Что такое тест-системы для диагностики вирусных инфекций

УДК: 616.61-036.22:578.7(047.3)(476), 578.4(047.3)(476)
Год издания: 2015

Разработка ПЦР тест-системы для диагностики BK вирусной инфекции

Следует отметить, что зарубежные тест-системы для генодиагностических исследований BK вирусной инфекции имеют достаточно высокую стоимость, что делает их мало доступными для практического здравоохранения. В этих условиях создание отечественной количественной ПЦР тест-системы для диагностики данной инфекции и оценки уровня вирусной нагрузки у пациентов является сегодня актуальной задачей.

Разработку осуществили в несколько этапов, начиная с подбора праймеров, и заканчивая определением аналитических характеристик тест-системы.

Исходя из биологии BK вируса и анализа научной литературы по данной проблеме разработано 2 набора праймеров и зондов, локализованных в различных регионах его генома. Праймеры подобраны к наиболее консервативным участкам генома BK вируса и обозначены как BK-VP3 и BK-T, так как локализованы в участках генома, кодирующих капсидный белок VP3 и большой Т-антиген.

Выполнена оптимизация реакции ПЦР, которая включала два этапа: оптимизацию состава реакционной смеси (ПЦР-буфер, концентрация MgCl₂) и подбор условий проведения реакции (температурный профиль и длительность каждого из сегментов цикла).

В качестве положительного контроля и количественного ДНК-стандарта для разработанной тест-системы на базе вектора pUC18 создана плазмида pBK-1,2VT, содержащая вставку размером 1228 пар оснований, кодирующая фрагменты-мишени для обоих наборов разработанных диагностических праймеров.

Концентрацию очищенного препарата плазмиды измеряли спектрофотометрически и определяли число молекул плазмиды. Из исходного препарата pBK-1,2VT готовили серию 10-кратных разведений с концентрацией ДНК от 1х10 6 до 1 ГЭ/мкл. Полученные разведения использовали в качестве матрицы в реакции с праймерами для изучения аналитической чувствительности тест-системы и приготовления ДНК-стандартов. Полученные результаты показали, что порог чувствительности набора в отношении BK вирусов был менее 10 копий/мкл. В качестве ДНК-стандартов выбраны две стандартные концентрации ДНК: 1х10 4 и 10 копий/мкл. Данные стандарты будут использованы как калибраторы при проведении количественной ПЦР для определения уровней ВК вирусной нагрузки в организме пациентов.

Изучение диагностической специфичности и чувствительности разработанной тест-системы проводили в параллельных исследованиях клинического материала - 46 проб клинического материала (24 пробы мочи и 22 пробы сыворотки крови), в которых ранее мультиплексной ПЦР с системой праймеров для выявления BK и JC вирусов было (в 8 пробах) или не было обнаружено (в 38 пробах) наличие ДНК BK и JC вирусов. При использовании созданной тест-системы BK вирус был выявлен во всех 8 положительных пробах. В установленных ранее 32 отрицательных пробах вирус не определялся.

Таким образом, разработанная тест-система для детекции ДНК BK вируса выявила все отобранные положительные и отрицательные пробы без ложноположительных и ложноотрицательных результатов, что указывает на ее 100% диагностическую чувствительность и специфичность.

В ходе полевых испытаний тест-системы с использованием 466 образцов клинического материала, полученного в период с 2011 по 2014 гг. от реципиентов почки, выявлено 42 положительных пробы с уровнем вирусной нагрузки, варьировавшей от 4,2х10 7 до 1,3х10 4 копий/мл.

Созданная ПЦР тест-система для количественного выявления ВК вируса в клиническом материале не имеет аналогов в Беларуси и сопредельных странах-членах ЕАЭС, что указывает на хорошие перспективы ее востребованности на отечественном и зарубежном рынках диагностических средств. Актуальность данной разработки очевидна в связи с активным развитием трансплантации органов и тканей в последние годы. Кроме того, она может найти широкое использование для диагностики полиомавирусных осложнений при ряде заболеваний, сопровождающихся иммунодефицитными состояниями, с целью количественной оценки уровня ВК вирусной нагрузки и коррекции проводимой терапии (например, в онкологии, при обследовании пациентов со СПИД и др.).

Область применения: лабораторная диагностика вирусных инфекций, трансплантология, онкология.
Рекомендации по использованию: разработанная тест-система рекомендуется для использования в специализированных лабораториях учреждений здравоохранения республки, занимающихся диагностикой вирусных инфекций.
Предложения по сотрудничеству: консультативная и техническая помощь по лабораторной диагностике полиомавирусных инфекций, молекулярному типированию, дифференциации возбудителей и биоинформационному анализу полученных результатов.

ОРВИ и грипп имеют респираторные симптомы и общие. Их можно распознать по катаральным признакам со стороны дыхательных путей и общей симптоматике, характерной для большинства заболеваний.

Современные методы диагностики данной группы заболеваний

Различают несколько видов диагностики, которые различаются по особенностям проведения и методу выявления возбудителя. Это:

• экспресс-методы;
• серологическая диагностика;
• вирусологическая диагностика.

Первая группа - экспресс-методики. Это быстрый способ подтвердить или исключить наличие болезни. Используется метод флюоресценции и ПЦР. Рассмотрим их подробнее.

Изучение флюоресцирующих антител - МФА. Способ основан на определении антигенов к вирусу в эпителиальных клетках носовой слизистой, на конъюнктиве (если есть глазные поражения). Антитела при действии антигена реагируют специфическим свечением, которое легко заметить при микроскопическом исследовании. Этот параметр считается маркером диагностики и является основой для подтверждения результата. Способ имеет диагностическую ценность начиная с 3 и заканчивая 5 днем заболевания. Чувствителен к таким антигенам: вирус гриппа типа А, В, вирус парагриппа, аденовирусы и возбудитель РС-инфекции. Это удобный и быстрый метод, не требующий особых ресурсов, который часто применяется в ходе диагностики.

Метод полимеразно-цепной реакции базируется на основе обнаружения участков нуклеиновых кислот генетического материала вируса и определении их групповой принадлежности по этому критерию. Методика имеет высокую диагностическую ценность, является современным и качественным способом подтверждения заболевания. Считается “золотым стандартом” диагностики, так как не дает ложных результатов и является специфическим для определения конкретных патогенов, широко применяется в стационарных и амбулаторных условиях.

Вирусологические методики основаны на чистом выделении вирусных микроорганизмов и их конкретных штаммов, за чем следует их прикрепление к клеточным культурам в лабораторных условиях. Далее следует определение вида вируса с помощью ПЦР или других реакций. Метод требует значительных ресурсов, довольно длительный и трудоемкий. Его ценность заключается в получении эпидемиологических данных и основе для научных работ. То есть, детальное изучение вируса, частоты его распространения позволяет прогнозировать эпидемическую картину, создавать вакцины. Для исследования берется мазок из носа и носоглотки. Материал пригоден в течении 3-5 дня заболевания. С помощью вирусологических методов можно определить такие возбудители:

Серологические методы диагностики - это ретроспективное исследование, которое дает точные данные относительно стадии процесса, степени активности и типа возбудителя. Используется для эпидемиологических целей.

Для анализа используется сыворотка крови, в которой необходимо определить количество и виды антител. Используется известный антиген вируса. При возникновении реакции с материалом пациента формируются иммунные комплексы антиген-антитело, что подтверждает диагноз. Для диагностики также важен прирост титра антител, для чего используются парные сыворотки.

Результат имеет высокую точность и может определиться даже если все другие методы не дали результата, так как имеет высокую чувствительность. особенно важно использование метода для стертых форм с минимальными клиническими проявлениями. Сыворотки для анализа берутся в начале болезни, а также через 10-14 дней после её завершения. Используется метод для подтверждения наличия в организме таких возбудителей: вирусы гриппа А, В, возбудители парагриппа, аденовирусы и РС-вирусы.

Наличие вируса гриппа можно подтвердить с помощью РТГА - реакции торможения геммааглютинации. Метод основан на свойстве снижения гемагглютинирующих способностях вируса, если в крови есть антитела к нему. Для этого используется кровь с эритроцитами, антиген. Препараты крови берутся парными, в начале болезни, и в период выздоровления. Метод имеет высокую диагностическую ценность, точный и чувствительный.

Виды исследуемого материала и особенности сдачи

Для диагностики используются смывы из носа, мазки из носовых ходов, носоглотки, а также препараты крови.

Забор мазка и смыва проводит медицинский персонал. Он следит за тем, чтобы препараты строго соответствовали должной локализации. Забор проходит в чистых условиях, стерильными инструментами и в стерильную тару. До того, как взять мазки пациента просят высморкаться, чтобы очистить носовые ходы от слизи. Зонд вводится легко, на глубину 2-3 см. Проводится стандартное движение по нижней части носового хода и под раковиной носа. Необходимо, чтобы забор происходит в современной клинике, где есть возможность правильно хранить и транспортировать собранный материал в короткий срок до лаборатории.

Мазок из глотки берется по похожей методике, чтобы затронуть те участки слизистой, на которой скапливается возбудитель. Перед забором необходимо легко прополоскать рот, чтобы взятый материал был чистым. Желательно забирать материал на 3-й день после начал болезни.

Нормы и отклонения от них, расшифровка результатов

Экспресс-тест дает результаты сразу после диагностики, его расшифровка не вызывает трудностей, так как определяет наличие вируса или его отсутствие в организме.

Серологические реакции более сложные и могут расшифровываться по разному: наличие антител класса М говорит об острой стадии процесса, антитела G формируются при хроническом течении.

Сроки готовности результатов

Результаты исследования готовы на 1-2 день после сдачи. Экспресс-тест дает результат сразу. Серологические методы требуют больше затрат времени для сравнения титров антител. Более быстрые методы важны для диагностического процесса, а те, что более затратны - для эпидемиологического и научного исследования.

Скорость диагностики зависит от правильности сдачи препаратов, условий лаборатории, качества реактивов.

Вовремя сданный анализ позволяет точно и быстро определить диагноз. Это - залог правильного и эффективного лечения. Если болезнь запустить, она грозит осложнениями, которые особенно опасны, если у человека грипп. Это актуально для детей, пожилых людей, беременных женщин и лиц с дефицитом иммунной системы, ведь осложнения чаще всего проявляются у них.

Лаборатория АО "СЗЦДМ" предлагает услуги, обеспечивающие комплексное и преемственное лабораторное обследование пациента

Диагностика В медицинских центрах АО "СЗЦДМ" проводят качественные диагностические исследования всего организма

Лечение Наши медицинские центры ориентированы на обслуживание пациентов в амбулаторном режиме и объединены единым подходом к обследованию и лечению пациентов.

Реабилитация Реабилитация - это действия, направленные на всестороннюю помощь больному человеку или инвалиду для достижения им максимально возможной полноценности, в том числе и социальной или экономической.

Выезд на дом Внимание! Действует акция "Выезд на дом - 0 рублей"

Профосмотры АО "СЗЦДМ" проводит профилактические осмотры работников, которые включают в себя - комплексы лечебных и профилактических мероприятий, проводимых для выявления отклонений в состоянии здоровья, профилактики развития и распространения заболеваний.

Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.

Что предлагает ВОЗ

Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.

Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.

Как работает ПЦР-тест

Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.

Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.

В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.

Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.

Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.

Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.

Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.

Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.

На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.

По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.

Новые разработки за рубежом

Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.

Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.

Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.

FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.

Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.

Фоновое изображение: Realstock | Shutterstock.com

Что должен включать набор для выявления РНК коронавируса в образцах? Три компонента: реагенты для экстракции РНК, реагенты для обратной транскрипции, то есть перевода РНК в ДНК, и реагенты для ПЦР. Последний компонент состоит из ферментов, буфера и праймеров — олигонуклеотидов, комплементарных каким-либо последовательностям генома коронавируса.

Однако обычно тест-системы включают еще и внутренний контрольный образец — молекулу РНК, защищенную от действия нуклеаз, которую при анализе добавляют в образец на первой стадии — стадии выделения, чтобы она вместе с мишенью проходила все этапы лабораторного исследования и в конце дала свой собственный сигнал, который покажет, что на всех этапах все было хорошо.

У уже зарегистрированного набора ЦСП чувствительность как раз 10 3 в мазках со слизистой (так указано в инструкции к набору, которая имеется в распоряжении редакции). По нашей информации, примерно такой же чувствительности добиваются в разработке НИЦ им. Н.Ф. Гамалеи.

Чем плоха низкая чувствительность? Возможна ситуация, когда пациент явно инфицирован, но концентрация вируса в пробе у него ниже, чем 10 5 . В этом случае результат тестирования будет отрицательным. Тест не выявит начало заболевания, либо слишком рано будет принято решение о том, что выздоравливающий пациент больше не выделяет вирусы и не может никого инфицировать. А он ходит по улице, и он заразен. (По данным китайских исследователей, выделение вируса может продолжаться до 37 дней.)

С ложноотрицательными результатами теста разобрались. Теперь о ложноположительных срабатываниях, то есть о специфичности. Любой тест может показывать у некоторого числа здоровых людей заболевание. В спокойной обстановке в этом нет ничего страшного, поскольку можно десять раз перепроверить анализы у каждого пациента. Совсем другое дело — ситуация эпидемии. В этом случае диагностика опять выдает управленческим структурам недостоверную информацию о количестве инфицированных, принимается решение о проведении клинических и лечебных мероприятий в отношении пациентов, которые вообще не болеют. Ресурсы здравоохранения направляются на ложные цели.

Однако это вопрос про праймеры для реакции амплификации. Если праймеры специфичны именно к этому вирусу, то все хорошо, если же праймеры могут отжигаться на нецелевую мишень, то получим ложнопозитивный результат. К сожалению, саму последовательность праймеров многие разработчики — не все — держат в секрете, поэтому редакция не располагает информацией, на гены каких именно белков и на какие участки этих генов они созданы.

С другой стороны, ВОЗ пишет, что в настоящее время известно о циркуляции среди населения четырех сезонных коронавирусов (HCoV-229E, -OC43, -NL63 и -HKU1), которые, как правило, вызывают заболевания верхних дыхательных путей — от легких до средней тяжести. Поэтому испытания теста должны проводиться на как можно более широкой панели, чтобы отсечь ложные срабатывания. Желательно, чтобы образцы были от пациентов, либо в панель должны быть включены вирусы, генетически наиболее близкие этому коронавирусу и достаточно широко распространенные.

Сколько именно неспецифичных срабатываний дает тест, сказать нельзя, но из общих соображений эксперты называют цифру до 10%.

По тест-системам, разрабатываемым другими группами, у редакции достоверной информации нет.

Теперь самый болезненный для общества вопрос: какие структуры могут диагностировать коронавирус SARS-CoV-2 в России? И вопрос, который следует из первого: будут ли использованы разработки тех организаций, которые мы перечислили выше?

Что это значит? Это значит, что СанПин позволяет работать с вирусами из II группы методом ПЦР в условиях III–IV группы. Так, например, работают по всей стране с ВИЧ, который тоже отнесен ко II группе. В том случае, если опасный патоген не собираются наращивать в культуре или инфицировать им лабораторных животных, а исследуют его генетический материал, пробирку с образцом открывают в ламинарном шкафу и добавляют в нее вещество, разрушающее вирус (например, гуанидинизотиоцианат). После этого фактически речь идет не о вирусе, а о его белках, ДНК или РНК.

Тем не менее сейчас круг лабораторий, которые могут диагностировать инфекцию SARS-CoV-2, ограничен Роспотребнадзором.

Понятно, что если коммерческие лаборатории в России захотят проводить тестирование на SARS-CoV-2, то они смогут воспользоваться любой тест-системой, которая получит регистрационное удостоверение. Однако неясно, как в этом случае будет выстраиваться взаимодействие с системой Роспотребнадзора.

Отсутствие конкуренции — это рай?

Когда в мире произошла вспышка атипичной пневмонии, в 2003 году четыре организации в России разработали ПЦР-тесты на выявление возбудителя — коронавируса SARS-CoV. Роспотребнадзор издал приказ о сравнительных испытаниях. Был очень быстро получен вирус, и все разработчики могли испытывать на нем свои системы. Сравнительные испытания проводились в 48 ЦНИИ МО РФ, панели контрольных образцов были зашифрованы. Затем результаты всех тестов вскрыли и сравнили.

Довольно большая разница с тем, что происходит сейчас, не так ли?

Все наши источники сходятся в том, что нужно дать возможность работать с клиническим материалом и применять свои тест-системы и государственным и коммерческим игрокам этого рынка. Но сейчас в условиях распространяющейся эпидемии только структуры Роспотребнадзора (и то не все) имеют эксклюзивное право на получение всех федеральных денег по этой тематике на исследования, разработку вакцин и тестирование препаратов, диагностику всех инфекционных материалов в сети своих организаций.

Как мы написали выше, мы не получили ответа от Роспотребнадзора на наш официальный запрос на информацию. В таком же положении находятся все СМИ в стране. Но мы открыты к сотрудничеству и с удовольствием опубликуем ответы на наши вопросы. Предварительно проверив, разумеется.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

Название Создание высокочувствительных тест-систем для одновременной экспресс-диагностики широкого спектра болезней картофеля на основе qPCR-матриц длительного хранения с возможностью быстрой оптимизации архитектуры матрицы в соответствии с запросами регионального потребителя

Руководитель Приданников Михаил Викторович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии", Московская обл

Года выполнения при поддержке РНФ 2016 - 2018

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые слова ПЦР в реальном времени, qPCR матрица, мультиплексный анализ, диагностика болезней картофеля, вирусы и вироиды картофеля, фитоплазма, картофельные нематоды, Phytophthora infestans, Alternaria sp., Dickeya solani, Ralstonia solanacearum, Erwinia sp., Clavibacter sp., Pectobacterium sp., Rhizoctonia solani

Код ГРНТИ 68.37.31

Статус Успешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Ожидаемые результаты
Ожидаемые результаты: 1) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики вирусных и вироидных болезней картофеля (PLRV, PMTV, PVХ, PVA, PVM, PVY, PVYn, PVS, PSTV). 2) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики грибных и оомицетных патогенов картофеля (Phytophthora infestans, Alternaria solani, A. alternatа, Synchytrium endobioticum, Rhizoctonia solani, Fusarim sp.). 3) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики бактериальных болезней картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum, Dickeya sp., Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Ralstonia solanaceaum). 4) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики фитоплазменных болезней картофеля (Candidatus liberibacter, 16 Sr I, 16 Sr III, 16 Sr VI). 5) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики нематодных болезней картофеля (Globodera rostоchiensis, Meloidogyne hapla, Ditylenchus destructor, и внешние карантинные объекты G. pallida, M. chitwoodi, M. fallax, M. enterolobii). 6) Будет выполнен переход на 48-луночный формат qPCR-матрицы, позволяющий увеличить количество одновременно тестируемых патогенов. 7) На основании данных фитосанитарного мониторинга посадок картофеля в различных регионах РФ будет проведено картирование распространенности и вредоносности экономически значимых болезней картофеля, на основании которого будут предложены различные варианты локализации разрабатываемых диагностических тест-систем в соответствии с потребностями регионов. 8) Будут разработаны методические указания по диагностике болезней картофеля различной этиологии с использованием предлагаемых диагностических тест-систем. 9) Будут подготовлены не менее 12 публикаций, из них 8 – в журналах, индексируемых в Web of Science/Scopus и 4 – в журналах, индексируемых в РИНЦ/Google Scholar. Результаты выполнения работ по проекту будут представлены на международных конференциях. 10) На базе ВНИИ фитопатологии будет организована и проведена научно-практическая конференция (с участием не менее 10 юридических лиц – сельскохозяйственных предприятий), в рамках которой будут представлены итоговые результаты проекта. В предлагаемом проекте предполагается максимально расширить спектр диагностируемых фитопатогенов картофеля, включив в них патогенные микроорганизмы, которые отсутствуют в предлагаемых на рынке коммерческих диагностических наборах, но в последние годы приобретают важное экономическое значение (Dikeya solani, фитоплазмы, некротическая форма вируса картофеля Y). На основании биоинформатического анализа ДНК включенных в проект фитопатогенов будут подобраны уникальные праймеры и оптимальные условия проведения qПЦР-анализа. Помимо тест-систем для диагностики вирусных/вироидных, бактериальных, фитоплазменных и грибных болезней картофеля, будет разработана тест-система для диагностики нематодных болезней картофеля, включающая не только распространенные на территории РФ патогенные нематоды картофеля (Globodera rostоchiensis, Meloidogyne hapla, Ditylenchus destructor), но и объекты внешнего карантина (G. pallida, M. chitwoodi, M. fallax, M. enterolobii). Такие тест-системы будут востребованными российской службой карантина; а также могут вызвать интерес сельскохозяйственных служб стран, в которых упомянутые внешние карантинные объекты наносят реальный ущерб сельскому хозяйству. Будут проанализированы данные Россельхознадзора и ВНИИ фитопатологии по фитосанитарному мониторингу посадок картофеля в различных регионах, а также собрана информация о потребностях и запросах региональных производителей картофеля в отношении диагностических тест-систем. На основании полученных результатов будет выполнено картирование распространенности наиболее вредоносных фитопатогенов картофеля, включая те, экономическое значение которых в последние годы в ряде регионов значительно выросло (Dickeya solani, фитоплазмы), что позволит осуществить локализацию разрабатываемых тест-систем в соответствии с нуждами и запросами потребителей путем изменения архитектуры qPCR-матриц. Практическим результатом проекта станет разработка и внедрение новых диагностических тест-систем длительного хранения, обладающих уникальными характеристиками по совокупности таких показателей как стоимость анализа, чувствительность, специфичность, количество одновременно определяемых патогенов, а также простота и удобство проведения анализа. Кроме того, будет проведена локализация этих тест-систем в соответствии с нуждами каждого конкретного региона; в перспективе такая локализация может быть выполнена и для зарубежных потребителей. К настоящему моменту в мире не существует аналогов предлагаемой тест-системе даже на уровне лабораторных исследований, не говоря уже о практическом производстве. Таким образом, практические результаты проекта будут отвечать мировому уровню значимости. Кроме того, поскольку некоторые включенные в исследование патогены вредоносны не только для картофеля, но и для других культур, то в перспективе наработки, полученные в ходе выполнения проекта, могут быть востребованы и в других секторах сельского хозяйства в создании аналогичных тест-систем для других сельскохозяйственных культур.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В течение первого года работы по проекту были достигнуты следующие результаты: А) При помощи программы Oligo 6 и баз данных GenBank и BLAST были подобраны уникальные праймеры для диагностики методом ПЦР или ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией следующих патогенов: 1) Золотистая нематода Globodera rostochiensis Прямой праймер: GCGCAGATATGCTAACATG Обратный: GGCACGGGTCCTAACAC Зонд: [FAM]CAGACATGCCGCAAGGTACG[BHQ1] 2) Некротическая форма вируса Y картофеля (PVYntn) Прямой: TGGCAACTTACACATCAACA Обратный : CGCAATCTGGACATCAGT Зонд: [ROX] CATCTCCAAACTTGCGAAGGG [BHQ2] 3) Вироид веретеновидности клубней (PSTVd) Прямой: GGTTCACACCTGACCTCC Обратный: CTTCAGTTGTTTCCACCG Зонд: [FAM]AGTAGCCGAAGCGACAGCG[BHQ1] 4) Вирус S картофеля (PVS) Прямой: CGAACACCGAGCAAATG Обратный : GAACTCCACGGTCCCAG Зонд: [FAM]TCCCTACTGAACACGTTGCTG [BHQ1] Б) Для всех перечисленных выше тест-систем выполнена оптимизация состава амплификационной смеси и подтверждена возможность применения в универсальном режиме амплификации, т.е. возможность их одновременного использования на одной и той же матрице. В) Для всех перечисленных выше тест-систем была проведена лабораторная проверка специфичности детекции с использованием референтных образцов и оценка предела аналитической чувствительности метода. Полученные результаты подтвердили высокую специфичность используемых праймеров, позволяющую уверенно диагностировать присутствие целевой ДНК или РНК в присутствии генетического материала фитопатогенных микроорганизмов той же группы, а также ДНК растения-хозяина (картофеля). Проведенные испытания показали, что для всех перечисленных выше тест-систем концентрационный предел обнаружения целевой ДНК в пробе составляет 1 нг ДНК(РНК)/мл. Г) Выполнена сравнительная оценка аналитической чувствительности диагностических тест-систем для обнаружения вирусных и вироидных патогенов картофеля при переходе с 30-луночного на 48-луночный формат qPCR-матриц. Показано, что связанное с таким переходом уменьшение объема реакционной смеси до 1 мкл не привело к ухудшению аналитической чувствительности систем.

1. Малько А.M., Живых А.В., Никитин М.М., Французов П.А., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. Мониторинг вирусных инфекций картофеля с использованием матричной ПЦР-диагностики Картофель и овощи, № 12, с. 26-29 (год публикации - 2017).

2. Никитин М.М., Дейч К.О., Павлова Е.А., Иванов А.В., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. Выявление и идентификация возбудителя порошистой парши картофеля Spongospora subterranea методом ПЦР в реальном времени Защита и карантин растений, - (год публикации - 2018).