Физико химические свойства вирусов

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Власов, Николай Анатольевич. Физико-химические свойства и антигенная структура вируса геморрагической болезни кроликов : диссертация . доктора биологических наук : 03.00.06.- Покров, 1998.- 347 с.: ил. РГБ ОД, 71 99-3/41-7

Введение к работе

. 1. Актуальность темы

В 1984 году в Китае была обнаружена новая болезнь кроликов, которая по своим арактерисгикам может быть отнесена к категории особо опасных инфекциотгых болез-:ей, т.е. к болезням того типа, которые, если не применят!, эффективные метода борьбы с ими, могут вызвать тотальное уничтожение поголовья чувствительных животных.

Впервые болезнь выявил и описал Liu с коллегами в 1984 году, когда она возникла реди импортировагагых из Германии ангорских кроликов. В последующие годы вспышки іолезіш с подобными клиническими признаками и патоморфологисй были описаны в ряде трап Европы и Северной Америки. Эта болезнь давала огромные потери во всех странах, де она имела место. В нашей стране первая вспышка болезім была зарегистрирована в 986 году в пограничном с Китаем районе Хабаровского края. Диагноз поставлен не был, роликов из заболевшего стада убили, а шкурки отправили на фетровую фабрику Московкой области. В результате этого в центре страны возник вторичішй очаг болезни. Из него іолезіш распространилась к 1987 году по 20 областям и краям России, а затем практически ся территория СССР стала неблагополучной.

Даже в начале изучения болезни и характеристик ее возбудителя данные, ка-аюпщеся клинических признаков, иатоморфологии и других деталей болезни, как и дан-ше по ультраструктуре внеклеточных- вирионов, не имели какігх-либо серьезных противо-іечий. Это приводит к заключению о том, что во всех странах, упомянутых выше, болезнь мзывалась одним и тем же вирусом. В противоположность этому, дагапле, касающиеся іиохимии вируса, первоначально были очень противоречивы. Так, Deng с коллегами оста-ювились на выводе, что этиологический агент этой болезни принадлежит к калицивиру-ам. С другой стороны, немецкие ученые Gregg & House заключили, что он является пар-ювирусом.

В связи с возникновением нового патогена стало необходимым проведеіше его ком-глексного изучения клиническими, патологоанатомическими, вирусологическими, имму-юхимическими, биохимическими и другими методами. Необходимо было изучить патоге-іез и иммуногенез болезни, установить физико-химические характеристики и биохимиче-кий состав вируса, решить ряд других вопросов, в том числе о таксономическом положе-ши и происхождении вируса. Этим обусловлен выбор цели работы.

\.2. Цель и задачи исследований

Целью работы было изучить физико-химические, антигенные свойства и морфоло-ию вируса ГБК, патогенез вызываемой им болезни. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи.

.. Определить константу седиментации, плавучую плотность, нолипептидньгй состав, массу вирионов. !. Изучить чувствительность вируса к физическим и химическим воздействии!. !. Изучить гемагглютинирутощую активності, вируса. \. Изучить ультраструктуру вирионов и степень гетерогенное вирусных популяций по

этому параметру, их физико-химический полиморфизм. >. Изучить полипептидш.ш состав вирионов, ангигешюсть структурных белков. ). Изучить параметры репродукции вируса в зараженных клетках и вирусное цитонатиче-

_2 Общая характеристика работы

скос действие (ЦПД).

Изучить клиническую и патологоанатомическую картину болезни, основные патогенетические факторы и возможности модификации течения болезни с использованием химиотерапевтических препаратов и других лекарственных средств.

Выявить и охарактеризовать вирусный протективный антиген, обладающие про-тективным потенциалом эффекторы иммунитета, действующие при этой болезни.

Изучить шггигенную структуру вирусного протсктивного антигена и па этой основе разработать улучшенные диагностические тест-системы на основе моноклональ-ных антител.

13. Научная новизна работы

Научная новизна работы заключается в получении следующего ряда новых (выделены курсивом) или уточненных в приложении к изучавшемуся штамму В-87 данных о вирусе ГБК, его циркуляции среди животных и вызываемым им патологическом процессе, иммунологическом ответе на данный патоген.

Изучены физико-химические свойства вируса. Определены констаїгга седиментации, плавучая плотность вирионов, стоксов радиус вириона, параметры растворимости в растворах солей и полимеров.

Изучена устойчивость к денатурирующим агентам и физическим факторам. Нативные вирионы не чувствительны к действию растворителей липидов, жесткой протеолитической обработке, стабильно сохраняют инфекционность и ге-магглютижрующую активность в диапазоне рН от 3 до 9. Вирус ГБК обладает высокой термостабильностыо <сохраняет инфекционность, гемагглютинирующую активность, форму вириона и его полипептидный состав в ходе инкубации при5бС в течение не менее чем 30 минут), термостабильиость возрастает в средах, обогащенных белками и полисахаридами, и падает в средах, обогащенных одновалентными ионами. При прогревании до 5б"С и выше происходит изменение конфор-мации поверхностного белка вирионов, в результате чего он становится чувствителен к трипсиновому протеолизу. Вирус ГБК чувствителен к щелочам и хлорсо-держащим дезинфектантам, новому дезипфектанту для ветеринарных целей - Тео-тропипу. Вирус в процессе длительного храпения при низких температурах в жидкой среде или лиофильно высушенном состоянии может утратить гемагглютинирующую активность, сохранив при этом инфекционность.

Общая характеристика работы

сапсамеров - частица диаметром около 20 им с характерными выростами па поверхности, но без сердцевины.

Изучены параметры репродукции вируса в различных органах и тканях зара-кенных животных. Вирус репродуцируется в клетках печени, легких, тимуса, головного лозга и проникает в клетки многих других органов. При репродукции в клетках этих че-пырех органов вирус образует цитоплазматические скопления, в том числе - паракри-таишческие, и не обнаруживается в клеточных ядрах. Максимальный выход вирионов ш одну зараженную кістку составляет более 10 000. Вирус не имеет иеспецифического іеханизма экзоцитоза и покидает клетки после их распада. Наиболее высокие абсолютное уровни накопления вируса отмечают и печеш и легких, причем раннее и относитель-\о высокое накопление вируса в этих органах имеет место у животных, гибнущих в ранте сроки после заражения.

Изучен полипептидный состав и аитигепность белков вирионов, которые ключают 5 полипептидов с молекулярными массами 60, 54, 42, 37, 16 кДа, в том числе -існовной капсиднмй белок Vp60, на долю которого в составе вирионов приходится более '0% по массе.

Показано, что эти полипептиды взаимодействуют с антителами из сывороток рекон-іалесцентньїх кроликов. Установлено, что основным протективпым антигеном вируса вляется УрбО, иммунизация которым (даже в денатурированном виде) индуцирует Ьормирование невосприимчивости к болезни. Формирование иммунитета низкой папря-кенности также вызывает Vp37. Установлено, что в составе УрбО имеется минимум 3 нтигенных района, а его антигенная структура стабильна у изолятов, циркулирующих природе и при длительном пассировании таких изолятов в лабораторных условиях, ^становлено, что в формировании иммунитета к вирусу ГБК играют роль как антитело-ависимые, так и антителонезависимые механизмы, которым принадлежит основная юль в защите от инфекірш в поздние сроки после вакцтшции.

'А. Практическая значимость результатов

В практике проведеіп/ія НИР могут быть использованы разработанные или адапти-
юванные в отношении вируса ГБК методические приемы: экстракция вируса из заражен
их тканей с использованием трипсинового протсолиза, очистка вируса, вирусных поли-
[ептидов. ^^^^^^^^^^^^^

4 Общая характеристика работы

В ходе работы охарактеризован по физико-химическим свойствам, антигенно-сти и ряду других параметров штамм В-87 вируса ГБК, принятый реферснс-ипвммом данного вируса для России (авторское свидетельство на изобретите № 294945 с приоритетом от 09.03.88 ).

Получен и охарактеризован клон гибридных клеток, продуцирующих монокло-пальпые антитела к Vp60 вируса ГБК (линия клеток депонирована и запатентована, патент № 2007452 с приоритетом от 16.01.92. ).

На основе этих моноклональных антител разработаны и испытаны усовершенствованные диагностические наборы для вьіявлеїшя вирусішх антигенов и противовирусных антител (составлены методические указания по диагностике вирусной геморрагической болезіш кроликов иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител, утвержденные 30.10.1992 г.).

Разработан новый химиотерапевтический препарат для профилактики и лечения бактериозов и бактериальных осложнений после вирусных заболеваний Абактан (комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВГНКИ, проводится патентование); бактериозов и болезней, вызываемых РИК-содержащими вирусами Лбактап Р (положительное решите о выдаче патента № 97104338/13 с приоритетом от 20.03.97, комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВГНКИ); новый химиотерапевтический препарат для лечения бактериозов и болезней, вызываемых ДНК - содержащими вирусами, Абактан Д (положительное рсшеїше о выдаче патента на изобретите № 97104650/13 (004921) от 19.01.1998 г. с приоритетом от 25.03.1997 г., комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВГНКИ), новый дезипфектапт для ветеринарии Теотрогшн (комплект НТД рассмотрен и одобрен на Ветфармбиосовете ВГНКИ, производится патентование), а так же методы их примснеїшя для ветеринарных целей.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

Результаты изучения патогенеза ВГБК, показавпше, что основным мехашз-мом патогенеза острой формы болезіш является следующий. Репродукция вируса в клетках вызываег выброс в кровоток прокоагулшггов. Это приводит к повышению фибринолитической активности сыворотки, что является причиной фибринолиза микрослоя фибрина їй стенках кровеносных сосудов. Фибринолиз приводит к увеличению проницаемости сосудистой стенки, выражающейся в образовании кровоизлия-ішй различшлх типов в ряде органов и тканей. Непосредственной причиной смерти при острой форме болезіш являются субдуральпые кровоизлияния в стволовой части головного мозга. Терапевтические воздействия, предотвращающие образование тромбоза при ВГБК, противодействуют развитию геморрагии, что приводит к добро-качетвешому течеїшю инфекциошюго процесса.

Основным протективным антигеном вируса ГБК является Vp60 - мажорный капсидиый белок вириона, имеющий в своем составе не менее 3 аіггигеншлх регионов. Структура данного полипептида стабильна, имеющиеся вирусные изоляты антигенно не различимы. Система иммунологической защиты при ГБК включает антите-лозависимые и антителонсзависимые иммунологические механизмы. Последние играют основную роль в отдалешпле сроки после иммунизации.

Вирус ГБК обладает структурным полиморфизмом, заключающимся в суще-

Общая характеристика работы

;твовашти нескольких форм вириопов, различающихся между собой содержанием нуклеиновой кислоты, размером частиц. Наличие различных форм вириопов отражается в полиморфизме вирусной популяции но физико-химическим свойствам -плавучей плотности, сонстанте седиментации. Формирование вириопов той или иной структуры зависит от :войств организма животного, в котором происходит их репродукция, и некоторых пара-миров инфекционного процесса. На морфологическом уровне это выражается в возможности формирования вирусных популяїшй, основная часта которых представлена вирио-іами, не содержащими нуклеиновой кислоты или содержащими ее в меньшем, чем в стандартных вирионах, количестве.

1.6. Апробация результатов

Материалы исследований были заслушаны и обсуждены на трех тучных конференциях (г. Покров 1988,1990, 1992 it.) и заседаниях Ученого совета ВНИИВВиМ (1988-1995 г.), международной конфсреіщии (г. Харьков 1995 г.), международной конференции 'г. Москва, 1998 г.), лабораторном совещании научных сотрудников (г. Покров 1998 г.), межлабораторной апробации диссертации (г. Покров 1998 г.).

7.7. Публикация результатов исследований

По результатам экспериментальных работ, выполненных по теме диссертации, имеется 19 публикаций, в том числе авторское свидетельство, патент, три положительных решения о выдаче патеїггов, обзорный доклад.

1.8. Внедрение результатов исследований

Охарактеризовашшш штамм вируса ГБК В-87 используется в качестве рефереис -итамма и производственного штамма при изготовлении вакцин и диагностических препаратов. Внедрены в ветеринарную практику Наборы для диагностики ГБК с применившем ионоклональных антител, химиотерапевтические препараты Абактан, Абактан Р, Абактан Ц, Теотропин.

.Ітаїшрованис экспериментальной части работ, теоретический анализ и обобщение полу-іеїшьіх результатов экспериментальных исследовашй, анализ литературных дашплх, ос-ювная часть экспериментальных исследований проведешл автором самостоятельно. Ко-ииссиошпые и производственные исішташія разработанных биопрепаратов, химиотера-"іевтических средств и методов дезинфекции нроведегал при участии специалистов Ураль-жого политехнического института. Института органичес кой химии РАН, Октябрьской тгицефабрики, ряда сельскохозяйствашых предприятий Смоленской и Владимирской )бластей, за что автор выражает им глубокую признательность.

Отдельные фрагменты экспериментальных работ выполнены совместно со следую-цими сотрудшжами ВНИИВВиМ, за что автор выражает им сердечную благодарность.

_6 Общая характеристика работы

Кандидат ветеринарных наук, старший научішш сотрудник Зубаиров М.М. (разработка и испыташе химиатерапевтичсских препаратов), каидіодат ветеринарных наук, старший научный сотрудішк Малоголовкин С.А., заведующий лабораторией (патологоанатомичсские исследования и гибридомная технология), кандидат биологических наук, научный сотрудішк, Малахова М.С. (элсктрошюмикроскопичсскис исследоваїшя), кандидат биологических наук, научный сотрудник. Черных А.А. (гибридомная технология).

При выполнении экспериментальных работ проведение целого ряда аппаратурных исследований было бы невозможно без превосходного технического содействия, оказываемого автору па протяжении ряда лет Смирновым A.D., Гусевым Н.Г.

В ходе оформлешга диссертации автор получил значительную помощь, заключавшуюся в конструктивной критике материалов от старшего научного сотрудника, специалиста в области эпизоотологии Книзе СВ., старшего научного сотрудника, специалиста в области патоморфологии Малоголовкина С.А, старшего научного сотрудника, специалиста в области иммунологии Новикова Б.В, старшего научного сотрудника, специалиста D области иммунологии и биотехнологии Дмигренко ВВ., научного сотрудника, специалиста в области цитологии Черішгх Н.В., за что выражает им глубокую признательность.

Автор выражает глубокую признательность профессору Макарову Владимиру Владимировичу - под руководством которого работал над данной темой в течение первых 7 лет ее выполнения и своему научному консультанту Шевченко Александру Алексеевичу.

Вирусология — раздел микробиологии, изучающий вирусы (от латинского слова virus — яд).

Вирусы обладают уникальными свойствами, которые позволяют выделить их из общей массы микроорганизмов:

Наличие только одного из двух видов нуклеиновых кислот.

Отсутствие собственной белок-синтезируемых систем.

Они представляют собой генетических паразитов.

Вирусы не растут, а только репродуцируются (размножаются).

Вирусы можно рассматривать двояко: как болезнетворные агенты и как агенты наследственности. Не все вирусы являются двойственными агентами; некоторые действуют только как болезнетворные, другие – только как агенты наследственности. Какую роль играет вирус, во многих случаях зависит от клетки хозяина и условий внешней среды.

Вирусы – это биологические объекты, имеющие свои особенности:

1. Содержат в своем составе только один из типов нуклеиновых кислот: РНК или ДНК.

2. Не обладают собственным обменом веществ. Для размножения используют обмен веществ клетки-хозяина, ее ферменты и энергию.

3. Могут существовать только как внутриклеточные паразиты и не размножаются вне клеток тех организмов, в которых паразитируют (в отличие от бактерий вирус паразитирует на генетическом уровне).

Вопрос о происхождении вирусов является дискуссионным. В настоящее время обсуждаются три гипотезы: 1) вирусы – примитивные доклеточные формы жизни; 2) вирусы возникли из патогенных бактерий в результате их крайней деградации (регрессивной эволюции), в связи с облигатным паразитизмом; 3) вирусы возникли из нормальных клеточных компонентов, вышедших из-под контроля клеточных регулирующих механизмов, и превратились в самостоятельные единицы.

Наиболее вероятна третья гипотеза. Можно предположить, что на участке ДНК хозяина произошла серия генетических изменений, превративших его в вирусную ДНК. Фрагмент клеточной ДНК перешел к самостоятельной репликации, стал функционировать как матрица для синтеза РНК и белков. Подтверждением гипотезы является тесная связь между клетками и вирусами, а также высокая приспособленность вирусов к

использованию клеточных систем.

Объяснить происхождение РНК-вирусов труднее, так как в нормальной клетке не бывает саморепликации РНК. Вирусы существуют в двух основных формах: внеклеточной и внутриклеточной. Основными компонентами вирусной частицы являются нуклеиновая кислота и капсид. Некоторые вирусы имеют внешнюю оболочку, окружающую их капсиды. По структуре это типичная двухслойная биологическая мембрана. Капсид построен из капсомеров, которые, в свою очередь, состоят из одной (как у ВТМ) или нескольких белковых субъединиц. Для вирионов характерна строгая геометрическая упорядоченность строения. Вирион или его отдельные части обладают определенной симметрией – спиральной и изометрической. Спиральный тип симметрии характерен для многих вирусов растений и некоторых фагов. Спиральные вирусы подразделяют на палочковидные (ВТМ) и нитевидные (х-, у- и z-вирусы картофеля, вирус желтухи свеклы и др.).

Изометрические капсиды по форме почти идентичны сфере, представляют собой правильные многогранники. Могут быть построены в виде тетраэдра, октаэдра или икосаэдра, причем последний тип является наиболее распространенным. Икосаэдр – это правильный многогранник, имеющий 20 граней, 12 вершин и 30 ребер. Капсид защищает центральную часть вириона (ядро), в которой расположена нуклеиновая кислота или нуклеиновая кислота с белком. По этому принципу построены некоторые вирусы растений (мозаики огурцов, некроза табака). К зоопатогенным вирусам с икосаэдрической структурой относятся вирусы группы герпеса, аденовирусы, возбудители полиомиелита и др.

Сложные капсиды имеют большинство бактериофагов. Бактериофаги Escherichia coli Т-серии (Т-2, Т-4, Т-6) имеют головку и хорошо развитый отросток, состоящий из сократительного чехла и внутреннего полого белкового стержня. Один конец чехла закреплен на стержне, не соединяясь с головкой, а другой заканчивается базальной пластинкой с шипами и нитями. Чехол состоит из белковых субъединиц, уложенных по спирали. Сокращение чехла способствует проникновению ДНК в клетку хозяина

При электронно-микроскопическом анализе строения капсидов на их поверхности удается обнаружить выступы, шипы, которые обычно расположены на каждой из 12 вершин икосаэдра. Эти шипы играют важную

роль в инициации инфекции. В литературе описан "волосатый" фаг, у которого от поверхности головки вириона отходят многочисленные фибриллы. Далеко не у всех вирусов животных вирионы имеют описанные формы. Вирионы рабдовирусов по форме напоминают пулю; их оболочка образуется в результате отпочкования от плазматической мембраны клетки. Вирионы группы оспы имеют форму параллелепипеда с неравными ребрами, полностью формируются в цитоплазме клетки. Размеры вирусных частиц могут достигать нескольких сотен нанометров.

Химический состав вирусов

Вирусы имеют сравнительно простой химический состав. Непременным компонентом вирусной частицы является нуклеиновая кислота, белок и зольные элементы (К, Na, Ca, Mg, Mn, Fe, Cu), соединенные с отрицательно заряженными группами нуклеиновой кислоты и белка. Эти три компонента являются общими для всех без исключения вирусов (простых или минимальных). Липиды и углеводы входят в состав сложных

Различают две большие группы вирусов: ДНК-геномные и РНК- геномные. Большинство вирусов растений содержат РНК. Среди вирусов человека и животных широко представлены обе группы. Большинство бактериофагов являются ДНК-геномными вирусами.

Вирусная ДНК. Молекулы вирусных ДНК могут быть двух цепочечными или одно цепочечными, линейными или кольцевыми. Для двуспиральной циклической ДНК характерна суперспирализация, при этом изменяются свойства молекулы, повышается устойчивость к экзонуклеазам. Большинство нуклеотидных последовательностей в вирусном геноме встречается лишь по одному разу.

В составе ДНК фагов обнаружены аномальные азотистые основания: вместо цитозина – 5-оксиметилцитозин или 6-метилцитозин, а вместо тимина – 5-оксиметилурацил. Глюкозилирование ДНК некоторых фагов придает ей стабильность, делает нечувствительной к действию ДНКазы.

Вирусная РНК. У вирусов РНК выполняет функции вещества наследственности. Может быть двух- или одноцепочечная.

Геном одного вируса может быть фрагментированным. Эти фрагменты могут входить в состав одного вириона (моновирусы) или разных вирионов (ковирусы или мультивирусы). Распределение генома одного вируса по разным вирионам позволяет увеличить объем генетической информации без увеличения массы молекулы РНК и вириона в целом. У реовирусов геном состоит из 10 фрагментов, все фрагменты обнаруживаются в составе одного вириона.

Особенности белковых оболочек вирусов:

1. Устойчивость к протеолитическим ферментам. Маскировка концевых аминокислот и другие особенности третичной и четвертичной структур белков придают им высокую устойчивость к действию протеаз.

2. Устойчивость к действию ряда физических и химических факторов. Например, вирус полиомиелита выдерживает изменения рН от 1,6 до 10,0, обработку 0,5 %-м раствором фенола, 50 %-м сернокислым аммонием, а также эфиром, ацетоном, уксуснокислым свинцом. В то же время многие вирусы довольно чувствительны к изменению рН и действию ядовитых веществ. Каких-либо общих закономерностей в этом отношении не отмечено. Ферменты вирусов. Большинство вирусов на стадии вирионов лишено какой ферментативной активности. В составе вирионов миксовирусов содержится нейраминидаза – фермент, вызывающий гидролитическое отщепление нейраминовой кислоты, которая входит в состав оболочек эритроцитов.

В составе некоторых вирусов обнаружены ферменты, участвующие в репликации вирусных нуклеиновых кислот: ДНК-зависимая РНК- полимераза, осуществляющая транскрипцию ранних РНК с ДНК (вирус оспоквакцины), РНК-зависимая РНК-полимераза (транскриптаза) и РНК- зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза), которые транскрибируют РНК и ДНК с матрицы РНК (онкогенные вирусы).

У бактериофагов обнаружены 2 вируоспецифичных фермента: лизоцим и аденозинтрифосфатаза.

Углеводы. Единственная группа вирусов, в которой наличие углеводов точно доказано, - вирусы животных. В составе вируса гриппа и классической чумы птиц находятся до 17 % углеводов, олигосахаридов, образованных галактозой, маннозой и другими моносахарами; эти углеводные компоненты находятся в связанном состоянии в составе гликолипидов и гликопротеидов.

Липиды. Двойной слой липидов образует основную массу наружной оболочки у тех вирусов, у которых она имеется. Чаще всего липиды вирионов близки по составу к липидам клетки хозяина. В вирусах животных

липиды могут составлять значительную часть: вирион энцефаломиелита лошадей содержит 54% липидов, вирус гриппа – 18-37%. Небольшое количество липидов обнаружено у бактериофагов и некоторых крупных

Полиамины. Возможно, что их единственная физиологическая функция состоит в нейтрализации отрицательного заряда нуклеиновой кислоты.

1.2 Размножение вирусов.

вирионов. Размножение заканчивается сборкой новых вирионов и выходом их окружающую среду.

Рассмотрим простейший способ размножения вирусов (рис. 2). Представим себе некий обобщённый вариант вирусной частицы, состоящей из двух основных компонентов - нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), заключённой в белковой чехол (оболочку). Встреча вирусов с клетками начинается с его адсорбций, то есть прикрепления к клеточной стенки, плазматической мембране клетки. Причём каждый вирион способен прикрепляться лишь к определённым клеткам, имеющие специальные рецепторы. На одной клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирионов. Затем начинается внедрение или проникновение вириона в клетку, которое осуществляет она сама. Этот процесс называется виропексисом.

В зараженной клетке бактериальные ферменты репликации синтезируют комплементарную ей цепь, которая служит матрицей для образования фаговых ДНК. Они соединяются с фаговыми белками, также синтезированные бактериальными ферментами, и новые фаги покидают клетку-хозяина.

Разнообразие видов и форм вирусов нуклеиновых кислот определяет и разнообразие способов их репликации. Бактериофаг (вирус, который поселяется в клетках бактерий) Т4 имеет одну двухцепочечную линейную молекулу, состоящую из 160 x 10^530 пар нуклеотидов. В ней закодировано более 150 различных белков, в том числе более 30 белков, участвующих в репликации фаговой ДНК. Обезьяний вирус SV40 имеет двухцепочечную кольцевую ДНК. Репликация у вирусов с двухцепочечной ДНК принципиально не отличается от репликации бактериальной и или эукариотической ДНК.

Многие вирусы растений содержат одну линейную молекулу РНК, например первый из описанных вирус табачной мазаики (ВТМ). Молекула РНК ВТМ заключена в белковый капсид, состоящий из 2130 идентичных полипептидных субъединиц. Репликация РНК вируса табачной мозаики осуществляется ферментом, Называемым 1 РНК-зависимой РНК-полимеразой 0, закодированной в геноме вируса. Сначала этот фермент строит комплементарную РНК, а затем по ней, как по матрице, синтезирует множество вирусных РНК.

Поразительно, как вирусы, которые в десятки и даже сотни раз меньше клеток, умело и уверенно распоряжаются клеточным хозяйством. Для построения себе подобных они используют клеточные материалы и энергию. Размножаясь, они истощают клеточные ресурсы и глубоко, часто необратимо, нарушают обмен веществ, что в конечном счёте является причиной гибели клеток.

Основными химическими соединениями, которые входят в состав всех вирусов, являются белки и нуклеиновые кислоты. В состав ряда вирусов входят липиды и углеводы.

Белки. Локализация вирусных белков. Белки, связанные с жизненным циклом вируса, разделяют на белки, детерминируемые геномом вируса и белки, имеющие клеточное происхождение. В качестве примера клеточных белков, которые обнаружены в составе некоторых вирионов, могут быть приведены белок цитоскелета – актин, и ядерные белки – гистоны. Белки клеточного происхождения, участвующие в процессе репликации вируса, будут рассмотрены в разделе взаимодействия вируса с клеткой.

По месту локализации белки, детерминируемые вирусным геномом, разделяют на две группы: 1) структурные белки – это белки, входящие в состав ВЧ, их обозначают как VP; 2) неструктурные белки – это предшественники структурных белков, регуляторные белки и ферменты, обслуживающие процесс внутриклеточной репродукции вируса и не входящие в состав ВЧ. Их обозначают как NS-белки.

Свойства вирусных белков. В состав вирионов входят белки с различной молекулярной массой (от 4 до 100 кД), состоящие из одной или нескольких полипептидных цепей. Количество этих белков также различно у разных вирусов. В состав нуклеокапсида ВТМ входит один белок. У других вирусов в состав вириона может входить несколько десятков белков, имеющих различные физико-химические свойства. Белки, формирующие капсид, нуклеокапсид и коровую оболочку, обладают одним общим свойством – способностью к самосборке.

В состав ВЧ могут входить низкомолекулярные белки, не участвующие в формировании капсида. Например, геномные белки пикорнавирусов и аденовирусов. Геномный белок ковалентно связан с нуклеиновой кислотой и участвует в ее репликации.

Сложные белки представлены гликопротеинами (обозначают как gp) и липопротеинами. Наличие гликопротеина определяет присутствие в вирионе углеводного компонента, который может быть представлен олигосахаридами маннозного типа, галактозой, N-ацетилглюкозамином или нейраминовой кислотой. Вирусные гликопротеины, как правило, экспонированы на наружной поверхности ВЧ и выполняют три основные функции: обеспечивают связывание вириона с клеточным рецептором (функция прикрепительного белка), обладают фузионной активностью (обеспечивают слияние мембран) и определяют антигенные свойства вирусов. В то же время, вирусные гликопротеины могут быть и неструктурными белками и, оставаясь в интегральной форме в мембране шероховатого эндоплазматического ретикулюма (ШЭР), выполнять функции транслоказ, обеспечивая транспорт вирусных компонентов в его просвет.

Вирусные липопротеины представлены белками, ацилированными, как правило, миристиновой (C₁₄) кислотой. Остатки жирных кислот, соединенные с молекулой белка, выполняют функцию липофильного якоря.

Вирусные белки-ферменты могут входить в состав вирусной частицы или являться неструктурными белками и появляться в клетке после экспрессии вирусного генома. Наиболее оснащенным ферментами является вирион вируса оспы, который имеет практически полный набор энзимов, необходимых для независимой внутриклеточной репликации вируса. В то же время, мелкие просто организованные изометрические вирусы с позитивным РНК-геномом могут не иметь никаких ферментов в составе вириона.

Функционально активные белки вирусов представлены, в первую очередь, ферментами нуклеинового обмена, обеспечивающими сложные механизмы репликации/транскрипции вирусного генома; ферментами, осуществляющими посттрансляционный процессинг и модификацию белков, и ферментами, участвующими в проникновении вирионов в клетку хозяина.

Первая группа ферментов наиболее многочисленна и включает как аналоги клеточных ферментов, так и вирус-специфические ферменты.

ДНК-зависимая ДНК-полимераза – осуществляет синтез ДНК на матрице ДНК (вирус оспы).

ДНК-зависимая РНК-полимераза – осуществляет синтез мРНК на матрице ДНК (вирус оспы).

РНК-зависимая РНК-полимераза – осуществляет синтез РНК на матрице РНК. Выполняет функции транскриптазы и репликазы. Впервые обнаружена в 1970 г. Балтимором у вируса везикулярного стоматита. Входит в состав вирионов или является NS-белком РНК-содержащих вирусов.

Обратная транскриптаза или ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза осуществляет синтез ДНК на матрице РНК. Впервые открыта в 1970 г. у ретровирусов Темином и Мизутани.

Хеликаза – осуществляет расплетете двухнитевой структуры ДНК. Кроме этого хеликазы обладают нуклеотидтрифосфат-зависимой РНК-хеликазной активностью, которая включает три процесса: связывание дезоксинуклеотидтрифосфата, его гидролиз и за счет этой энергии расплетение двухнитевой РНК.

мРНК-модифицирующие ферменты : поли-А-полимераза – аденилирует 3'конец РНК за счет энергии АТФ; Кэп-энзим и метилтрансферазный комплекс – катализирует образование на 5'-конце кэп-структуры.

АТФ-аза, ГТФ-аза – осуществляют гидролиз соответствующих энергетических субстратов.

Рибонуклеаза Н – разрушает РНК, находящуюся в дуплексе с ДНК. Вторая группа вирусных ферментов – ферменты белкового обмена.

Здесь мы приведем лишь некоторые из них:

Протеиназы – ферменты, участвующие в посттрансляционном процессинге полипротеинов. Являются NS-белками РНК-содержащих вирусов;

Протеинкиназы – ферменты, фосфорилирующие структурные белки вирионов. Обнаружены в составе вируса везикулярного стоматита, вируса бешенства, альфавирусов и ретровирусов. Примерами ферментов, участвующих в проникновении вирусов в клетку, являются лизоцим бактериофагов и нейраминидаза вируса гриппа.

Липиды. Все оболочечные РНК-содержащие почкующиеся вирусы имеют липиды клеточного происхождения, входящие в состав суперкапсида (от 15 % до 30 % от сухого веса). От 50 % до 60 % липидов представлены фосфолипидами, от 20 % до 30 % составляет холестерин.

У ДНК-геномных вирусов липиды содержат вирусы оспы, герпеса, гепатита B. Это непочкующиеся вирусы. У вируса оспы липиды не образуют дифференцированной оболочки, которая формируется в цитоплазме в процессе морфогенеза поксвириона. Липиды вируса гепатита B образуются путем инвагинации мембран эндоплазматического ретикулюма (ЭПР). Липидсодержащая оболочка вируса герпеса формируется при прохождении внутреннего компонента вириона через ядерную мембрану. Следовательно, в состав вирусной оболочки герпесвирусов входят липиды ядерной мембраны.

Нуклеиновые кислоты. Клетки всех живых организмов содержат два вида нуклеиновой кислоты – ДНК (двухнитевая ДНК клеточного генома) и РНК (мРНК, тРНК, рРНК). В отличие от клеток, вирионы содержат только один вид нуклеиновой кислоты – ДНК или РНК. И та и другая являются хранителями наследственной информации и выполняют функции генома. Однако следует учитывать, что наличие одного вида нуклеиновой кислоты является характеристикой вириона, но не вируса. В жизненном цикле вируса его геномная нуклеиновая кислота транскрибируется, то есть ДНК-содержащие вирусы образуют РНК. Ряд РНК-содержащих вирусов имеют в цикле репродукции стадию обратной транскрипции и синтезируют ДНК на матрице РНК. Примерно 20 % всех вирусов имеют ДНК-геном, 80 % – РНК-геном. Способность РНК хранить наследственную информацию – уникальное свойство вирусов. Размеры вирусных геномов (длина нуклеотидных последовательностей, выраженная в нуклеотидах) варьируют в широких пределах – от 1,7 тысяч нуклеотидов (т.н.) у цирковируса свиней до 300 т.н. у фикоднавирусов архибактерий.

Кроме того, что геном вирусов может быть представлен или ДНК или РНК, он может находиться в разных видах – в виде двухнитевой (дн) или однонитевой (он) формы, в виде линейной или кольцевой, в виде непрерывной или сегментированной формы.

Многообразие видов РНК геномов расширяется за счет существования последовательностей, отличающихся направлением связей сахаро-фосфатного остова.

Однонитевые РНК могут иметь позитивную полярность – (+) РНК, негативную полярность – (-) РНК или могут быть представлены обоюдозначащей цепью – (+, – ) РНК (амбисенс стратегия кодирования). В свою очередь, РНК позитивной полярности могут иметь разную структурную организацию: могут, являясь матричной РНК, иметь на 5'-конце кэп (7-метилгуанозин, Сар), а на 3'-конце – поли-А (poly-A) последовательность; могут не иметь кэпа или поли-А; могут иметь на 5'-конце геномный белок; могут иметь на 3'-конце тРНК-подобную или шпильковую структуру.

Виды геномов вирусов легли в основу их классификации. Однако следует учитывать, что вид генома в настоящее время не является формальным таксоном и используется для удобства ориентации в многообразии вирусов.

Углеводы. Углеводный компонент вирусов находится в составе гликопротеидов. Количество сахаров в составе гликопротеидов может быть достаточно большим, достигая от 10 % до 13 % от массы вириона. Химическая специфичность их полностью определяется клеточными ферментами, обеспечивающими перенос и присоединение соответствующих сахарных остатков. Обычными сахарными остатками, обнаруживаемыми в вирусных белках, являются фруктоза, сахароза, манноза, галактоза, нейраминовая кислота, глюкозамин. Таким образом, подобно липидам, углеводный компонент определяется клеткой-хозяином, благодаря чему один и тот же вирус, выращенный в клетках разных видов, может значительно отличаться по составу сахаров в зависимости от специфичности клеточных гликозилтрансфераз.

Углеводный компонент гликопротеидов играет существенную роль в структуре и функции белка. Он является каркасом для локальных участков гликопротеида, обеспечивая сохранение конформации белковой молекулы, и обусловливает защиту молекулы от протеаз. Возможны и другие функции углеводов, пока достоверно не установленные.

Компоненты клетки-хозяина. В составе вирионов могут находиться компоненты клетки-хозяина. К таким компонентам могут относиться белки, и даже целые клеточные структуры. Так, например, в составе ряда оболочечных вирусов может находиться белок цитоскелета актин, в составе паповавирусов содержатся клеточные гистоны. Ряд вирусов содержит клеточные ферменты, например, протеинкиназы. В составе аренавирусов обнаружены рибосомы.

Клеточные компоненты могут включаться в вирион случайно или закономерно, В некоторых случаях они играют существенную роль в репродукции вируса, как, например, гистоны в репродукции паповавирусов.