Ферменты микроорганизмов и вирусов

Чтобы найти устойчивые к CRISPR фаги, исследователи отобрали вирусы из пяти различных семейств фагов и использовали их для заражения распространенных бактерий, которые были генетически спроектированы для развёртывания четырех различных ферментов Cas, ДНК-проникающего компонента систем CRISPR.

Фермент рестрикции HsdR (красный), белок, который обычно режет ДНК фага (синий), не может проникнуть в ДНК. Ядрообразная оболочка, собранная фагом, окружает ДНК фага, создавая барьер, который делает геном фага недоступным для HsdR и других ферментов, проникающих в ДНК.

Эти усиленные CRISPR бактерии вышли победителями против большинства фагов, с которыми они столкнулись. Но два гигантских фага (своё название они получили за то, что их геномы были в 5-10 раз больше геномов наиболее хорошо изученных фагов), оказались непроницаемыми для всех четырёх систем CRISPR.

Учёные решили провести дополнительные испытания этих гигантских фагов, чтобы исследовать пределы их устойчивости к CRISPR. Они подвергли их воздействию бактерий, оснащенных совершенно другим типом CRISPR, а также бактерий, оснащенных системами рестрикции-модификации. То есть ферментом, расщепляющим ДНК, который более распространен, чем CRISPR (системы рестрикции обнаружены примерно у 90 процентов видов бактерий, в то время как CRISPR присутствует только в примерно 40%)%), но может быть нацелен только на ограниченное количество последовательностей ДНК.

Результаты были такими же, как и раньше: чашки Петри были завалены разрушенными остатками зараженных фагом бактерий. Эти фаги были устойчивы ко всем шести протестированным бактериальным иммунным системам. Ни один другой фаг не был на это способен.

Казалось, гигантские фаги были практически неразрушимы. Но эксперименты в пробирке показали обратное — ДНК гигантского фага была столь же уязвима для CRISPR и ферментов рестрикции, как и любая другая ДНК. Резистентность к CRISPR, которая наблюдалась в зараженных фагом клетках, должна была быть результатом чего-то, что производили вирусы, что мешало CRISPR. Но что это могло быть?

Модель заражения синегнойной палочки фагом φKZ. Иллюстрация: Mendoza et al., 2019.

Похожее открытие было сделано в 2017 году двумя другими учёными, Джо Поляно и Дэвидом Агардом. Эти исследователи продемонстрировали, что геном фага реплицируется в ядрообразной оболочке. Но до сих пор никто не знал, что оболочка также служит непроницаемым щитом против CRISPR.

Интересно, что у бактерий компартментализация встречается исключительно редко. У вирусов её не предполагается в принципе. И уж тем более чтобы компартмент был настолько похож на эукариотическое ядро. Однако поди ж ты – вот оно, псевдоядро!

Бактерия Pseudomonas chlororaphis, зараженная фагом 201φ2-1: фотография (а) и реконструкция (б). Псевдоядро – синее, собираемые капсиды вирусных частиц – зеленые, рибосомы – желтые.

Возможно, какая-то временная оболочка защищает введённую ДНК вируса на ранней стадии. Словно защитный кожух, который сбрасывается, когда орудие готово к бою. Вот только учёные пока не смогли понять, что это за защита.

Что ещё полезного можно почитать в блоге Cloud4Y

Презентация была опубликована 6 лет назад пользователемРодион Недогонов

Презентация на тему: " Лекция 2. Тема: Физиология, биохимия микроорганизмов (прокариотов: бактерий, эукариотов: простейших, грибов, вирусов). (практика 2)" — Транскрипт:

1 Лекция 2. Тема: Физиология, биохимия микроорганизмов (прокариотов: бактерий, эукариотов: простейших, грибов, вирусов). (практика 2)

2 Физиология- наука, изучающая жизненные функции микроорганизмов: питание, дыхание, рост, размножение, метаболизм (обмен веществ). Формы метаболизма: ассимиляция (аноболизм) - процесс усвоения питательных веществ и использование их для синтеза клеточных структур; диссимиляция (катоболизм) - процесс разложения и окисления питательных веществ с выделением энергии для жизни микроорганизма.

3 Особенности метаболизма: 1. высокий уровень интенсивности, чем у многоклеточных; 2. процессы диссимиляции преобладают над процессами ассимиляции; 3. спектр потребляемых бактериями веществ очень широк - от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соединений, включая антропогенные вещества - загрязнители окружающей среды (обеспечивая тем самым процессы ее самоочищения); Метаболиз проходит с участием ферментов. Ферменты - вещества белковой природы, вырабатываемые живой клеткой, локализуются в основном в цитоплазме, некоторые в ядре и клеточной стенке.

4 Виды ферментов: экзоферменты - ферменты бактерий, выделяемые во внешнюю среду, расщепляют питательные вещества до более простых соединений, которые может усвоить микроорганизм (фермент гидролаза - расщепляет белков, жиров, углеводов; протеазы - расщепляет белки; липаза - расщепляют жиры; карбогидразы- расщепляют углеводы); эндоферменты - ферменты бактерий, участвуют в процессе обмена веществ внутри клетки (ферменты, расщепляющие аминокислоты, моносахара, синтетазы). адаптивные - ферменты, синтезирующиеся при наличии соответствующего субстрата в данной питательной среде, микроорганизм вынужден их усваивать (если бактерии не вырабатывающие фермент амилазу, расщепляющий крахмал, засеять на питательную среду, где единственный источник углеводов- крахмал, то микроорганизм вынужден вырабатывать амилазу, чтобы выжить). Ферменты агрессии - для преодоления защитных барьеров макроорганизма (гиалуронидаза расщепляет межклеточное вещество соединительной ткани, способствуя распространению микроорганизма в макроорганизме).

5 Различия в ферментативном составе бактерий в медицине используют для их идентификации (дифференциально - диагностические среды (определяют сахаролитическую активность на средах Гиса, Плоскирева, Левина, Эндо); протеолитическую активность (разложение белков в МПБ, образование индола, сероводорода, аммиака, разжижжение желатина)

6 Химические компоненты бактериальной клетки: Органогены: а) Макроэлементы (много в клетке): (кислород 30%, водород 6-8%, углерод 45-55%, азот 8-10%, фосфор), которые используются для построения белков, углеводов, липидов, фосфор, входящий в нуклеиновые кислоты, ферментов, АТФ; сера, натрий участвуют в поддержании осмотического давления в клетке; магний, калий, кальций, железо ферментов АТФ накапливают энергию в клетке), б) Микроэлементы (мало в клетке): (молибден, кобальт, бор - находятся в дыхательных ферментах; марганец, цинк, медь - активизируют работу ферментов), т.е. регуляция осмотического давления, рН среды, окислительно - восстановительного потенциала, входят в состав витаминов и структурных компонентов клетки.

7 Вода микробной клетке участвует в химических реакциях, как растворитель, с ней поступают в клетку и удаляются из неё все вещества. Вода занимает 75-85% бактериальной клетки. В спорах количество воды снижается до 20% Белки (50-80% сухого вещества клетки): простые - протеины, сложные- протеиды. Белки входят в состав клеточной стенки (липопротеиды, гликопротеиды), нуклеиновых кислот (нуклеопротеиды), ферментов, токсинов (яды микроорганизмов). Нуклеиновые кислоты: ДНК содержится в ядре, несёт генетическую информацию; РНК участвует в биосинтезе клеточных белков, содержится в ядре и цитоплазме.

8 Углеводы - источник энергии и углерода, входят в состав клеточной оболочки, капсулы, тейхоевой кислоты (у грамположительных микроорганизмов), в запасные вещества клетки (крахмал, гликоген). Липиды - входят в состав цитоплазматической мембраны и клеточной стенки, включений участвуют в энергетическом обмене. Чем больше липидов в микробной клетке, тем она устойчивее к факторам внешней среды (микобактерия туберкулёза).

9 Питание – процесс получения из окружающей среды компонентов, необходимых для построения её биополимеров (органоидов). Бактериальные клетки не имеют специальных органов питания, т.е. являются голофитными. Питание происходит через всю поверхность микроорганизма. Поступление питательных веществ в микробную клетку происходит: 1. за счет осмоса и диффузии (градиенту концентрации без затрат энергии); 2. за счет пассивного транспорта (по градиенту концентрации с помощью белков-переносчиков, без затрат энергии, отличается от диффузии большей скоростью); 3. за счет активного транспорта (против градиента концентрации с затратой энергии).

10 Типы питания м/о по усвоению углерода. По способности усваивать углерод: 1. аутотрофы (литотрофы) – микроорганизмы (почвенные бактерии - серобактерии), использующие как источник углерода углекислый газ, другие неорганические соединения углерода. 2. гетеротрофы (органотрофы) – микроорганизмы (сапрофиты от греч. Sapros – гнилой phyton – растение; паразиты от греч. Parasitos - нахлебник), которые использующие как источник углерода органические углеродосодержащие соединения (углеводы, углеводороды, аминокислоты, органические кислоты)

11 Типы питания м/о по усвоению азота. 1. аминоавтотрофы (клубеньковые бактерии) для синтеза белка клетки используют молекулярный азот воздуха, 2. аминогетеротрофы (патогенные микроорганизмы, многие сапрофиты) получают азот из органических соединений (аминокислоты, сложные белки).

12 По источникам получения энергии микроорганизмы делятся: 1. фототрофы (пурпурные серобактерии, сине - зелёные водоросли), способные использовать для биосинтетических реакций солнечную энергию; 2. хемотрофы, получающие энергию за счет окисления неорганических веществ (нитрифицирующие бактерии) и органических соединений (большинство бактерий), т.е. в химических реакциях. (окисление- отдача водорода, восстановление- присоединение водорода)

13 Особенности белкового и углеводного обмена бактерий Белковый обмен - процесс синтеза собственных аминокислот и белков путем ассимиляции компонентов из внешней среды, с другой стороны - внеклеточное расщепление белков под воздействием различных ферментов. Если расщепление белков происходит в анаэробных условиях, то этот процесс называется гниение, а если он идет в аэробных условиях - тление. Углеводный обмен - процесс синтеза и распада углеводов. Расщепление углеводов бактериями (сахаролитические свойства) в аэробных условиях с образованием углекислого газа и воды называется горением, а расщепление ими углеводов в анаэробных условиях – брожением (спиртовое, молочнокислое, масляно - кислое, уксусно - кислое).

14 Типы дыхания бактерий. Дыхание (биологическое окисление) - процесс, сопровождающийся выделением энергии, необходимой микроорганизмам для синтеза органических соединений. Органеллами дыхания - производная цитоплазматической мембраны - мезосомы, с дыхательными ферментами типа цитохромоксидаз.

15 По типу дыхания бактерии делят: 1. облигатные (строгие) аэробы развиваются при наличии 20% кислород в атмосфере. 2. микроаэрофилы- бактерии, нуждающиеся в меньшем количестве кислорода (бруцеллы, лептоспиры). Большое количество кислорода будет задерживать их рост. 3. облигатные анаэробы – бактерии (клостридии столбняка, ботулизма, бациллы газовой гангрены), растущие только в бескислородной среде. 4. факультативные анаэробы - бактерии, способные расти как в присутствии, так и в отсутствии кислорода (большинство патогенных и сапрофитных бактерий - возбудители брюшного тифа, кишечная палочка).

16 Рост и размножение бактерий. Рост бактерий - увеличение размеров отдельной особи. Размножение бактерий - способность организма к самовоспроизведению, в результате чего увеличивается число особей в популяции. В основном размножение происходит путём поперечного деления в разных плоскостях (чаще за минут, микобактерия туберкулёза делится 1 раз в сутки). В результате деления образуются сочетания клеток: цепочки (стрептококки), парные соединения (диплококки), тетрады кокков, тюки (сарцины), гроздья (стафилококки).

17 Размножение бактерий в жидкой питательной среде: фаза исходная (латентная): адаптация бактерий к питательной среде, начало размножения (лаг - фаза); фаза логарифмическая: бактерии энергично размножаются; фаза стационарная: концентрация бактерий в среде постоянная; фаза отмирания: жизнеспособных клеток мало, постепенно они отмирают. В жидких средах микроорганизмы образуют либо равномерную муть, либо осадок, или плёночку (придонный, диффузный или поверхностный рост).

19 Колонии бактерий разных видов отличаются: формой (выпуклые, плоские, куполообразные, вдавленные, круглые, розеткообразные R- форма (шероховатые), S- форма (гладкие с ровными краями), величиной (крупные 4-5мм, средние 2-4мм, карликовые менее 1мм), прозрачностью (прозрачные, непрозрачные), цветом (от белой до чёрной), высотой, характером поверхности (шероховатая, гладкая, матовая, блестящая, бугристая, сухая), краев (ровный, неровный: волнистые, извитые), консистенцией.

20 Физиология эукариотов Грибы - гетеротрофы, аэробы и факультативные анаэробы, растут при градусах на сусле - агаре, среде Сабуро, среде Чапека. Размножение половое и бесполое. Простейшие - питание с помощью пищеварительной вакуоли, выделение с помощью сократительной вакуооли. По типу питания - гетеротрофы, аутотрофы. Размножение половое и бесполое. Растут на питательных средах с белком, аминокислотами. Физиология вирусов Вирусы – рост, размножение и питание на биологических моделях (животные, куринный эмбрион, гетеротрофы).

Вирусы — группа ультрамикроскопических облигатных внутриклеточных паразитов, способных размножаться только в клетках живых организмов (многоклеточных и одноклеточных). Среди них имеются возбудители заболеваний человека, животных, растений, насекомых, простейших и микроорганизмов.

Вирусы были открыты в 1892 г. Д. И. Ивановским при изучении причин гибели табака от мозаичной болезни, выражающейся в появлении пятен на листьях растений. Ученый обнаружил, что здоровое растение получает возбудителя с соком больного растения даже после пропускания этого сока через бактериологические фильтры. Следовательно, болезнь вызывает организм, который способен проходить через бактериологические фильтры. Эти микроорганизмы назвали фильтрующимися вирусами, а затем просто вирусами.

Вирусы обладают следующими характерными особенностями, отличающими их от других микроорганизмов:

• • не имеют клеточного строения;
• • не способны к росту и бинарному делению;
• • не имеют собственных систем метаболизма;
• • содержат нуклеиновые кислоты только одного типа — ДНК или РНК;
• • используют рибосомы клетки-хозяина для образования собственных белков;
• • не размножаются на искусственных питательных средах и могут существовать только в организме восприимчивого к ним хозяина.

Обычно вирусы существуют в двух формах — внеклеточной в виде так называемого вириона и внутриклеточной, называемой репродуцирующимся, или вегетативным, вирусом. У вириона отсутствует обмен веществ, он не растет и не размножается. Внутриклеточная форма представляет собой активный агент, который, попав в клетку хозяина (растения, животного, микроорганизма), использует ее биосинтетический и энергетический аппарат для репродукции новых вирусов, а впоследствии может вызвать и гибель самой клетки. Следовательно, только в клетке хозяина вирус способен функционировать и репродуцироваться, приобретая свойства живого организма.

Химический состав вирусов довольно прост. Число химических соединений, из которых они состоят, невелико. Вирусы представляют собой нуклеоп роте иды и состоят из нуклеиновой кислоты и нескольких кодируемых ею белков. Нуклеиновые кислоты вирусов отличаются значительным разнообразием, превосходя в этом отношении даже клеточные формы жизни — эукариот и прокариот.

Как известно, в состав клеток входят ДНК и РНК, в то время как вирусы содержат только один тип нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК. Поэтому все вирусы подразделяют на две группы — ДНК-геномные и РНК-геномные. Обычно вирусы растений содержат РНК-геномы, вирусы человека и животных как ДНК-, так и РНК-геномы. Почти все бактериофаги ДНК-геномны.

Сложно организованные вирусы (вирусы животных и человека) сложны по химическому составу и содержат дополнительные белковые или липопротеидные оболочки. Кроме нуклеиновой кислоты и белков, они содержат липиды в наружных оболочках и углеводы в составе белков наружных оболочек (гликопротеидов). Некоторое количество липидов есть у бактериофагов и ряда крупных вирусов растений. У некоторых сложных вирусов выявлены ферменты. У бактериофагов также обнаружены ферменты — лизоцим и аденозинтрифосфатаза.

Один из наиболее хорошо изученных фитопатогенных вирусов — вирус табачной мозаики (ВТМ). В 1935 г. У. Стенли выделил и получил этот вирус в кристаллической форме. При введении в рас-

Рис. 28. Электронные микрофотографии вирусов животных, растений и бактерий: слева — коровьей оспы, заболеваний насекомых, бактериофага ТЗ. полиомиелита; справа — гриппа, бактериофага Г2. папилломы кроликов, мозаики табака

тение табака кристаллы вызывали симптомы мозаичной болезни. Получены в кристаллическом виде и многие другие вирусы.

Изучение вирусов под электронным микроскопом показало, что они разнообразны по форме и имеют довольно сложное строение. Различают следующие формы вирусов: палочковидную, при которой вирус имеет вид прямого цилиндра (вирус табачной мозаики); нитевидную, представляющую эластичные изгибающиеся нити (некоторые вирусы растений и бактерий); сферическую, сходную с многогранниками (вирусы животных и человека); кубовидную, по виду напоминающую параллелепипед с закругленными краями (вирусы животных и человека); булавовидную, характеризующуюся наличием головки и отростка (вирусы бактерий и актиномицетов) (рис. 28).

Внеклеточная форма существования вируса, вирион, состоит из нуклеиновой кислоты и белка. Нуклеиновая кислота уложена в виде спирали и окружена белковой оболочкой, называемой капсидом. Последний образован большим числом субъединиц белка — капсамеров, которые, в свою очередь, представлены одной или несколькими молекулами белка. Белковый капсид, объединенный с нуклеиновой кислотой (ДНК или РНК), носит название нуклеокапсида. По способу укладки капсомсров выделяют капсиды, построенные по спиральному и кубическому типам симметрии. В первом случае капсид имеет цилиндрическую форму, во втором — форму многогранника. К вирусам со спиральным типом симметрии относят вирус табачной мозаики.

Рис. 29. Т-бактериофаг. Электронная микрофотография (по: С. Бреннер)

Для многих вирусов бактерий, или фагов, характерен так называемый сложный тип симметрии: головка фага имеет форму многогранника (кубическая симметрия), хвостовой отросток — форму цилиндра (спиральная симметрия) (рис. 29).

Размеры вирусов определяют различными способами: по размеру пор фильтров, пропускающих вирусы, по скорости осаждения вирусов при центрифугировании и при помощи фотографий, полученных в электронном микроскопе. Размеры вирионов вирусов колеблются в довольно широких пределах — от 15 до 400 нм. В обычный световой микроскоп отдельные вирусные частицы не видны, но в пораженных вирусом клетках часто можно различить тельца-включения, представляющие собой, как считают, гигантские колонии вирусов.

Вирусы специфичны, они паразитируют только на определенных хозяевах — растениях, животных или микроорганизмах. Это обусловливает распределение вирусов на группы на основе типа хозяев. В последнее время при классификации вирусов принимают во внимание их строение, чувствительность к внешним факторам и т. д. Выделяют группы вирусов, патогенных для растений, животных и, наконец, для микроорганизмов. Вирусы бактерий и актиномицетов называют соответственно бактериофагами и актииофагами. Известны субмикроскопические агенты — микофаги, поражающие грибы, и цианофаги, паразитирующие на цианобактериях.

Вирусы нс размножаются в почве, но могут долго сохраняться в ней, если условия исключают их инактивацию. Так сохраняются вирусы мозаичной болезни пшеницы, овса и табака, кольцевой пятнистости картофеля и др. Некоторые вирусы человека и животных, попадая в почву, остаются инфекционными в течение нескольких месяцев.

Фаги — облигатные паразиты микроорганизмов — открыли независимо друг от друга в 1915 г. Ф. Туорт ив 1917 г. Ф. Д. Эррель. Длина головки фага достигает 60—100 нм, отростка — 100—200 нм. Призматическая головка фага покрыта оболочкой из упорядоченно расположенных капсомсров. Внутри головки находится одна или две нити ДНК.

Отросток представляет собой белковый стержень, покрытый сверху чехлом из спирально расположенных капсомеров, способных к сокращению. Обычно отросток оканчивается базальной пластинкой с пятью-шестью выростами. От пластинки отходят тонкие нити — органы адсорбции. Через отросток из головки фага ДНК переходит в клетку микроорганизма.

Механизм проникновения бактериофага в бактерии подробно изучен. Обычно фаг адсорбируется чувствительной к нему клеткой бактерии. Затем содержимое головки (ДНК) переходит в бактерию, а оболочка остается снаружи. После нападения фага бактерия утрачивает способность к делению, перестает двигаться. Метаболизм бактериальной клетки перестраивается под влиянием ДНК фага, и клетка начинает производить продукты не собственного обмена, а бактериофага, и в результате в ней происходит интенсивное образование частиц бактериофага. Затем клеточная стенка бактерии растворяется, и из нес выходят зрелые бактериофаги. Одна клетка бактерии становится источником нескольких сотен и даже тысяч бактериофагов.

При наблюдении колоний бактерий на агаре лизирующее действие бактериофага видно по образованию прозрачных зон вокруг колоний, а на жидкой среде — но уменьшению мутности бактериальной суспензии.

Растворять (лизировать) данный вид бактерий способен только вирулентный к нему фаг. Нередко бактериальная клетка инфицируется фагом, который может в ней существовать, не вызывая лизиса. При размножении бактерии инфекционное начало переходит в дочерние клетки. Бактериофаги такого характера называют умеренными, а бактерий — передатчиков данных фагов — лизогенными. При определенных условиях лизогенные культуры бактерий могут быть лизированы находящимся в них фагом. Каждый фаг способен поражать бактерий одного вида или группы близких видов.

Исследовано большое число фагов, поражающих рахзичных микроорганизмов. Известны фаги, лизирующие бактерии родов Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Streptococcus, Staphylococcus; актиноми исты рода Streptomyces; микобактерии рода Mycobacterium и др. Фаги встречаются в воде, почве и других природных объектах. Некоторых фагов используют в медицине для профилактики заболеваний.

1. Назовите основные группы водорослей и их свойства. 2. Какие группы простейших широко представлены в почве? 3. Чем отличаются микромицс- ты от миксомицетов? 4. Что представляют собой вирусы и какие организмы они способны заражать?