Cvs тест штамма вируса

УДК 619:616.98:578.824.11:615.371
DOI 10.33861/2071-8020-2019-3-7-9

Введение. Ветеринарные вакцины против бешенства содержат или живой вирус, аттенуированный для целевых животных (такой как Flury низкого пассажа на яйцах, Flury высокого пассажа на яйцах, Street-Alabama-Dufferin или Kelev), или вирус, инактивированный химическими или физическими средствами, или представляют из себя рекомбинантные генноинженерные вакцины. Вакцинный вирус культивируют в ткани ЦНС новорожденных животных (тканевые вакцины), в яйцах с развивающимся эмбрионом (эмбриональные) или в различных клеточных культурах (культуральные) [4, 5, 6]. Для каждого вида разрабатываемой вакцины, на животных-мишенях следует определить продолжительность и напряжённость иммунитета, выработанного в результате применения биопрепарата.

Относительно живых вирусных вакцин, должно быть установлено минимальное количество вируса, на введение которого вырабатывается адекватный иммунный ответ. Кроме того вакцины обоих типов подвергают тестированию на безвредность и отсутствие токсичности. Касаемо живых вирусных вакцин, которые производят для пероральной вакцинации диких животных, то необходимо доказывать их безопасность и эффективность на животных-мишенях и безопасность на животных, не являющихся целевыми видами (грызуны и другие дикие животные) [1, 2, 3].

По литературным данным существуют различные методы определения иммуногенной активности антирабических вакцин [4, 5, 6, 7]. Среди них можно отметить исследование сыворотки объемным методом Национальных Институтов Здравоохранения США (NIH), реакцию вируснейтрализации в культуре клеток (FAVN) и быструю реакцию подавления флуоресцирующего фокуса для определения нейтрализующих вирус бешенства антител (RFFIT) - (предписанные для международной торговли тесты); реакцию вируснейтрализации на мышах, иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием моноклональных антител к протеину G и некоторые другие. Результаты выражаются в международных единицах или эквивалентных единицах относительно международной стандартной антисыворотки.

Кроме указанных методик на практике используют метод прямого заражения иммунизированных против бешенства плотоядных животных с использованием уличного (или стандартного контрольного) вируса бешенства против 5-50 или 10-100 МЛД50. Данная методика определения инфекционной активности связана с техническими сложностями: приобретение, содержание, иммунизация, заражение и содержание зараженных животных в течение всего периода наблюдения.

Большинство рассматриваемых методик определения иммуногенной активности при разработке были направлены на определение антител в сыворотках крови от парентерально иммунизированных животных (с использованием различных инактивированных антирабических вакцин). Применение этих методов создает ряд неудобств и ошибок при проведении исследований, а также связано с вышеописанными техническими сложностями.

Для контроля поствакцинального иммунитета у орально иммунизированных живыми вакцинами диких плотоядных животных ВОЗ и МЭБ рекомендуют реакцию вируснейтрализации в культуре клеток (реакция вируснейтрализации с флуоресцирующими антителами - FAVN) [5, 6]. Для постановки данной реакции необходимо получить опытную сыворотку крови в максимально стерильных условиях, так как она будет использована для работы с культурой клеток, а так же иметь стандартизированные питательные среды, реактивы, контрольные штаммы и референтные стандартные сыворотки.

Исходя из вышеизложенного, целью нашего исследования была попытка разработки возможной лабораторной модели определения иммуногенной активности (ИА) живой антирабической вакцины для диких плотоядных животных на лабораторных восприимчивых животных.

Накопление вакцинного вируса проводили в перевиваемой культуре клеток BHK-21(cl-13) в роллерном монослое и глубинным суспензионным способом в лабораторном биореакторе Biostat-B.

Титр инфекционной активности полученного вируса проверяли методом титрования на мышатах при интроцеребральном заражении. Активность вируса составляла от 6,25 до 7,50 lg МЛД50/мл.

Для экспериментального контрольного заражения нами использовался фиксированный вирус бешенства штамм Challenge Virus Standard (CVS) в виде мозговой культуры, полученный в 1971 г. из лаборатории профилактики бешенства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР. Вирус CVS был адаптирован к культуре клеток РЭК. Титр инфекционной активности вируса, использованного в экспериментах, составляет 7,0 lg МЛД50/мл.

Расчет вели от базового варианта иммунизации диких плотоядных животных: на среднестатистическую лисицу массой 5-6 кг для создания напряженного иммунитета должно быть введено орально 1-2 млн. МЛД50, и созданный иммунитет должен противостоять 10-100 МЛД50 контрольного вируса CVS.

В пересчете на живую массу лабораторных подопытных животных и, с учетом физиологических данных, они должны получить орально 5.620-56.200 МЛД50/гол. Иммунизировали мышей однократно орально в дозе вируса 5620-56200 МЛД в объеме 0,03 мл из шприца, не травмируя слизистую оболочку ротовой полости.

Через 21 день иммунизированных мышей подвергали экспериментальному контрольному заражению стандартом вируса CVS в дозе 10-100 МЛД50/0,03 мл. Параллельно стандартный вирус в дозе 10-100 МЛД50/0,03 мл вводили не иммунной группе контроля. Кроме того провели уточняющую титрацию заражающего материала, по итогам которой установили, что опытные и контрольные животные получили при заражении 31,6 МЛД50/0,03 мл.

Напряженность сформировавшегося иммунитета определяли по выживаемости мышей в течение 14 суток после экспериментального контрольного заражения.

За сутки до контрольного заражения (20-й день) у иммунизированных животных брали кровь для определения титров антител в реакции вирус нейтрализации на культуре клеток ВНК-21(с1-13) с постоянной дозой контрольного вируса CVS в дозе 10-100 МЛД50/0,03 мл (фактическая доза 31,6 МЛД50/0,03 мл). Реакцию нейтрализации ставили в 96-луночных планшетах, окрашивание проводили флуоресцеин изо-тиоцинатом антирабического конъюгата через 48 часов инкубации по стандартной методике. Конечный титр сывороточной нейтрализации определяется как фактор наивысшего разведения сыворотки, при котором 50% наблюдаемых микроскопических полей содержат одну или более инфицированных клеток. Результат РВН оценивали качественным образом: отсутствие флуоресцирующих клеток - минусовой учёт регистрируется в отношении лунки; наличие флуоресцирующих клеток (одна клетка или более) - плюсовой учёт регистрируется в отношении лунки.

Стандартная процедура постановки реакции вируснейтрализации с флуоресцирующими антителами на культуре клеток предписана ВОЗ и МЭБ для международной торговли [5, 6, 7].

Результаты исследований. Животных разделяли на 3 опытные группы и одну контрольную, с трехкратной повторностью каждого опыта.

Мыши первой опытной группы - по 6 голов (серия опыта №1) получали орально 562.000 МЛД50, второй группы - 56.200 МЛД50, третьей группы - 5.620 МЛД50.

Через 20 суток после экспериментальной иммунизации провели отбор крови у опытных и контрольных животных. Данные экспериментов оценки иммуногенной активности по уровню вируснейтрализую-щих антител в сыворотке крови вакцинированных животных в реакции вируснейтрализации представлены в таблице 1.

Таблица 1 Титры антител у иммунизированных орально опытных животных

Доза вируса для иммунизации и выживаемость мышей

Средний титр антител в группе

Среднее значение в группе

Примечание: n=3, m=6

Результаты эксперимента свидетельствуют о формировании иммунного ответа при экспериментальной оральной иммунизации на уровне от 1:6 до 1:16 (3,0-4,0 log2) и выше. Так же прослеживается зависимость средних титров вируснейтрализующих антител и дозы вируса, полученной при иммунизации - от 1:8,7 до 1:18 при дозе 5.620 и 562.000 МЛД50, соответственно. По литературным данным полученные средние значения ВНА в экспериментальных группах обеспечивают защиту от заражения вирусом бешенства [1, 2, 3]. Эти данные были подтверждены на втором этапе исследовательской работы.

Через 21 день после иммунизации все три опытные группы и контрольная группа были заражены интрацеребрально контрольным стандартным вирусом CVS в дозе 31,6 МЛД50. Наблюдение за животными вели в течение 14 дней.

В первой серии опытов получены следующие результаты: в первой и второй группе все зараженные мыши выжили, в третьей группе -83,3 % животных выжили, при 100% падеже животных в контрольной не иммунизированной группе.

Во второй серии опытов группы мышей были иммунизированы и заражены по той же схеме. По итогам наблюдения - в первой и второй группе - 100% животных выжили, в третьей - 66,6%, в контрольной группе отмечалась - 100% гибель животных.

В третьей серии экспериментов с целью уточнения и расширения результатов исследования в опыт взяли 3 группы мышей, которых иммунизировали: первая группа - 56.200 МЛД50, вторая - 5.620 МЛД50, третья группа - 562 МЛД50, а через 20 дней провели контрольное заражение вирусом CVS. Через 14 дней наблюдения после заражения получены следующие результаты: в первой и второй группе - 100% животных выжили, в третьей все мыши пали, в контрольной группе пало - 66,6% мышей. По нашему мнению стопроцентная гибель мышей в третьей группе и выживаемость в группе контроля связаны с технической погрешностью при интрацеребральном заражении животных.

Итоговые данные проведенных экспериментов по иммунизации мышей и их выживаемости обобщены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты выживаемости опытных животных после контрольного заражения

Доза вируса для иммунизации и выживаемость мышей, %

Примечание: n=3, m=6

Из мозга павших животных подготовлены мазки-отпечатки и обработаны флуоресцирующим глобулином для обнаружения антигена вируса бешенства при люминесцентной микроскопии. Из 12 мазков-отпечатков в 10 было обнаружено характерное для антигена вируса бешенства свечение (тельца Негри), что подтверждает гибель мышей от лабораторного заражения контрольным штаммом вируса бешенства (рисунок 1).

Рис. 1. Характерное свечение вирусных частиц (тельца Негри) при обработке флуоресцирующим коньюгатом (РИФ), люминесцентная микроскопия

Таким образом, определена однократно вводимая иммунизирующая доза в 56.200 MLD для белых мышей массой 12-14 г, создающая защиту против 10-100 МЛД50/0,03 мл контрольного вируса CVS и являющаяся достаточной для образования защитного уровня вирусней-трализующих антител. Следует так же отметить, что иммунизирующая доза в 5.620 MLD защищает от 66,6 до 100% животных, что так же является удовлетворительным результатом.

Определенная нами оральная иммунизирующая доза для мышей (56200-5620 МЛД) коррелирует с дозой вируса для диких плотоядных животных (1-2 млн. МЛД), что свидетельствует об эффективности лабораторной модели определения иммуногенной активности оральной антирабической вакцины. Данные остальных групп иммунизации животных могут быть использованы в научных целях, потому что по современным требованиям определения безвредности при различных путях введения носят рекомендательный характер.

1. Определение иммуногенной активности антирабической вакцины на лабораторной модели позволило подобрать иммунизирующую мышиную дозу вакцины, которая защищает 100% животных при экспериментальном заражении контрольным вирусом бешенства CVS в дозе 10-100 МЛД50/0,03 мл. Однократно вводимая иммунизирующая доза для белых мышей массой 12-14 г составила 56.200 MLD50.

2. Полученные при экспериментальной иммунизации мышей титры ВНА от 1:8 до 1:16 (3,0-4,0 log2) и выше, свидетельствуют о напряженном иммунитете против бешенства.

Резюме. Для каждого вида разрабатываемой вакцины, на животных-мишенях следует определить продолжительность и напряжённость иммунитета, выработанного в результате применения биопрепарата. Большинство применяемых методик определения иммуногенной активности связаны с техническими сложностями: приобретение, содержание, иммунизация, заражение и содержание зараженных животных в течение всего периода наблюдения, а так же создает ряд неудобств и ошибок при проведении исследований. Представлены результаты альтернативных исследований по изучению иммуногенной активности живой антирабической вакцины для пероральной иммунизации диких плотоядных животных. Рассматривается методика оценки иммуногенности с использованием модели оральной иммунизации на мышах при экспериментальном заражении контрольным вирусом бешенства CVS в дозе 10-100 МЛД50/0,03 мл. Однократно вводимая иммунизирующая доза для белых мышей массой 1214 г составила 56.200 MLD50, при этом титры ВНА составили от 1:6 до 1:16 (3,0-4,0 log2) и выше. Определенная нами оральная иммунизирующая доза для мышей (56200-5620 МЛД) коррелирует с дозой вируса для диких плотоядных животных (1-2 млн. МЛД), что свидетельствует об эффективности лабораторной модели определения иммуногенной активности оральной антирабической вакцины. Определение иммуногенной активности антирабической вакцины на лабораторной модели позволило подобрать иммунизирующую мышиную дозу вакцины, которая защищает 100% животных при экспериментальном заражении контрольным вирусом бешенства CVS. Полученные при экспериментальной иммунизации мышей титры ВНА от 1:8 до 1:16 (3,0-4,0 log2) и выше, свидетельствуют о напряженном иммунитете против бешенства.

Ключевые слова: бешенство, иммуногенная активность, напряженность иммунитета, антирабическая вакцина, поствакцинальный иммунитет, дикие плотоядные животные, пероральная иммунизация, оральная иммунизирующая доза.

Сведения об авторах:

Авилов Вячеслав Михайлович, доктор ветеринарных наук, член-корреспондент РАН; 119991, г. Москва, Ленинский проспект, 14; тел.: 8-901-9074326; e-mail: zolotovo-41@rambler.ru.

Исследовали на модели культур клеток зависимость специфической инфекционной активности вируса бешенства промышленных (фиксированных) штаммов L. Pasteur и CVS от длительности и температуры хранения. Вирусную суспензию накапливали в клеточной культуре / С13 и замораживали при -20 и -80°С. Анализ специфической активности проводили через 1 неделю, 1, 2, 3, 6 и 12 месяцев хранения. Экспериментально установили, что для исследованных штаммов более эффективной для длительного хранения является температура -80°С.

Ключевые слова: вирус бешенства, вируссодержащая суспензия, антирабический иммуноглобулин, антирабическая вакцина, долгосрочное хранение, низкие температуры

The dependence of specific infectious activity on the cell culture model of rabies virus industrial (fixed) strains L. Pasteur and CVS from the duration and storage temperature was investigated. Viral suspension was produced by cell culture / C13 and frozen at -20 and -80°C. Analysis of the specific activity was performed after 1 week, 1, 2, 3, 6 and 12 months of storage. It was experimentally discovered that the temperature -80°C is more effective for storage for the studied strains.

Keywords: rabies virus, virus-containing suspension, rabies immunoglobulin, rabies vaccine, long-term storage, low temperature

Введение

Бешенство является опасным нейроинфекционным заболеванием теплокровных животных (в том числе и человека), которое встречается более чем в 150 странах мира [7, 10]. Возбудителем данного заболевания является РНК-содержащий вирус рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae, порядка Mononegavirales. Заражение бешенством главным образом происходит через укус, в ходе которого инфекция передаётся со слюной. Основной мишенью вируса бешенства является центральная нервная система (ЦНС). Вирус бешенства является единственным из царства Virae, который поражает всех теплокровных животных с летальностью 100 %. От укусов животных, больных бешенством, ежегодно в мире погибает более 55 000 человек. В связи с этим согласно оценке Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) бешенство входит в пятёрку болезней, которые наносят наибольший ущерб человечеству и мировой экономике. Единственным методом борьбы с данным заболеванием являются пред- и постэкспозиционная профилактика, в рамках которой используются антирабические иммуноглобулин (АИГ) и вакцина (в дальнейшем — антирабические препараты) [1, 7, 10, 11].

Для получения антирабических препаратов и контроля их качества используются аттенуированные (или фиксированные) штаммы вируса бешенства, которые получают в ходе воздействия на полевые изоляты мутагенов или других факторов, позволяющих менять свойства вирионов. В отличие от полевых изолятов штаммы фиксированного вируса бешенства могут быть полностью или частично лишены способности к заражению целого организма животного или человека, но сохраняют возможность заражать ткани и клетки при непосредственном контакте. Наиболее распространёнными в производстве антирабических препаратов являются фиксированные штаммы вируса бешенства L. Pasteur и CVS, выделенные более 100 лет назад из полевых изолятов, ослабленные путём пассирования через мозг кроликов и адаптированные к мозгу мышей и клеточным линиям. С 1996 года ВОЗ рекомендует при производстве антирабических препаратов полностью отказаться от использования вируса бешенства, полученного пассированием через мозговую ткань животных, и использовать для накопления вирусной суспензии клеточные культуры [8, 11].

Цель исследования

Цель исследования — экспериментально определить эффективный температурный режим для долгосрочного хранения суспензии вируса бешенства штаммов L. Pasteur и CVS в условиях производства.

Материалы и методы

В качестве субстрата для накопления суспензии вируса бешенства использовали перевиваемую клеточную линию ВНК-21 / C13 (ATCC CCL-10), которая широко применяется для производства культуральной вакцины против бешенства [5, 6, 8, 12]. Клеточную линию накапливали в пристеночном монослое 1 сутки в стерильных пластиковых флаконах (SPL, Германия). В ходе исследования использовали фиксированные штаммы вируса бешенства L. Pasteur (адаптированный к клеточной линии Vero, № 2061 / Vero, 15 пассаж) и CVS (challenge virus standard), рекомендованные ВОЗ для производства АИГ и антирабических вакцин для животных и человека [8, 12]. Штамм L. Pasteur был адаптирован к клеточной линии ВНК-21 / C13 [6] и предоставлен Институтом Пастера (Нови-Сад, Сербия) вместе с технологическим регламентом производства антирабического антигена.

Вирусную суспензию культивировали в течении 4-х суток с момента заражения в поддерживающей среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) c 0, 2 % бычьего альбумина (PAA, Австрия) в СО₂-инкубаторе (Binder, Германия) при 33ºС и 5 % СО₂. Сбор вирусной суспензии проводили на 4 сутки после заражения. Полученную вирусную суспензию центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут в рефрижераторной центрифуге (MPW, Польша) при 4ºС для удаления клеточного детрита. Супернатант собирали, добавляли к нему сахарозу с конечной концентрацией 5 %, расфасовывали в пластиковые криопробирки (PAA, Австрия) и замораживали при -20 и -80ºС в морозильных камерах (National Lab, Германия). Контроль температуры, при которой хранили криопробирки, производили с помощью спиртовых термометров [5, 6, 8, 12].

Для определения специфической инфекционной активности вирусной суспензии использовали метод титрации вируса в культуре клеток линии ВНК-21 / C13. Суспензию вируса бешенства размораживали через 1 неделю, 1 , 2, 3, 6 и 12 месяцев хрнения при низких температурах (срок наблюдения) и титровали с коэффициентом разведения 5 на культуре клеток ВНК-21 / C13 в 96-луночных планшетах (SPL, Германия) в 5-ти повторах (n = 5). Культивировали клетки 48 часов в СО₂-инкубаторе при 37ºС и 5 % СО₂, затем фиксировали монослой клеточной лини охлаждённым при -20ºС ацетоном. Так как промышленные штаммы вируса бешенства не оказывают на клеточные линии цитопатогенного действия, то для определения инфекционной активности вирусной суспензии использовали метод непрямой флуоресценции. Для этого применяли специфические моноклональные антитела к вирусу бешенства, меченные изотиоцинатом флуоресцина (FITC) (Fujirebio, U.S.A.), которыми производили окрашивание клеточного монослоя. Учёт результатов производили с помощью медицинского микроскопа (МИКМЕД-6, ЛОМО, Россия) (увеличение 100×) с люминисцентной насадкой. При микроскопировании учитывали яркое специфическое свечение зелёного цвета, которое свидетельствует о наличии вируса бешенства в клетках, и лунки с таким свечением отмечали как положительные (рисунок 1) [4, 5, 9, 12].

Рисунок 1 — Клетки лини ВНК-21 / С13, инфицированные вирусом бешенства штамма L. Pasteur. Окраска FITC-меченными моноклональными антителами, увеличение 100×

Расчёт титра вируса проводили с помощью формулы Спирмена-Карбера и выражали в десятичном логарифме 50 %-ой фокусформирующей инфицирующей дозы (lg FFD₅₀):

, где

x₀ — lg наибольшего разведения, в котором во всех лунках отмечается положительное свечение;

d — lg фактора разведения;

n_i — общее количество лунок, приходящихся на каждое разведение титрации вирусной суспензии;

r_i — количество положительных лунок в каждом разведении титрации вирусной суспензии [3, 9, 12].

Статистический анализ данных осуществляли с помощью стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel-2010 и Past. Вид распределения определяли с помощью W-критерия Шапиро-Уилка, достоверность различий между группами данных рассчитывали с использованием параметрического t-критерия Стьюдента (для групп с нормальным распределением данных). Расхождение считали статистически значимым при p ≤ 0, 05.

Результаты и обсуждение

В ходе проведенных исследований была проанализирована сохранность специфической инфекционной активности суспензии вируса бешенства штаммов L. Pasteur и CVS после хранения при температурах -20 и -80°С через 1 неделю, 1, 2, 3, 6 и 12 месяцев (срок наблюдения). В качестве контроля использовали данные по хранению вируса на протяжении 1-ой недели.

При анализе данных по хранению вирусной суспензии промышленного штамма L. Pasteur при -20ºС были получены следующие результаты. Активность вирусной суспензии через 1 неделю после замораживания при температуре -20°С составила 8,11±0,29 lg FFD₅₀ (n = 5) (рисунок 2). При сравнении данных по специфической активности вируса после 1-ого месяца хранения различия не были статистически значимыми (р ≥ 0, 05). После 2-х месяцев хранения при этой температуре активность вируса данного штамма начала снижаться (р ≤ 0, 05 ). Аналогичные данные были получены при сравнении активности вирусной суспензии после хранения на протяжении 3-х, 6-ти и 12-ти месяцев при температуре -20°С. Различия между данными по специфической активности после указанных сроков хранения были статистически значимы (р ≤ 0, 05). Через 12 месяцев хранения при температуре -20°С активность вируса штамма L. Pasteur составила 4, 75 ± 0, 19 lg FFD₅₀, что на 3, 36 lg FFD₅₀ меньше, чем данные контроля.

Рисунок 2 — Динамика изменения инфекционной активности вируса бешенства штамма L. Pasteur в ходе хранения при температурах -20°С и -80°С, * — статистически значимые различия между контролем и последующими сроками хранения; # — статистически значимые различия между каждым из сроков; $ — статистически значимые различия между показателями активности одного срока хранения, но при разных температурах

Специфическая инфекционная активность вирусной суспензии штамма L. Pasteur через 1 неделю после замораживания при температуре -80°С составила 8, 18 ± 0, 19 lg FFD₅₀ (n = 5) и не изменялась в течение 2-х месяцев (р ≥ 0, 05). Между 2-м и 3-м месяцами хранения при температуре -80°С инфекционная активность вируса начала достоверно снижаться (р ≤ 0, 05 ), как и на протяжении последующего хранения. Через 12 месяцев хранения при температуре -80°С активность вируса штамма L. Pasteur составила 5, 66 ± 0, 29 lg FFD₅₀, что на 2, 52 lg FFD₅₀ меньше, чем данные контроля. Со 2-ого по 12-й месяцы хранения при -80°С показатели инфекционной активности были достоверно выше (р ≤ 0, 05 ), по сравнению с образцами, хранившимися при -20°С.

Активность вирусной суспензии промышленного штамма CVS через 1 неделю после хранения при температуре -20°С составила 6, 78 ± 0, 19 lg FFD₅₀ (n = 5) (рисунок 3) и не изменялась до 2-х месяцев хранения (р ≥ 0, 05). Между 2-м и 3-м месяцами хранения при данной температуре произошло достоверное снижение (р ≤ 0, 05 ), активности, как и на протяжении последующего хранения. Через 12 месяцев хранения при температуре -20°С активность штамма CVS составила 4, 96 ± 0, 29 lg FFD₅₀, что на 1, 82 lg FFD₅₀ меньше, чем специфическая активность вируса при хранении в данном температурном режиме в течение недели.

Рисунок 3 — Динамика изменения инфекционной активности вируса бешенства штамма CVS в ходе хранения при температурах -20°С и -80°С, * — статистически значимые различия между контролем и последующими сроками хранения; # — статистически значимые различия между каждым из сроков; $ — статистически значимые различия между показателями активности одного срока хранения, но при разных температурах

Активность вирусной суспензии штамма CVS через 1 неделю после замораживания при температуре -80°С составила 6, 78 ± 0, 47 lg FFD₅₀ (n = 5) и не изменялась в течение 6-ти месяцев (р ≥ 0, 05). Достоверное снижение (р ≤ 0, 05) показателя активности вируса произошло между 6-м и 12-м месяцами хранения при данной температуре. После 12 месяцев хранения при температуре -80°С активность вирусной суспензии снизилась на 0,28 lg FFD₅₀ и составила 6, 5 ± 0, 19 lg FFD₅₀ по сравнению с данными контроля. С 3-ого по 12-й месяцы хранения при -80°С показатели инфекционной активности данного штамма были достоверно выше (р ≤ 0, 05 ), по сравнению с образцами, хранившимися при -20°С.

В результате проведенных исследований более низкие результаты сохранности обоих штаммов вируса были получены при хранении вирусной суспензии при температуре -20°С. Это может быть связано с тем, что эвтектическая температура солевых растворов, входящих в состав среды консервирования и ультраструктурных компонентов вирионов находится ниже -20°С, и вирионы подвергаются действию повреждающих факторов, связанных с кристаллизацией жидкой фазы, изменением рН и гиперконцентрацией электролитов [2].

Результаты исследования показали, что фиксированный штамм CVS более устойчив к хранению при низких температурах, чем штамм L. Pasteur. Предположительно, различия криоустойчивости изучавшихся промышленных штаммов вируса бешенства обусловлены особенностями строения их капсидов. Этот вопрос требует отдельного изучения.

Полученные результаты по сохранности вируса бешенства промышленных штаммов в суспензии не соответствуют требованиям производства, так как необходимо сохранение спицефической ативности вируса на протяжении более длительных сроков. Поэтому следует провести исследования по применению различных режимов замораживания вирусной суспензии и использованию различных криозащитных сред. Полученные данные, вероятно, смогут позволить хранить промышленные штаммы вируса бешенства при низких температурах более длительное время без потери их специфической активности.

Содержимое (Table of Contents)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вакцина антирабическая ФС.3.3.1.0025.15

культуральная концентрированная Взамен ГФ Х, ст.715,

очищенная инактивированная ФС 42-3447-97

Одна прививочная доза вакцины должна содержать вируса бешенства антиген специфический инактивированный, имеющий специфическую активность не менее 2,5 Международных Единиц (МЕ).

Вакцина не содержит консервантов и антибиотиков.

Вакцину выпускают в комплекте с растворителем – водой для инъекций.

Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная предназначена для профилактики бешенства.

ПРОИЗВОДСТВО

Количество пассажей полностью охарактеризованного главного посевного вирусного материала для получения рабочего посевного вирусного материала, используемого для производства вакцины, не должно превышать 5.

Рабочий посевной вирусный материал должен отвечать следующим требованиям.

Производственный штамм вируса бешенства должен нейтрализоваться иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади и не должен нейтрализоваться сывороткой крови крупного рогатого скота нормальной. Индекс нейтрализации – не менее 100.

Испытание на отсутствие микобактерий туберкулеза проводят путем посева на среду Левенштейна-Йенсена.

Не должен содержать посторонних вирусных агентов по результатам испытания на 20 мышах-сосунках, испытания на 20 беспородных белых мышах массой 15-20 г, испытания на 5 морских свинках массой 350 — 500 г, испытания на культурах клеток.

Используют здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Мышам-сосункам вводят по 0,01 мл испытуемого образца интрацеребрально и по 0,1 мл интраперитонеально, период наблюдения – 14 сут. Беспородным белым мышам вводят по 0,03 мл испытуемого образца интрацеребрально и по 0,5 мл интраперитонеально, период наблюдения – 28 сут. Морским свинкам вводят по 0,1 мл испытуемого образца интрацеребрально и по 5 мл интраперитонеально, период наблюдения – 42 сут.

Не менее 10 -6 LD₅₀/мл при интрацеребральном заражении новорожденных беспородных белых мышей массой 6–8 г.

Для производства вакцины используют первичную культуру клеток почек сирийских хомячков. Почки для получения культуры клеток забирают у клинически здоровых хомячков.

При работе с культурами клеток запрещается использовать антибиотики группы пенициллинов.

Необходимо проводить испытания производственной культуры клеток на стерильность и на отсутствие посторонних вирусных агентов путем изучения феномена гемадсорбции и цитопатических изменений на чувствительных тест-системах: культуре клеток, используемой для производства вакцины, культуре клеточной линии из другого источника, культуре диплоидных клеток человека.

При наличии гемадсорбции и (или) цитопатических изменений в контрольных культурах опыт следует повторить в клеточной культуре другой партии.

Если при повторном исследовании контрольных клеточных культур в одном из испытаний обнаружены цитопатические изменения или феномен гемадсорбции, то вирус, полученный в соответствующих зараженных культурах, не должен быть использован для производства вакцины.

Все вещества животного происхождения, используемые для получения производственной культуры клеток и культивирования вируса бешенства, проверяют на отсутствие бактерий, грибов, микоплазм и посторонних вирусных агентов. Для размножений клеток не следует применять сыворотки человеческого происхождения.

Все этапы производства должны быть валидированы.

Методы концентрации и очистки вируссодержащей жидкости указывают в нормативной документации. Допускается концентрация и очистка методом ультрафильтрации или концентрация методом ультрафильтрации с последующей очисткой методом гель-хроматографии.

Инактивацию проводят сразу после этапа очистки. При использовании физического метода инактивации отрабатывают режим инактивации: скорость подачи вируссодержащей жидкости, частоту вращения диска инактиватора, интенсивность излучения.

Запрещается использовать в производстве антибиотики после технологического этапа сбора вируссодержащей культуральной жидкости.

В качестве стабилизаторов используют разрешенные вещества, указанные в нормативной документации.

Испытание полуфабриката на стерильность проводят на стадии получения объединенного полуфабриката после этапа концентрации и очистки (до инактивации), после этапа инактивации, после добавления в вакцину стабилизаторов (испытывают смесь для лиофилизации), в процессе розлива.

Испытание полуфабриката на отсутствие микоплазм проводят на стадии получения объединенного полуфабриката после этапа концентрации и очистки (до инактивации), после этапа инактивации.

При использовании дополнительного метода инактивации формальдегидом в полуфабрикате определяют остаточное количество формальдегида. Содержание формальдегида в полуфабрикате – не более 60 мкг/мл.

ИСПЫТАНИЯ

Пористая масса белого цвета, гигроскопична. Определяют визуально.

Должна полностью растворяться в течение 5 мин при внесении 1 мл растворителя (вода для инъекций) на 1 дозу вакцины. Определение проводят визуально.

Вакцина не должна содержать живой вирус бешенства.

Для определения специфической безопасности проводят пассаж вакцины в первичной культуре клеток почек сирийских хомячков. В 2 флакона, содержащие питательную среду с гидролизатом лактальбумина (0,5 %) в растворе Хенкса для культур клеток, вносят по 200 мл клеточной взвеси, содержащей 300-600 тыс клеток/мл. В среду добавляют 10 % раствор сыворотки крови крупного рогатого скота жидкой.

В качестве контроля используют 2 флакона с незараженной первичной культурой клеток почек сирийских хомячков.

Объем и концентрация клеток, вносимых в опытные и контрольные флаконы, должны быть одинаковыми.

Культуру инкубируют в течение 5-6 сут при температуре (36 ± 1) ºС. Затем отбирают флаконы с полностью сформировавшимся клеточным монослоем. Для испытания на специфическую безопасность от каждой серии отбирают по 25 ампул с препаратом. В каждую ампулу вносят по 1 мл растворителя. Восстановленную вакцину объединяют в одну емкость. Из отобранных флаконов с культурой клеток сливают культуральную жидкость. В каждый опытный флакон вносят по 12,5 мл растворенной вакцины, 2 незараженных флакона оставляют (контрольные). Все флаконы инкубируют при температуре (36 ± 1) о С в течение 90 мин, после чего в опытные и контрольные флаконы вносят по 200 мл питательной среды с гидролизатом лактальбумина (0,5 %) в растворе Хенкса для культур клеток. В поддерживающую среду добавляют 5 % СКРС и канамицин до конечной концентрации 100 мкг/мл или 4 % раствор для инъекций гентамицина сульфата до конечной концентрации 80 мкг/мл. На -8 сут инкубации при температуре (32 ± 1) о С из каждого опытного флакона отбирают по 5 мл культуральной жидкости, смешивают пробы и вводят в головной мозг по 0,03 мл смеси 10 беспородным мышам массой от 6 до 7 г.

Аналогично испытывают культуральную жидкость из контрольных флаконов.

За животными наблюдают 21 сут. За весь период наблюдения не должно регистрироваться ни одного случая смерти от бешенства животного, получившего культуральную жидкость из опытных флаконов. Диагноз устанавливают на основании результатов иммунофлуоресценции (РИФ).

В случае, если в опытной группе зарегистрирована неспецифическая гибель (в первые 4 сут наблюдения) более 2 мышей, испытание повторяют.

При появлении хотя бы у 1 мыши клинических признаков бешенства (тремор конечностей, атаксия, паралич) или при гибели более 2 мышей без клинических признаков заболевания, начиная с 5 сут наблюдения, головной мозг павших животных исследуют методом иммунофлуоресценции. При получении положительных результатов серию считают не выдержавшей испытания; при получении отрицательного результата проводят повторный контроль на удвоенном количестве образцов вакцины и удвоенном количестве мышей.

В случае отрицательного результата при повторном испытании считают, что вакцина не содержит живого вакцинного вируса бешенства. В случае регистрации при повторном контроле хотя бы у 1 мыши клинических признаков бешенства, подтвержденного иммунофлуоресценцией, испытуемую серию вакцины считают не выдержавшей испытания.

Не менее 2,5 Международных Единиц (МЕ) в 1 дозе.

Определение специфической активности проводят по методике Национального института здоровья США (NIH). Специфическую активность испытуемой вакцины определяют в сравнении со стандартным образцом (СО) специфической активности вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной, калиброванным по отношению к Международному стандарту антирабической вакцины. Для определения специфической активности от серии отбирают не менее 3 ампул на каждую иммунизацию.

В каждую ампулу вносят растворитель из расчета 1 мл на 1 дозу вакцины. Полученные растворы объединяют и готовят ряд разведений с пятикратным интервалом в соотношении 1:5; 1:25; 1:125; 1:625; 1:3125 на
0,9 % стерильном растворе натрия хлорида или на среде 199, содержащей
0,1 % альбумина. Разведения, используемые для иммунизации животных, указывают в нормативной документации.

Аналогичным образом готовят разведения стандартного образца, предварительно восстановленного водой для инъекций до содержания 1 МЕ
в 1 мл.

Пробирки с разведенной вакциной и стандартным образцом хранят на льду в течение времени постановки опыта, но не более 4 ч.

Одновременно с заражением иммунизированных мышей на неиммунизированных мышах из контрольной группы проводят титрование фиксированного вируса бешенства штамм CVS для определения точной дозы вируса, взятой в испытание. Для этого используют разрешающее (рабочее) разведение вируса (10 0 ) и его десятикратные разведения (10 -1 ; 10 -2 ; 10 -3 ) на

2 % растворе сыворотки крови лошади нормальной, приготовленном с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций. Сыворотку крови лошади нормальную предварительно инактивируют при температуре 56 о С в течение 30 мин. Каждым разведением вируса заражают не менее чем по 10 мышей интрацеребрально в объеме 0,03 мл.

За мышами наблюдают в течение 14 сут. При оценке результатов опыта учитывают мышей, заболевших или павших с 5 по 14 сут. Учет проводят ежедневно. Клиническими симптомами на разных стадиях развития заболевания могут быть: взъерошенная шерсть, замедленные и/или круговые движения, дрожание, парез, параличи.

После окончания опыта вычисляют точное количество вируса, содержащееся в 0,03 мл разрешающего разведения, по методу Рида и Менча.

Рассчитывают конечные разведения вакцины и стандартного образца, защищающие 50 % животных (КР₅₀), по следующей формуле:

Т – показатель степени десятичного логарифма;

А – логарифм обратной величины разведения, при котором смертность животных ниже 50 %;

В – показатель смертности животных ниже 50 %;

С – показатель смертности животных выше 50 %;

Д – логарифм кратности разведения.

Специфическую активность испытуемой вакцины (СА) определяют в МЕ относительно специфической активности стандартного образца по формуле:

К – величина, обратная КР₅₀ испытуемой вакцины;

М – величина, обратная КР₅₀ стандартного образца;

У – количество МЕ в 1 мл восстановленного стандартного образца (1 МЕ);

В том случае, когда при проведении испытания специфическая активность вакцины менее нормативных требований, допускается проведение повторного испытания.

В нормативной документации указывают растворитель и методику, по которой проводят испытания растворителя.