурном белке NS1 появляются замены, приводящие к эффективному подавлению синтеза интерферона в хозяйской клетке [7, 11–13].

1) устойчивость к основным противогриппозным лекарственным средствам: препаратам группы адамантанов (амантадин, ремантадин) и ингибиторам NA (озельтамивир и его аналоги);

2) наличие и структуру участка связывания PDZ-домена в белке NS1: характерные для HPAIV последовательности ESEV, EPEV, ESKV и KSEV либо характерные для LPAIV – RSKV и RSEV;

3) наличие стоп-кодонов в позициях 12 и 58 и мутацию N66S в рамке считывания белка PB1-F2;

4) наличие в НА подтипов H5 и H7 полиосновного сайта протеолитического расщепления, характерного для HPAIV.

Вирусы

Вирусы из фекалий чаек и уток выделены в 2006–2014 гг. на берегу пруда в Тропаревском парке города Москвы и хранятся в коллекции Федерального научного центра исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М. П. Чумакова (Москва, Россия).

Реассортантный вирус VNH5N1-PR8/CDC-RG (VN‑PR) (H5N1) сконструирован в Центрах по контролю и профилактике заболеваний США (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA) и содержит гены, кодирующие белки НА и NA от вируса A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), а остальные – от штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8). Вирус любезно предоставлен д-ром R. Donis. В гене НА методом обратной генетики модифицирован участок, кодирующий полиосновный сайт нарезания. Холодоадаптированный вирус A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) (Len) любезно предоставлен проф. Л. Г. Руденко (Институт экспериментальной медицины, Санкт-Петербург, Россия). Вирус A/Hamburg/5/2009 любезно предоставлен д-ром М. Н. Матросовичем (Institute of Virology, Philipps University, Marburg, Germany), Вирус A/mallard/Sweden/91/2002 (H7N9) любезно предоставлен д-ром R. A. Fouchier (Department of Virology, Erasmus Medical Centre, Rotterdam, The Netherlands). Вирус А/duck/Buryatia/664/1988 (H3N1) получен из коллекции Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи (Москва, Россия). Полные названия и обозначения вирусов приведены в Табл. 1.

Вирус

Обозначение

Субтип

Номер в GenBank (ген)

PB1-F2 66 a

Линия NS1 б

A/Vietnam/1203/2004 ×A/Puerto Rico/8/34

VN-PR × Len (клон 3697)

VN-PR × Len (клон 4760)

Hamb × Len (клон 4885)

Hamb × Len (клон 4886)

Hamb × Len (клон 4888)

а Аминокислота в позиции 66 белка PB1-F2.
б Линия гена NS1 согласно [15].

Таблица 1. Исследованные вирусы

Выделение вирусов

Выделение вирусов проводили из свежих фекалий, которые суспендировали в двойном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) с добавлением антибиотиков: 0.4 мг/мл гентамицина, 0.1 мг/мл канамицина, 0.01 мг/мл нистатина и 2% раствора MycoKill AB (PAA Laboratories GmbH). Суспензию центрифугировали 10 мин при 4 000 об/мин и полученным супернатантом (200 мкл) заражали 10-дневные куриные эмбрионы (КЭ). Аллантоисную жидкость собирали через 48 ч и для дальнейшего пассирования отбирали пробы, положительные в реакции гемагглютинации (РГА).

Секвенирование

Анализ на микрочипе

Биочип представляет собой подложку с упорядоченно расположенными микроячейками, содержащими ковалентно иммобилизованные олигонуклеотидные зонды. На подложках закреплены пластиковые гибридизационные камеры вместимостью 30 мкл, куда вносят исследуемые флуоресцентно меченные фрагменты генома вирусов гриппа. При гибридизации флуоресцентно меченный ПЦР-продукт образует комплекс с комплементарным иммобилизованным зондом. Анализ результатов гибридизации проводили с помощью универсального аппаратно-программного комплекса ТУ 9443-004-02699501-2006 (Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта, Россия). Сигнал флуоресценции в каждой ячейке регистрировали камерой с ПЗС-матрицей и подвергали оцифровке.

Анализ патогенности вирусов для мышей

Мышам линии BALB/c весом 8–12 г вводили интраназально под легким эфирным наркозом по 50 мкл цельной или разведенной вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ). Проводили ежедневное наблюдение за состоянием подопытных особей и изменением их веса в сравнении с животными контрольной группы. На 14-е сутки после заражения отбирали кровь для определения уровня антител методом ИФА. Инфекционность вирусов определяли титрованием на КЭ и выражали в lg эмбриональных инфекционных доз (lg ЭИД₅₀).

Получение реассортантов

Для получения холодоадаптированных реассортантов с донором аттенуации Len 10-дневные КЭ заражали одновременно вирусами Len и донором поверхностных белков – по 7,0 lg ЭИД₅₀ каждого вируса. КЭ инкубировали 18 ч при 32°С, после чего проводили еще один пассаж длительностью 18 ч при 32°С. Аликвоту полученного вирусного урожая инкубировали в течение ночи с мышиной иммунной сывороткой против вируса Len; затем клонировали методом предельных разведений при 26°С и отбирали пробы, положительные в реакции торможения гемагглютинации с сывороткой против донора поверхностных белков и отрицательные с сывороткой к вирусу Len. После этого трижды клонировали вирус методом предельных разведений, выращивая в течение 96 ч при 26°С.

В качестве референсных штаммов использованы вирусы: A/duck/Buryatia/664/1988 (H3N1), A/duck/Primorie/3628/2002 (H9N2), A/mallard/Sweden/91/2002 (H7N9), штамм А/chicken/Kurgan/3654at/2005 (H5N1) [19], аттенуированный в лабораторных условиях, а также циркулировавшие в человеческой популяции вирусы гриппа подтипов H1N1, H2N2 и H1N1pdm. Основные характеристики и краткие обозначения исследованных вирусов приведены в Табл. 1.

В результате анализа определены субтипы HA и NA всех изолятов. Для вирусов, у которых гены, кодирующие белки HA и NA, были секвенированы ранее, результаты субтипирования на биочипе соответствовали результатам секвенирования.

Факторы патогенности в природных изолятах

Полиосновной сайт нарезания HA был идентифицирован в НА вируса ch/Ku (H5N1), что соответствует данным секвенирования (GenBank HQ724523.1).

Устойчивость к лекарственным препаратам адамантанового ряда, обусловленная заменами в белке М2, обнаружена только у вирусов гриппа человека: PR8 (A27 и N31) и Hamb (N31).

Во всех изолятах от диких птиц белок NS1 терминирован последовательностью ESEV, а в штаммах ch/Ku, PR8 и Len – последовательностями ESKV, RSEV и RSKV соответственно, что подтверждается данными секвенирования, опубликованными в GenBank.

Стоп-кодон в рамке считывания белка PB1-F2 обнаружен в вирусе Hamb, что также соответствует данным секвенирования. Все природные изоляты содержали полноразмерную рамку считывания белка PB1-F2. У восьми штаммов выявлена замена N66S в белке PB1-F2, которая считается фактором, повышающим патогенность вируса (Табл. 1). Для 15 штаммов, вошедших в исследование, была определена первичная структура гена PB1, и результаты секвенирования подтвердили данные анализа на биочипе.

Для выяснения вопроса, как влияет замена N66S в белке PB1-F2 на патогенность природных изолятов, мы исследовали близкородственные вирусы, отличающиеся по этой позиции, на вирулентность для мышей. На Рис. 1 приведены данные изменения веса мышей для вирусов гриппа подтипов H3N8 и H3N1. Динамика изменения веса мышей, зараженных утиными вирусами 2008–2014 гг. с N66 и S66 в белке PB1-F2, не отличалась достоверно от динамики контрольных мышей. Аналогичные результаты получены и для вирусов подтипов H4N6 и H6N2 (Табл. 2). Важно подчеркнуть, что у всех зараженных мышей наблюдался мощный вирусспецифический иммунный ответ, проявляющийся в высоких титрах антител (по данным ИФА). Это свидетельствовало о том, что заражение прошло успешно. Единственный утиный штамм вируса гриппа, который вызывал болезнь и гибель мышей, – изолят 1988 года d/664.

Академик РАМН О. КИСЕЛЕВ, директор НИИ гриппа РАМН (Санкт-Петербург).

В последнее время много говорят и пишут о птичьем гриппе. Опасный вирус кочует по планете. Сообщения о новых и новых очагах заболевания среди пернатых поступают то из Турции, то из Румынии, то с юга России… Даже далекие от медицинской науки люди перед угрозой пандемии гриппа стали интересоваться эпидемиологией, вирусологией и иммунологией.

Академик РАМН О. КИСЕЛЕВ, директор НИИ гриппа РАМН (Санкт-Петербург). - В последнее время вспышки гриппа среди птиц приобрели массовый характер. А случались ли подобные эпидемии раньше?

- Птицы стали переносчиками вирусов гриппа миллионы лет назад. Можно сказать, что они являются резервуаром всех вирусов гриппа подтипа А, существующих в природе. Вируса подтипа В у них нет. Птичий "резервуар" сложился генетически в результате эволюции.

Вирусы птичьего гриппа выделены еще в 30-е годы прошлого века, их эволюцию серьезно изучают специалисты по экологической вирусологии в нашей стране и за рубежом. Медикам известны генеалогия этих вирусов, их геном, свойства. Собраны большие коллекции непатогенных - неопасных для человека - птичьих вирусов. "Обычный" вирус птичьего гриппа не передается от птицы к человеку и от человека к человеку. Но время от времени "резервуар" выдает варианты, опасные для людей. Кстати, изучение происхождения вирусов гриппа животных и человека показало, что все они имеют один эволюционный источник - вирусы гриппа птиц.

- Что должно произойти с вирусом птичьего гриппа, чтобы он стал патогенным для человека? Каковы механизмы "перерождения" вируса птичьего гриппа в "человеческий"?

- Традиционная вирусная цепочка начинается с диких водоплавающих птиц. Установлено, что они являются носителями всех 16 подтипов вирусов гриппа А, а самых примитивных сочетаний поверхностных антигенов (гемагглютинина НА и нейраминидазы NA. - Прим. ред. ) у этих вирусов насчитывается до 254. Каждый год перелетные птицы генерируют различные вариации вируса гриппа А в своем организме. И это при температуре тела 42,5 о C. То есть вирус птичьего гриппа выживает в условиях, при которых человек уже находится в полуобморочном состоянии.

Останавливаясь в прудах со стоячей водой, перелетная птица привносит туда с фекалиями вирус, способный жить до 400 суток - естественно, при оптимальных температурах - от 10-12 до 30 о С. Вирус через воду передается водоплавающей домашней птице, а от нее - другим домашним пернатым. Наиболее чувствительны к инфекции индюки и куры. Далее вирус гриппа может перейти к свиньям, что уже несет угрозу человеку. Дело в том, что на поверхности мембраны клеток свиньи имеются два типа рецепторов, к которым способен прикрепляться вирус гриппа: один - птичий вариант, а другой - человеческий. Причем ровно половина на половину. Поэтому свинья может стать промежуточным хозяином как птичьего, так и человеческого вируса гриппа. Когда два вируса - человеческий и птичий - инфицируют одни и те же клетки, потомство этих вирусов наследует наборы РНК-сегментов обоих вирусов. И в результате их взаимопроникновения (реассортации) иногда рождается третья высокопатогенная особь вируса, способная преодолевать межвидовые барьеры и передаваться человеку и птице. Неслучайно, по статистике, число летальных исходов от гриппа велико, если человек заразился в сельской местности.

Кроме того, в самом вирусе гриппа птиц происходят постоянные мутации генов, определяющих так называемый диапазон хозяев. Это гены гемагглютинина (НА), которые управляют вхождением вируса в клетку хозяина, и внутренние гены вируса, непосредственно отвечающие за подавление иммунитета хозяина. В результате этих мутаций также может появиться вирус, опасный для человека.

- Почему практически все случаи заболевания людей птичьим гриппом зарегистрированы в Юго-Восточной Азии?

- В Юго-Восточной Азии высокая плотность населения сочетается с интенсивным животноводством и птицеводством. Это очень подходящие условия для изменчивости вирусов гриппа. В итоге вирус гриппа птиц начал преодолевать межвидовые барьеры - им стали болеть и животные и люди. Интересно, что в Среднеазиатском регионе, где происходит интенсивный обмен вирусами гриппа между дикими перелетными птицами и домашними животными, но в силу культурных и религиозных традиций отсутствует свиноводство, и вероятность зарождения пандемических вирусов намного ниже, чем, например, в Китае.

- Вирусы гриппа, вызвавшие пандемии ХХ века (в 1918, 1957, 1968 годах), имели птичье происхождение или все-таки человеческое?

- Все пандемические вирусы ХХ века в той или иной степени содержали сегменты РНК гриппа птиц. Можно сказать, что они имели "птичий след".

- За последние два года в мире зарегистрировано около 140 случаев инфицирования людей вирусом гриппа птиц H5N1, из них половина - с летальным исходом. Вирус птичьего гриппа H5N1 чисто птичий или уже частично человеческий?

- Это чисто птичий вирус, но он постоянно изменяется, все больше и больше адаптируясь к организму человека. И все-таки, я думаю, что этот вирус не вызовет пандемию гриппа среди людей. Чтобы стать пандемическим, он должен претерпеть серьезные изменения - реассортацию или дополнительные мутации. Ведь, как я уже говорил, во всех пандемических вирусах ХХ столетия были как птичьи, так и человеческие сегменты РНК.

- Довольно широко распространено мнение, что угроза птичьего гриппа - искусственно раздутая "страшилка", выгодная крупным транснациональным птицеводческим и фармацевтическим компаниям. Как вы можете это прокомментировать?

- Вирус H5N1 образца 2004-2005 годов действительно претерпел изменения и стал более опасным, чем раньше. Об этом свидетельствует столь большое количество погибшей домашней птицы. В результате увеличивается и риск заболевания людей. В 1997 году первую вспышку эпидемии среди птиц в Гонконге удалось локализовать благодаря тому, что было уничтожено все поголовье домашней птицы в стране. Теперь это сделать невозможно - вирус распространился по всей Азии. А уж одновременные вспышки птичьего гриппа в Японии, Китае, во Вьетнаме, в Таиланде, России, Казахстане исторически беспрецедентны. Существует опасение, что новый штамм вируса птичьего гриппа может поразить весь мир.

Пока вирус не передается от человека к человеку, но из-за эпидемии среди птиц такая передача становится все более вероятной. Необходима всего лишь "правильная" рекомбинация между штаммом H5N1 и вирусом гриппа человека. Это может произойти, если кто-либо из людей или животных заболеет человеческим и птичьим гриппом одновременно. Как только птичий вирус приобретет способность распространяться от человека к человеку, может начаться пандемия, поскольку в человеческой популяции иммунитет против птичьих вирусов низок или отсутствует вовсе. Результаты последних исследований свидетельствуют о том, что "испанка" 1918 года унесла более 40 млн жизней потому, что тот вирус гриппа эволюционировал из птичьего и содержал уникальные белки-антигены (HA и NA), к которым у человека не было иммунитета. Кроме того, достоверно установлено, что ряд внутренних белков вируса "испанки", тоже птичьего происхождения, имели выдающуюся способность к подавлению иммунитета человека.

Вирус птичьего гриппа может сохраняться в течение многих лет при температуре ниже _70 о С. Следовательно, повышается опасность сохранения вируса в охлажденном и замороженном мясе домашней птицы. Но, к счастью, в прожаренном курином мясе или после варки инфекционного вируса быть не может. Интересно, что вирус категорически не выдерживает и процедуры последовательного замораживания и оттаивания.

То, что случилось осенью 2005 года в российских регионах, когда падеж птичьего поголовья приобрел характер эпидемии, заставило наших ученых забить тревогу. Так что угроза всплеска заболеваемости птичьим гриппом среди людей - реальность, а не придуманная кем-то страшилка.

- Если вирус H5N1, скорее всего, не станет пандемическим, то почему все вакцины от птичьего гриппа сейчас создаются на его основе?

- Все страны обязаны иметь эту вакцину как резервную, на случай массового распространения именно этой разновидности птичьего гриппа. А когда появится новый вирус, тогда будет и новая вакцина. В гриппозной проблеме так бывает всегда. Каждый год мы анализируем ситуацию и предлагаем новые композиции вакцин. Смена вакцинных штаммов происходит в среднем через два-три года. Может быть, через один-два года появится новый кандидат на основе другого штамма вируса птичьего гриппа.

- В НИИ гриппа разработана новая вакцина от птичьего гриппа. Расскажите о ней .

- На самом деле вакцина разработана в рамках Всемирной организации здравоохранения. Сегодня быстро решить проблему создания вакцины, не сотрудничая с зарубежными учеными, без здоровой корпоративности невозможно. Основной базовый штамм H5N1 получен из Национального института биологических стандартов и контроля Джона Вуда в Лондоне. Эта работа была опубликована в "Nature" в середине прошлого года. Прошлым летом мы изучали вирус как кандидата в вакцинные штаммы. И в августе на совещании у главного санитарного врача России пришли к выводу, что необходимо готовить вакцину на основе этого штамма и сдавать ее в производство. Аналогичные вакцины создаются и в других странах. Так, американцы уже запустили вакцину от птичьего гриппа в производство. Сейчас они готовят к производству новую вакцину из индонезийского изолята. А в России по вине производителей сроки выпуска вакцины от птичьего гриппа до сих пор не определены.

- А почему нельзя сконструировать универсальную вакцину против всех возможных сочетаний антигенов вируса гриппа?

- В мире уже есть несколько проектов универсальной вакцины против гриппа. По сложности такой проект сопоставим если не с полетом на Марс, то с чем-то близким к этому. И наш институт тоже работает над данной проблемой, причем практически без всякого финансирования. Думаю, при наличии денег сделать такую базисную вакцину мы в состоянии.

- Теоретически возможно ли сделать организм человека неуязвимым для вирусов гриппа?

- Защитить организм человека от вируса гриппа вполне возможно на генетическом уровне. Но всем известно, что генетические манипуляции любого толка на геноме человека категорически запрещены. А применительно к птицам и животным вероятность такого подхода существует. Так, например, американские генетики предлагают внедрить в ДНК птицы гены, кодирующие белковые структуры, нейтрализующие антигенные молекулы вируса гриппа (так называемые антисмысловые структуры). При наличии таких белков вирус птичьего гриппа не сможет прикрепиться к клеткам хозяина. Как генетик по базовому образованию, могу сказать, что вполне вероятно, человечеству придется пойти по пути генетической модификации, обеспечивая безопасность сельскохозяйственных и диких животных.

- Как можно обезопасить себя от гриппа, включая птичий, без вакцинопрофилактики?

Для профилактики и лечения гриппа, в том числе птичьего происхождения, НИИ гриппа рекомендует отечественные препараты, входящие в состав набора: "Интерферон гамма человеческий рекомбинантный" ("Ингарон") и "Интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный" ("Альфарона"). Лекарство просто закапывают в нос. Набор можно приобрести в аптеке без рецепта. Особо хочется подчеркнуть, что эти препараты, созданные учеными Москвы совместно с санкт-петербургским НИИ гриппа РАМН, проявляют высокую терапевтическую активность и на модели птичьего гриппа. Только своевременно начатая профилактика гриппа может предотвратить развитие тяжелого течения заболевания с непрогнозируемым исходом.

- Насколько вероятна смерть человека, если он все же заболеет птичьим гриппом?

- Несмотря на опасность вируса, летальный исход от любой гриппозной инфекции - чрезвычайное событие. В первую очередь следует вовремя обращаться к врачу и правильно лечить инфекцию. Вероятность смерти от птичьего гриппа в значительной степени зависит от здоровья пациента и от организации системы здравоохранения в стране. По мнению специалистов НИИ гриппа, смерть от гриппа в наше время - чрезвычайное событие.

- Будут ли вакцинировать от птичьего гриппа домашних птиц?

- Всероссийский институт ветеринарного птицеводства в Санкт-Петербурге разработал, успешно испытал и в настоящее время передал Россельхознадзору для промышленного производства высокоэффективную вакцину для птиц против патогенного вируса гриппа H5N1. Исследования проводились совместно с НИИ гриппа, причем весь проект осуществили исключительно на энтузиазме без финансирования из госбюджета. Эта вакцина пока только ожидает регистрации.

- У птиц - множество болезней. Как определить, что куры или утки погибают именно от гриппа?

- Действительно, у птиц и без гриппа много опасных болезней. Для диагностики гриппа у птиц ВОЗ рекомендует методы иммунофлуоресценции и ПЦР. В нашей стране птичий грипп диагностируют с помощью иммунологических тестов и определения патогенности на цыплятах. Но эти методы анализа занимают до двух недель, кроме того, у них низкая чувствительность и специфичность. Сейчас наши сотрудники с коллегами из Института биоорганической химии имени М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН в Москве разрабатывают чип для экспресс-диагностики птичьего гриппа у птиц. Московские коллеги синтезировали рецепторы птичьего и человеческого вируса, а у нас, в НИИ гриппа в Санкт-Петербурге, специалисты создают сам биочип, который имеет вид небольшой пластинки, напоминающей кредитную карту, с вмонтированными рецепторами обоих видов вируса. С помощью такого устройства любой ветеринар в райцентре, имея под рукой биоматериал погибшей птицы, сможет понять, птичий ли вирус гриппа поразил пернатую или это другая инфекция. Быстрая диагностика крайне необходима - болезнь коварна и быстротечна.

- Есть ли какие-нибудь данные о видовом составе птиц - переносчиков птичьего гриппа? Можно ли заразиться от птиц во время весенней охоты?

- Среди диких перелетных водоплавающих птиц переносчиками вирусов гриппа являются дикие утки и гуси, крачки и ржанки. Но в основном вирусы птичьего гриппа были выделены от диких уток и гусей. Дупели, бекасы, вальдшнепы не болеют. Глухари, тетерева, рябчики - тоже. Думаю, вероятность заражения от птиц средней полосы России небольшая. Большинство птиц к переносчикам вируса гриппа не относится, поэтому опасаться и тем более уничтожать их не следует.

- Почему нет сообщений о птичьем гриппе в США?

- На птицефермах США было несколько вспышек птичьего гриппа. Однако в этой стране основными производителями мяса птиц выступают небольшие фабрики с тридцатью - пятьюдесятью тысячами голов. У нас же птицекомплексы - это миллионное поголовье птиц. Если на ферме в США, например, погибают десять-двадцать тысяч особей, такое хозяйство изолируется, принимаются профилактические меры, владельцам выплачивается страховка. И нет никакой национальной трагедии, и резонанс в обществе минимален. При масштабах российских птицефабрик уровень банкротства, который они терпят, чудовищен. Такое из ряда вон выходящее событие, естественно, не оставят без внимания ни органы санитарного надзора, ни пресса.

- Поговаривают, что птичий грипп - это новейшее биологическое оружие США, направленqное против России, Китая и Азиатского региона. Что вы об этом думаете?

- Когда был открыт вирус иммунодефицита человека, газета "Правда" опубликовала довольно большую статью о том, что ВИЧ синтезирован в лабораториях Пентагона. Со всей ответственностью заявляю: человечество еще не доросло до того, чтобы создавать такие "генетические машины". Усилить патогенные свойства вируса, сохранить их и сделать из готового вируса бактериологическое оружие - да, можно. Но подобрать разносчика вируса, например утку, ученые пока не могут: приживется вирус в ней или нет - это от лукавого.

На самом деле, вопрос правильный. В будущем могут найтись "умники", которые серьезно займутся такого рода "работой". Но пока, я уверен, это исключено полностью. Кстати, ученых трудно обмануть: если и появится что-нибудь искусственное, то специалисты, имея четкие представления об эволюционном развитии вирусов, распознают рукотворную инфекцию сразу.

Т.В. Гребенникова, Д.Е. Киреев, А.Д. Забережный, Т.И. Алипер

Грипп А – контагиозное вирусное заболевание, которое вызывает сезонные эпидемии, пандемии и эпизоотии с различным уровнем смертности в зависимости от вирулентности вирусных штаммов, вызвавших эпидемию (1).

Вирус гриппа А широко распространен в природе, инфицирует многие виды млекопитающих и птиц, в основном водного и околоводного комплекса. От диких птиц выделены вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков, при этом инфекция у диких птиц протекает в виде энтерита, без видимых признаков заболевания (3, 4). Это указывает на высокую степень адаптации вирусов гриппа А к диким птицам, которые являются естественными хозяевами вирусов гриппа. Вирус сохраняется в воде в течение длительного времени (6-8 месяцев), а водно-фекальный путь инфицирования является основным механизмом поддержания персистенции вируса гриппа в природе, откуда вирус проникает в популяции домашних животных.

Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Известно 16 антигенных подтипов НА (Н1-Н16) и 9 подтипов NA (N1-N9). Вирус гриппа обладает сегментированным геномом, состоящим из 8 сегментов, которые обладают высокой способностью к реассортации. Различные комбинации НА и NА способны привести к появлению высоковирулентных вирусов, вызывающих высокий процент смертности.

В 20 веке отмечены четыре пандемии: 1918 (H1N1), 1957 (H2N2), 1968 (H3N2) и 1977 (H1N1), причем две (1957 и 1968 гг.) были обусловлены новыми реассортантными вирусами, которые появились в результате реассортации генов вирусов гриппа птиц и человека. Свиньи могут служить промежуточным хозяином, обеспечивающим появление новых вирусов путем адаптации птичьих вирусов и/или реассортации между птичьими и человеческими вирусами (2). В результате этих процессов вирусы птиц смогут репродуцироваться в организме человека, а вирусы человека – в организме птиц. Существует гипотеза, что печально знаменитая "испанка" была вызвана вирусом гриппа свиней А H1N1 (5). За последние 45 лет описано свыше 30 эпизоотий среди домашних животных в ряде случаев сопровождающихся заболеванием людей, подчас с высокой смертностью.

Начиная с 1996 г. и до настоящего времени были отмечены случаи заражения человека подтипами H5 and H7 (3, 4). Наблюдается распространение гриппа птиц, вызванного вирусом H5N1, в странах Азии. С середины декабря 2003 года вспышки этого заболевания были подтверждены в Южной Корее, Вьетнаме, Лаосе, Таиланде, Японии, Камбодже, Филиппинах, Малайзии и Китае (7). При этом отмечался высокий уровень смертности среди людей, до 50% в случае заражения человека подтипом Н5. С января 2004 года во Вьетнаме и Тайланде зарегистрированы случаи с летальностью более 70%. В 2005 г. были зарегистрированы эпизоотии на территории Российской Федерации, вызванные вирусом гриппа H5N1. Считается, что подтипы Н5 и Н7 вируса гриппа А являются наиболее опасными с точки зрения возникновения пандемий.

Угроза возникновения новой пандемии, предупреждение заноса и распространения высоко патогенных вирусов гриппа на территории нашей страны требует проведения мониторинга среди людей, домашних и диких животных с использованием современных средств диагностики. Диагностика гриппа осуществляется вирусологическими, иммунологическими методами и молекулярными методами. Молекулярные методы диагностики являются чувствительными и специфичными для определения вируса гриппа А. Кроме того, сравнительно в короткий срок, можно получить информацию о возбудителе без предварительного культивирования. Молекулярные методы рекомендованы Всемирной Организации Здравоохранения и Международным Эпизоотическим Бюро как лабораторные тесты для определения вируса гриппа в биологических образцах и постановки диагноза (8, 9 ).

В НПО НАРВАК и лаборатории молекулярной диагностики института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН разработан комплекс молекулярных методов для индикации и идентификации вируса гриппа А, а также дифференцирования его подтипов. Разработки основаны на современных молекулярных методах и подходах и мегут с успехом использоваться ветеринарными специалистами.

Тест-система для определения РНК вируса гриппа А методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Разработана тест-система для определения РНК вируса гриппа А методом ПЦР. Тест-система является универсальной для млекопитающих и птиц и позволяет определять РНК вируса гриппа А в различных биологических образцах (сыворотках крови, клоакальных смывах и органах) методом ПЦР. С использованием данной тест-системы можно определять РНК, а следовательно наличие вируса гриппа А 16 подтипов. Праймеры, разработанные для тест-системы, специфичны к гену белка нуклеокапсида вируса гриппа А всех известных подтипов и проверены с использованием компьютерных программ "Amplify 1.0", "Oligo 4.0". C использованием программы "ВioEdit" и BLASTN 2.2.3, на 300-400 вирусных геномах каждого подтипа было показано, что праймеры являются универсальными. Тест-система способна выявлять возбудитель гриппа А даже в случае множественных мутаций и реассортации генетического материала.

Тест-система может быть использована для скрининга биологических образцов у млекопитающих и птиц, которые предположительно могут являться носителями вируса гриппа А.

Тест-система для определения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Тест-система определения РНК двух подтипов вируса гриппа А – Н5 и Н7 в биологических образцах. Следовательно, тест-система позволяет не только определять два данных подтипа, но и дифференцировать их от других подтипов вируса гриппа А. Праймеры подобраны к различным участкам гена гемагглютинина и проверены с использованием компьютерных программ "Amplify 1.0", "Oligo 4.0". C использованием программы "ВioEdit" и BLASTN 2.2.3, на 300-400 вирусных геномах для каждого подтипа вируса гриппа А было показано, что даже в случае антигенного дрейфа внутри подтипа Н5 и Н7, или в случае штаммов с множественными мутациями, праймеры работают специфично. Тест-система способна выявлять возбудитель гриппа А подтипов Н5 и Н7 даже в случае множественных мутаций и реассортации генетического материала.

Тест-система для определения РНК вируса гриппа А подтипа Н5 методом ПЦР в реальном времени

Разработана тест-система ПЦР в реальном времени для определения РНК подтипа Н5 вируса гриппа А, а , следовательно наличие вируса гриппа А подтипа Н5. ПЦР в реальном времени является самой современной модификацией ПЦР. Это чувствительный, быстрый и более технологичный метод, который может быть использован для массового анализа образцов от млекопитающих и птиц на наличие РНК разных подтипов вируса гриппа А. Тест-система с успехом апробировалась при скрининге полевого материала, что позволяет рекомендовать ее для массового изучения образцов, полученных от животных и человека. Данный анализ был адаптирован к отечественным реагентам, что существенно для проведения массовых исследований.

С использованием разработанных тест-систем в 2005 г. было проведено исследование более 400 образцов клоакальных смывов, полученных от диких птиц Приморского края. Кроме того, тест-система была проверена на 350 образцах, полученных от диких птиц из Астрахани. Были проверены 150 проб от диких птиц в районе озера Чаны. Были также проверены 78 образцов, полученные из Новосибирской области во время эпизоотии. Исследовали образцы из Астрахани, Кургана, Калмыкии, Китайской Народной Республики, Сибири и других областей. Всего исследовано около 4000 образцов. Описанные тест-системы успешно прошли Государственные контрольные испытания и имеют сертификационные документы.

Разработка технологии микрочипов для диагностики гриппа.

Одной из современных технологий является создание микрочипов (биочипов), основанных на гибридизации нуклеиновых кислот. Данная технология разработана совместно НПО НАРВАК, НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, НИИ молекулярной биологии им. Энгельгарда РАН для определения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н1-Н15, N1-N2 (6). Микрочип позволяет в короткое время (несколько часов) не только определить наличие вируса гриппа А, но и дифференцировать подтипы вируса гриппа. Технологически, анализ происходить следующим образом: с использованием разработанных универсальных праймеров, специфичных гену гемагглютинина вируса гриппа А, и гену нейраминидазы, получают амплификаты методом ПЦР с использованием РНК, выделенной из биологических образцов. После этого, проводится гибридизации на микрочипе, который содержит набор зондов, специфичных к каждому из подтипов и меченых флюоресцентным красителем. Если гибридизации не произошло, цвет нанесенного зонда не меняется. Если гибридизация произошла – изменяется цвет зонда. Считывание и документирование происходит с использованием специального прибора, который сравнивает каждый зонд с положительным и отрицательным контролем.

По затратам средств и времени один микрочип эквивалентен 17 реакциям (ПЦР). В результате применения микрочипа для анализа образцов из Новосибирской области в 2005 г. сразу было установлено, что это H5N1. Разработанные микрочипы проходят лабораторные испытания. Внедрение нового метода требует дополнительных испытаний, комиссионных испытаний и получения сертификационных документов.

Анализ первичной структуры генома вирусов гриппа (секвенирование)

Вирус гриппа генетически чрезвычайно изменчив и этим опасен. Изменения свойств вируса могут происходить как из-за изменения генов (мутации), так и в ходе обмена генами (реассортация). Поэтому всегда есть угроза появления опасных гибридов: в 1918 г. это был Н1N1, а сегодня это может быть Н5N1. Для лучшего понимания и прогнозирования ситуации, для изучения происхождения и эволюции штаммов вируса гриппа применяют метод секвенирования. Сегодня секвенирование фрагментов вирусного генома является уже обязательным требованием при возникновении новых или спорных вирусных вариантов. Для вируса гриппа установлено, что его патогенность связана с последовательностью аминокислотных остатков в т.н. "сайте протеолитического разрезания" гемагглютинина. Поэтому сегодня этот сайт всегда определяют у выделяемых вирусов гриппа. Раньше у птиц на территории России находили вирус подтипа Н5 с "сайтом протеолитического разрезания" как у низко патогенных штаммов. Сегодняшний вирус Н5N1 имеет "сайт протеолитического разрезания" такой же как у высоко патогенных штаммов и поэтому высоко патогенный для птиц.

Грипп остается непредсказуемой инфекцией в настоящее время. Мир может оказаться беззащитным перед новым высоко патогенным пандемическим вариантом, вероятность возникновения которого довольно велика. Поэтому только постоянный мониторинг с использованием современных средств диагностики позволит своевременно выявить, локализовать и обезвредить очаги инфекции.

В отделе молекулярной биологии НПО НАРВАК и в лаборатории молекулярной диагностики Института вирусологии им. Д. И. Ивановского постоянно проводятся молекулярные исследования вируса гриппа с использованием самых современных методик. Данные исследования могут существенно помочь практическим ветеринарным специалистам. Разработаны две тест-системы на основе ПЦР для определения РНК вируса гриппа А и дифференцирования двух подтипов Н5 и Н7 и тест-система для определения РНК вируса гриппа А подтипа Н5 методом ПЦР в реальном времени. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания в 2005 г., имеют все сертификационные документы и могут быть использованы в региональных ветлабораториях.

1. ЛьвовД.К. Жданов В. М. // Вопр. Вирусол. – 1982. –N 4. – С. 17-20

2. Brown, I. H., Harris P.A., McCauley J.W, Alexander D.J. .// J. Gen. Virol. – 1998. - Vol. 79. - Р. 2947–2955.

3. Capua I, Alexander DJ. // Acta Trop. - 2002 –Vol. 83. N° 1. – P. 1-6. Review.

4. Capua I, Mutinelli F, Pozza MD, Donatelli I, Puzelli S, Cancellotti FM . // Acta Trop. - 2002. – Vol. 83. - N 1. – P.7-11.

5. Fanning T.G., Slemons R.D., Red A.H., Janczewski T.A., Dean J., Taubenberg J.K. 1917 // Journal of Virology. – 2002. - Vol. 76. - No 15. - P. 7860-7862.

6. Fesenko Е. Е, D.Kireev, D.A. Gryadunov, D.A.Khodakov, A.I. Myznikova, V.M. Mikhailovich, T.V.Grebennikova, A.S. Zasedatelev.// Международный конгресс "Современные проблемы генетики". –Минск. – 2005

7. Li, Wang J. Smith G. J. D. // Nature. - 2004. – Vol. 430. - P. 209-213.

9. Recommended laboratory tests to identify avian influenza A virus in specimens from humans • WHO Geneva • June 2005.