Что такое ингибирование гепатита с

VIRAL HEPATITIS C MODERN STRATEGYES OF TREATMENT USING PROTHEASE AND POLIMERASE INHIBITORS

Volgograd State Medical University

Ключевые слова: вирусный гепатит С, трехкомпонентная противовирусная терапия, ингибиторы протеазы, ингибиторы полимеразы, безинтерфероновые схемы терапии, терапия без рибавирина.

Key words: viral hepatitis C, three-therapy antiviral treatment, prothease inhibitors, polymerase inhibitors, treatment schemes without interferon

Вирусный гепатит С (ВГС) на сегодняшний день представляет важную медико-биологическую и социальную проблему, и занимает доминирующее место среди вирусных гепатитов. В настоящее время в мире насчитывается более 350 млн носителей вирусного гепатита С, при этом в подавляющем большинстве случаев заболевание приобретает хронический характер [1]. Инфицирование вирусом гепатита С характеризуются развитием вторичных заболеваний (цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома) и синдромов (лейкопения, депрессия и др.), что приводит к неблагоприятным исходам [1,4,6].

В последние 40 лет в мире происходил интенсивный поиск этиотропной терапии острых и хронических вирусных гепатитов. Во многих странах мира создавались и изучались препараты, направленные на подавление репликации вирусов гепатита и их элиминацию. В настоящее время предложено несколько групп противовирусных препаратов, обладающих доказанно высокой противовирусной эффективностью: рекомбинантные и пегилированные интерфероны-альфа, аналоги нуклеозидов, а также ингибиторы протеаз и ингибиторы полимераз, которые действуют на молекулярном уровне и обеспечивают полное торможение репликации вируса гепатита С [1,2,6,7].

Интерфероны:

Интерфероны (ИФН) – группа гликопротеинов с возможностью активации (депрессии) клеточных генов, в результате чего синтезируются белки, ингибирующие синтез вирусной РНК, и иммуномодулирующим эффектом – усилением экспрессии антигенов HLA на клеточных мембранах и увеличением активности цитотоксических Т-клеток и естественных киллеров.

Существует 3 иммунологически различных класса ИФН: ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ. К ИФН естественного происхождения относятся лимфобластоидный и лейкоцитарный ИФН (ИФН-α), синтезируемые соответственно стимулированными моноцитами и В-лимфоцитами человека, которые затем экстрагируются и очищаются, фибробластный ИФН (ИФН-β), получаемый из культуры фибробластов человека и Т-лимфоцитарный ИФН (ИФН-γ). К искусственно синтезируемым ИФН относится подтип ИФН-α, получаемый по рекомбинантной молекулярной технологии [2,4].

На рубеже тысячелетий, в 2000 г., в клиническую практику вошли конъюгированные препараты ИФН-α пролонгированного действия - ПЕГ-ИФН-α (коммерческие названия препаратов: Пегасис; Hoffmann la Roche LTD, Швейцария; ПегИнтрон; Merck & Co., Inc., США и др.). Пегасис – препарат ПЕГ-ИФН-α-2а, соединенный с молекулой полиэтиленгликоля с общей молекулярной массой 40 000 Да, ПегИнтрон – препарат ПЕГ-ИФН-α-2b, объединенный с молекулой полиэтиленгликоля с молекулярной массой 12 000 Да [1,2,4,6].

Появление ПЕГ-ИФН-α достоверно повысило устойчивый вирусологический ответ (УВО) при лечении вирусных гепатитов [1,2,6]. Объединение молекулы ИФН-α с молекулой полиэтиленгликоля привело к увеличению периода полувыведения данных препаратов за счет снижения скорости клиренса. В результате увеличилась длительность действия и уменьшились колебания концентрации ПЕГ-ИФН-α в крови, что способствует повышению их противовирусной активности. Важное преимущество современных ПЕГ-ИФН-α перед короткоживущими рекомбинантными ИФН-α – возможность их использования при циррозах печени [6]. Кроме того, ПЕГ-ИФН-α обладают меньшей антигенностью, они могут применяться у больных с кардиологическими заболеваниями, нарушениями функции почек и гемоглобинопатиями [1,6]. При использовании ПЕГ-ИФН-α доза препарата рассчитывается с учетом веса каждого пациента. Введение осуществляется подкожно в средней дозе 1,5 мкг/кг массы тела (при весе пациента 70 кг) один раз в 7 дней в течение 6-12 месяцев [1,2,4,6].

На фоне проводимой терапии всеми типами ИФН-α наблюдаются побочные эффекты. Часто отмечается гриппоподобный синдром (лихорадка, озноб, головные боли, миалгии), развивающийся в первые недели лечения. Кроме того, наблюдаются лейкопения, тромбоцитопения (менее 70х10 9 / л), слабость, развитие тиреотоксикоза, депрессивных состояний [1,6].

Оценка эффективности ИФН-терапии проводится в соответствии с тестами контроля за лечением хронического вирусного гепатита: устранением маркеров фазы репликации вируса гепатита С, морфологическим изменением ткани печени по данным биопсии и эластографии печени до и после курса лечения, нормализацией уровня трансаминаз [1,4].

Аналоги нуклеозидов:

Аналоги нуклеозидов – это группа средств, проявляющих свое действие в отношении генома вирусов гепатита.

Ингибиторы протеазы и полимеразы:

Детальное изучение биологической структуры вируса гепатита C позволило выделить ряд целевых мишеней – белков, принимающих участие в механизмах репликации вируса. Среди этих белков-мишеней ключевыми оказались протеаза NS3/4A, а также полимеразы NS5A и NS5B вируса гепатита С.

Ингибиторы протеазы NS3/4A являются основой для этиотропной терапии вирусного гепатита С. Протеаза NS3/NS4A необходима для репликации вируса при пост-трансляционной обработке. Ингибиторы протеазы проникают в инфицированные вирусом клетки и блокируют активность вирусного фермента протеазы, препятствуя расщеплению вирусного белка на структурные компоненты, необходимые ВГС для образования новых копий.

Ингибиторы полимеразы оказывают воздействие на вирусные белки. Белок NS5A принимает участие в репликации ВГС, являясь компонентом репликационного комплекса. Подавление его активности приводит к подавлению активности вируса гепатита С. Фермент NS5B имеет в высокой степени схожую структуру при всех генотипах ВГС, благодаря чему является идеальной мишенью для лекарственной терапии. Ингибиторы полимеразы можно разделить на два класса: аналоги нуклеозидов/нуклеотидов и ненуклеозидные ингибиторы.

Разработка системы субгеномной репликации позволила создать препараты прямого действия, направленные на этиотропное лечение ВГС [8].

Первое поколение препаратов группы ингибиторов протеаз прошло регистрацию в 2011 году. Это были препараты боцепревир и телапревир, которые зарегистрированы и в России.

Боцепревир является ингибитором протеазы NS3 вируса гепатита С. Ковалентно, но обратимо он связывается с активным серином (Ser139) протеазы NS3 с помощью функциональной группы альфа-кетоамида, тормозя репликацию вируса в клетках-хозяевах, инфицированных ВГС. Боцепревир применяется для лечения 1-го генотипа хронического ВГС в комбинации с ПЕГ-ИФН-α и рибавирином у взрослых пациентов, которые лечатся впервые, или у тех, у кого терапия оказалась неэффективной, при отсутствии декомпенсации функции печени. Схема лечения: по 4 капсулы (800 мг) 3 раза в день во время еды. Суточная доза боцепревира составляет 2400 мг, т.е. 12 капсул по 200 мг. Препарат присоединяют к двойной ПВТ на пятой неделе лечения. Длительность лечения зависит от вирусологического ответа на 8, 12 и 24 неделе ПВТ. Если у пациента уровень РНК ВГС на 12-й неделе ПВТ больше или равен 100 МЕ/мл либо обнаруживается на 24-й неделе ПВТ, нужно завершить лечение [8,9].

Телапревир - ингибитор сериновой NS3/4A протеазы вируса гепатита С, которая необходима для репликации вируса. Применяется для лечения 1-го генотипа хронического ВГС у взрослых пациентов, в т.ч. с компенсированным циррозом печени, а также имевших рецидив на терапию или не имевших ответа на предыдущую ПВТ. Схема лечения: 6 таблеток по 375 мг в 3 приема перорально ежедневно (2250 мг в сутки). Телапревир следует назначать в комбинации с ПЕГ-ИФН-α и рибавирином в течение первых 12 недель терапии. При достижении отрицательной РНК ВГС в дальнейшем терапия интерферонами и рибавирином должна быть продолжена в течение еще 12 недель. При положительной РНК ВГС на 4-й и 12-й неделях лечения, а также при циррозах печени терапия интерферонами и рибавирином продолжается еще на протяжение 36 недель [10].

Однако препараты боцепревир и телапревир нельзя применять в качестве монотерапии или только с ПЕГ-ИФН-α, или только с рибавирином. При проведении тройной терапии с боцепревиром и телапревиром у больных было выявлено значительное увеличение частоты нежелательных явлений, в особенности таких, как анемия, сыпь и др., что послужило причиной прерывания ПВТ или увеличения затрат на лечение дополнительными дорогостоящими препаратами (эритропоэтины).

Недостатками тройной терапии также следует считать длительность терапии не менее 48 недель у всех больных с нулевым ответом и циррозом печени, а также у части больных с рецидивом, не ответивших на тройную терапию, и то, что пациенту приходится принимать в день большое число таблеток. Сегодня первое поколение ингибиторов протеаз заменено в новейших стандартах лечения, утвержденных в США, Евросоюзе, Японии и России, вторым поколением ингибиторов протеазы.

Появление второго поколения ингибиторов протеаз позволило значительно уменьшить дозировку действующего вещества, что сократило побочные эффекты и увеличило УВО.

Сегодня применяется схема сочетанного приема ингибитора протеазы NS3/4A симепревир (150 мг) 1 раз в день вместе с ингибитором полимеразы NS5B софосбувир (400 мг) 1 раз в день в течение 12 недель у пациентов ВГС 1-го генотипа. Эффективность и безопасность данной схемы, зарегистрированной в том числе и в России, оценивалась в клиническом исследовании COSMOS, в ходе которого принимали участие пациенты с распространенным фиброзом печени (со стадиями фиброза от F3 до F4 по шкале МETAVIR), ранее не получавшие лечение, а также больные, не ответившие на предыдущее лечение на всех стадиях фиброза (от F0 до F4 по шкале МETAVIR). Эта схема лечения позволяет отказаться при проведении ПВТ от ИФН-α и рибавирина.

К ингибиторам полимеразы относится препарат софосбувир. Препарат зарегистрирован в России, и применяется для лечения хронического ВГС в качестве компонента комбинированной схемы противовирусной терапии у взрослых пациентов, подавляя репликацию ВГС. В настоящее время нуклеозидный ингибитор РНК-полимеразы NS5B вируса гепатита С софосбувир в сочетании с другими антивирусными препаратами входит в состав основных рекомендуемых схем в соответствии с европейскими и американскими протоколами лечения ВГС, а также протоколами ВОЗ. Препарат софосбувир применяется в сочетании с рибавирином, если у пациента диагностирован ВГС 2-го и 3-го генотипов, либо с рибавирином и ПЕГ-ИФН-α, если пациент страдает ВГС 1-го и 4-го генотипов. Рекомендованная доза - 1 таблетка (400 мг) один раз в день во время еды.

При ВГС генотипа 5 или 6 применяется комбинация софосбувир + ПЕГ-ИФН-α + рибавирин более 12 недель. Схема действует и для пациентов с совместной инфекцией гепатита С и ВИЧ. Длительность терапии может быть увеличена до 24 недель, особенно у пациентов с одним или несколькими факторами риска – прогрессирующим фиброзом печени, высокой исходной вирусной нагрузкой, черной кожей, отсутствием в прошлом ответа на ПВТ рибавирином и ИФН-α.

Тем не менее, чтобы достичь эффективного лечения без интерферона на основе софосбувира, нужно добавлять к нему ингибитор полимеразы NS5A (Ledipasvir, Daclatasvir или Velpatasvir) [7;11;12].

Комбинированный препарат Harvoni, содержащий ингибитор полимеразы NS5B софосбувир (400 мг) и ингибитор полимеразы NS5A ледипасвир (90 мг) представляет собой первый в мире препарат для терапии 1-го генотипа хронического ВГС без пегилированного интерферона и рибавирина. Добавление в комбинацию к софосбувиру ингибитора полимеразы NS5A ледипасвир позволило эффективно бороться даже против штаммов вируса гепатита C с пониженной чувствительностью к софосбувиру. Прием данного препарата проводится 1 раз в день внутрь вне зависимости от приема пищи в течение 12 недель. Данный препарат позволяет добиться у пациентов с 1-м генотипом ВГС, ранее не предпринимавших попыток терапии, УВО в 96% случаев. Добавление к терапии рибавирина не оказывало влияния на увеличение частоты ответов на лечение, но увеличивало побочные эффекты (клинические исследования ION, n=1518). В группах, где применялся рибавирин, наиболее частыми побочными эффектами были утомляемость, головная боль, тошнота и бессонница. Анемия, которая является распространенным побочным эффектом, связанным с рибавирином, отмечалась у 0,5% пациентов в группах без рибавирина против 9,2% пациентов в группах с приемом рибавирина. Результаты ION-исследований показывают, что этот простой, безопасный и короткий курс противовирусной терапии с режимом одноразового приема препарата софосбувир/ледипасвир может обеспечить высокие показатели эффективности лечения среди пациентов с 1-м генотипом ВГС, устраняя необходимость использования как интерферона так и рибавирина [11;12].

Даклатасвир - это ингибитор полимеразы вирусного белка NS5A, который используется при репликации вируса гепатита С внутри гепатоцитов и, таким образом, препятствует поступлению вируса из зараженных клеток печени в кровь. Препарат даклатасвир предназначен для лечения гепатита С (генотипы вируса: 1, 2, 3,4,5,6) в комбинации с другими лекарственными средствами.

В настоящее время в мире и в России для лечения всех генотипов вирусного гепатита С зарегистрирована схема парного приема препарата даклатасвир в дозе 60 мг 1 раз в день внутрь вместе с препаратом софосбувир в дозе 400 мг 1 раз в день внутрь.

Также даклатасвир разрешен к применению в комбинации с препаратом асунапревир, и с препаратами ПЕГ-ИФН-α + рибавирин, где даклатасвир оказывает одинаково выраженное противовирусное действие как при генотипе 1, так и при генотипе 4.

Через 12 недель после того, как пациенты с 1-м или 4-м генотипом ВГС без цирроза, для которых терапия даклатасвиром была первичной, прошли курс лечения, у 90% из них отмечается УВО. Среди пациентов, уже проходивших ранее курс лечения от гепатита С ПЕГ-ИФН-α и рибавирином (и не получивших УВО ранее), через 12 недель после проведенной терапии УВО был выявлен в 82% случаев. У пациентов с 1, 3 или 4 генотипом ВГС и сопутствующим циррозом или уже проходивших безуспешную ПВТ, лечение даклатасвиром рекомендовано в течение 24 недель.

Даклатасвир применяется по одной таблетке в день внутрь в установленной дозе 30 или 60 мг. Препарат всегда должен применяться в комплексе с другими лекарственными средствами. Курс лечения продолжается от 12 до 24 недель.

В 2015 г. в Японии, и затем в России, одобрена новая комбинированная терапия без применения препаратов ПЕГ-ИФН-α и рибавирина, предназначенная для лечения пациентов с 1-м генотипом ВГС. В ее состав входят препараты даклатасвир и асунапревир - ингибитор протеазы NS3 компании Bristol-Myers Squibb. По результатам клинических исследований у 87,7% пациентов с ВГС 1-го генотипа, ранее не проходивших ПВТ, на 24-й неделе лечения был достигнут УВО. Среди тех больных, что ранее получали ПЕГ-ИФН-α и рибавирин, однако такое лечение оказалось неэффективным, или у пациентов была отмечена непереносимость препаратов, УВО был зафиксирован в 82% случаев. Данная безинтерфероновая терапия препаратами даклатасвир и асунапревир подходит также для больных с компенсированным циррозом печени.

В США, станах ЕС и России также зарегистрирована и одобрена комбинация препаратов Викейра Пак, включающая препараты омбитасвир/паритапревир/ритонавир и дасабувир производства компании AbbVie. Это полностью пероральная схема лечения, не требующая применения интерферонов. Данная комбинация предназначена для лечения вирусного гепатита С генотипа 1, в том числе у пациентов с компенсированным циррозом печени, у пациентов, находящихся на заместительной терапии, у пациентов с сочетанной инфекцией ВГС/ВИЧ-1 и у пациентов, которые перенесли пересадку печени. Кроме того, Викейра Пак одобрена для использования в комбинации с рибавирином у пациентов с генотипом 4. Комбинация содержит три новых антивирусных препарата – омбитасвир, ингибитор NS5A (25 мг), паритапревир, ингибитор протеазы NS3/4A (150 мг), усиливаемый 100 мг ритонавира (в одной таблетке) для приема 1 раз в день, а также дасабувир, ненуклеозидный ингибитор полимеразы NS5B (250 мг) для приема два раза в день без рибавирина или с рибавирином.

1. Ивашкин В.Т. Болезни печени и желчевыводящих путей. М.: М–Вести, 2005. – 536 с.

2. Емельянов Д.Н., Свириденко О.Ю., Мязин Р.Г. Тактика противовирусного лечения острых и хронических вирусных гепатитов на современном этапе. Гепатология. 2004; 4: 42–48.

3. Никитин И.Г., Кузнецов С.Л., Сторожаков Г.И. Уровень сывороточного железа и результаты интерферонотерапии у больных с хроническим гепатитом С // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии – 2000.- №3.- С. 32-36.

4. Павлов Ч.С. Гепатит С: естественное течение и подходы к терапии // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии – 2001.- №3. С. 2-6.

5. Ge D. et al. Treatment of chronic hepatitis C: IDEAL Results. Nature. 2009; 461:399-401.

6. Chou R., Carson S., Chan B. Pegylated interferons for chronic hepatitis C virus infection: an indirect analysis of randomized trials. J. Viral. Hepat. 2008; 15: 551–570.

7. Agherno A. Report about modern tactic of treatment chronic viral hepatitis C // 24-th Conference of Asian Pacific Association for the Study of the Liver (APASL). 12-15 March 2015, Istanbul, Turkey.

8. Poordad F, McCone J Jr, Bacon BR et al. Boceprevir for Untreated Chronic HCV Genotype 1 Infection N Engl J Med. 2011 Mar 31;364(13):1195-206.

9. Bacon BR, Gordon SC, Lawitz E et al. Boceprevir for previously treated chronic HCV genotype 1 infection N Engl J Med. 2011 Mar 31;364(13):1207-17.

11. Gilead Reports Interim Data From Phase 2 LONESTAR Study // Press Releases, May 11, 2013.

12. Gilead Announces SVR12 Rates From Three Phase 3 Studies Evaluating a Once-Daily Fixed-Dose Combination of Sofosbuvir and Ledipasvir for Genotype 1 Hepatitis C Patients // Press Releases, December 14, 2012.

13. Angela Chen. Merck Gets Breakthrough Designation for Hepatitis C Drugs. Grazoprevir, elbasvir have high cure-rate in mid-stage clinical trials // The Wall Street Journal, Business, April, 8, 2015.

14. E Lawitz, EJ Gane, B Pearlman et al. Efficacy and safety of MK-5172 and MK-8742 +/- ribavirin in hepatitis C genotype 1 infected patients with cirrhosis or previous null response: Final results of the C-WORTHY Study (Parts A and B). American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) Liver Meeting. Boston, November 7-12, 2014. Abstract 196.

15. MS Sulkowski, C Hezode, J Gerstoft et al. Efficacy and safety of MK-5172 + MK-8742 +/- ribavirin in HCV mono-infected and HIV/HCV co-infected treatment-naive, non-cirrhotic patients with hepatitis C virus genotype 1 infection: The C-WORTHY study (Final results, Parts A and B). American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) Liver Meeting. Boston, November 7-12, 2014. Abstract 236.

16. E Lawitz, F Poordad, JA Gutierrez et al. C-SWIFT: MK-5172 + MK-8742 + sofosbuvir in treatment-naive patients with hepatitis C virus genotype 1 infection, with and without cirrhosis, for durations of 4, 6, or 8 weeks. American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) Liver Meeting. Boston, November 7-12, 2014. Abstract 2014.

17. European Association for the Study of the Liver (EASL). Recommendations to modern treatment scheme of viral hepatitis C - 2014 // ZU_COLLEKT; November, 5, 2014. Page 18.

Цена:

Авторы работы:

Научный журнал:

Год выхода:

БИОХИМИЯ, 2009, том 74, вып. 8, с. 1028 - 1036

РНК-ЗАВИСИМАЯ РНК-ПОЛИМЕРАЗА ВИРУСА ГЕПАТИТА С: ИЗУЧЕНИЕ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОИЗВОДНЫМИ а,у-ДИКЕТОКИСЛОТ*

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва, ул. Вавилова, 32; факс: (495)135-1405, электронная почта: kozlovmv@hotmail.com

Поступила в редакцию 10.11.08 После доработки 02.04.09

а,у-Дикетокислоты (БКАб), как полагают, подавляют активность РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гепатита С за счет комплексообразования с каталитическими ионами М^2+ в активном центре фермента. Однако а,у-дикетокислоты демонстрируют неконкурентный тип ингибирования по отношению к МТР-субстрату, что противоречит предложенному механизму. Мы исследовали канал входа МТР-субстрата и активный центр РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гепатита С на предмет возможного взаимодействия с а,у-дикетокислотами. Замены Я48А, К51А и Я222А многократно усиливали ингибирующее действие а,у-дикетокислот и одновременно с этим увеличивали значения Кт иТР-субстрата. Интересно, что замена С223А единственная среди прочих снижала значение Кт(иТР), но также повышала эффективность ингибирования. Полученные результаты позволили смоделировать комплекс фермента с ингибитором. Согласно предложенной модели а,у-дикетокислоты привносят дополнительный ион М^2+ в активный центр фермента на стадии образования фосфодиэфирной связи, в результате чего происходит смещение трифосфатного остатка МТР-субстрата в каталитически неактивную моду связывания. Данный механизм, в отличие от принятого, в настоящее время объясняет неконкурентный тип ингибирования.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус гепатита С, РНК-зависимая РНК-полимераза, производные а,у-дикетокис-лот, механизм ингибирования, молекулярное моделирование.

В результате скрининга комбинаторной библиотеки из 200 тысяч соединений группой итальянских исследователей было обнаружено, что 2,4-диоксо-4-фенилбутановая кислота (БЕЛ, рис. 1) действует как селективный и обратимый ингибитор РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гепатита С (ЯёКР, вирусный неструктурный белок N855) [1]. По данным тех же авторов ингибирование являлось неконкурентным по отношению к NTP-субстрату и РНК-матрице. Сравнивая действие БКА и аналога пирофосфа-та — фоскарнета, они также обнаружили, что оба вещества конкурируют за общий центр связывания в активном центре ЯёЯР [2]. На основании этого авторы предложили считать дикетокисло-

Принятые сокращения: RdRP HCV — РНК-зависимая РНК-полимераза вируса гепатита С; DKAs — а,у-дике-токислота, DKAs — орто- и мета-производные а,у-дике-токислот.

** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

ты аналогами пирофосфата. По их гипотезе ди-анион енольной формы а,у-дикетокислот (БКАз) образует комплексную связь с ионом М^2+ или Мп2+, присутствующим в активном центре фермента, что, в свою очередь, предотвращает связывание NTP-субстрата и образование фосфо-диэфирной связи. В соответствии с этим механизмом ароматическая компонента ингибитора отвечает за специфичность и силу дополнительных взаимодействий с центром связывания [3].

Следует заметить, что допускаемая авторами конкуренция между NTP-субстратом и БКА за хелатирование одних и тех же каталитических ионов магния никак не соответствует ими же обнаруженному неконкурентному типу ингиби-рования. Очевидно, что механизм действия ди-кетокислот является более сложным и требует дальнейшего изучения. Недавно по этому вопросу было высказано утверждение, что при переходе от стадии инициации к стадии элонгации БКА меняют тип ингибирования по отношению к NTP-субстрату с неконкурентного на конкурентный [4]. К сожалению, подробное описание экспериментов и их результатов авто-

Рис. 1. Молекулярная структура БКЛ, представленная в енольной форме, и перечень соединений, использованных в работе, с указанием заместителей

рами не приводится, что затрудняет их критический анализ. Скорее всего, они указывают на то, что центры связывания МТР-субстрата и БКЛ имеют общие границы, которые, вероятно, начинают перекрываться при структурных перестройках активного центра.

Несмотря на большое разнообразие синтезированных структурных вариантов БКЛз, до сих пор остается неясным, как БКЛ связываются с ферментом. Первые предположения, на этот счет были высказаны корейскими исследователями в 2006 году [5]. Используя кристаллическую структуру необычного комплекса ЯёЯР с тремя молекулами иТР [6] и отдаленное структурное сходство между БКЛ и иТР, авторы предложили модель взаимодействия ингибитора и фермента. Она включала в себя:

— электростатическое взаимодействие дике-токислотного остатка с каталитическим ионом Мп2+;

— водородную связь с РИе224 и Лзр225;

— водородную связь с Leu159. Как видно, данная модель находится в русле идей, высказанных первооткрывателями БКЛ [2].

В предыдущей работе [7] мы получили первые указания на то, что ингибирующее действие БКЛ может осуществляться при взаимодействии с полностью сформированным каталитическим комплексом на стадии образования фос-фодиэфирной связи. Мы предположили также, что остаток Л^222 усиливает взаимодействие фермента с ингибитором за счет образования дополнительной водородной связи. В этом сообщении мы представляем дальнейшие результаты по локализации центра связывания БКЛз, полученные на основании олигонуклеотидна-правленного мутагенеза активного центра ЯёЯР.

Синтез производных DKA. Производные DKA (рис. 1) были синтезированы в соответствии с опубликованными методиками [1, 8]. Структуру полученных соединений подтверждали c помощью спектров 1Н-ЯМР (DMSO-d6). Ниже приведены неопубликованные ранее спектры ЯМР для соединений:

DKA-PrCO2H - 8 7,81 (d, J = 6,9 Гц, 1Н, CH), 7,60 (t, J = 7,2 Гц, 1Н, CH), 7,26 (s, 1Н, CH), 7,20 (d, J = 8,4 Гц, 1H, CH), 7,10 (t, J = 7,6 Гц, 1H, CH), 4,15 (t, J = 6,2 Гц, 2H, CH2), 2,46 (t, J = 7,5 Гц, 2H, CH2), 1,96-2,05 (m, 2H, CH2);

DKA-BnCO2H - 8 7,94 (d, J = 7,8 Гц, 1H, CH), 7,64-7,70 (m, 2H, CH), 7,57-7,63 (m, 2H, CH), 7,43-7,52 (m, 2H, CH), 7,30 (d, J = 8,1 Гц, 1H, CH), 7,02 (s, 1H, CH), 5,53 (s, 2H, CH2).

Полученные мутантные плазмиды были использованы для трансформации E. coli линии Rosetta (DE3). После индукции экспрессии фер-

Таблица 1. Структуры праймеров для направленного мутагенеза NS5bA55

Мутация Прямой (F) и обратный (R) праймеры

R48A F 5' GCAGCGCAAGCCTGGCGCAGAAGAAGGTCACC 3' R 5' GGTGACCTTCTTCTGCGCCAGGCTTGCGCTGC 3'

K51A F 5' GCCTGCGGCAGAAGGCGGTCACCTTTGACAGACTG 3' R 5' CAGTCTGTCAAAGGTGACCGCCTTCTGCCGCAGGC 3'

Q148A F 5' GAGGTTTTCTGCGTCGCGCCAGAGAAGGGGGGC 3' R 5' CGGCCCCCCTTCTCTGGCGCGACGCAG 3'

K151A F 5' CTGCGTCCAACCAGAGGCTGGGGGCCGC 3' R 5' GCTTGCGGCCCCCAGCCTCTGGCGC 3'

R222A F 5' GCTTCTCATATGACACCGCATGCTTTGACTCAACAGTCACTG 3' R 5' TCAGTGACTGTTGAGTCAAAGCATGCGGTGTCATATGAGAAGCCC 3'

C223A F 5'GGCTTCTCATATGACACCCGGGCCTTTGACTCAACAGTCACTG 3' R 5' CAGTGACTGTTGAGTCAAAGGCCCGGGTGTCATATGAGAAGCC 3'

D352A F 5' CCCCCTGGGGCCCCGCCCCAACCAGAATAC 3' R 5' GTATTCTGGTTGGGGCGGGGCCCCAGGGGG 3'

мент был очищен на колонке с Ni-NTA-агаро-зой, как это было описано ранее [9]. Целевые фракции были диализованы при 4° против буфера, содержащего 20 мМ Tris (pH 7,5), 30% глицерина, 350 мМ NaCl, 1мМ ЭДТА и 10 мМ 2-мер-каптоэтанола, и хранились при —20°.

Определение полимеразной активности. Стандартная реакционная смесь содержала 0,3 мкг RdRP, 100 мкг/мл poly(rA), 25 мкг/мл (Up)5U, 10 мкМ UTP и 1 мкCi [a-32P]UTP в 20 мкл буфера, содержавшего 20 мМ Tris (pH 7,5), 20 мМ KCl, 4 мМ МяС12, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT и 0,1 мг/мл БСА. Предварительную инкубацию фермента с poly(rA) и (Up)5U проводили в течение 15 мин при 20°, после чего добавляли UTP и [a-32P]UTP и инкубировали еще 30 мин при 30°. Затем 10 мкл реакционной смеси переносили на фильтр DE-81, который отмывали четыре раза 0,5 М PBS (pH 7,0), один раз этиловым спиртом, и сушили на воздухе. Радиоактивность фильтров измеряли по Черенкову.

Значения Km (UTP) определяли в интервале концентраций UTP 1—500 мкМ и рассчитывали с помощью программного обеспечения Origin 6.1 (OriginLab Corp.) в кинетической модели Миха-элиса—Ментен. Ошибка измерения Km (UTP) составляла 20% в результате трех параллельных опытов.

Измерение ингибирующего действия DKA.

Полимеразную реакцию проводили в присутствии ингибиторов в интервале концентраций 0,1—300 мкМ, для чего производные DKA первоначально растворяли в DMSO, затем смешивали с водным раствором UTP/[a-32P]UTP и добавляли к реакционной смеси после предварительной инкубации фермента с матрицей и праймером, как было описано выше. Ошибка измерения IC50 составляла 10—20% по данным четырех параллельных опытов. Тип ингибирова-ния определяли по методу Диксона при концентрациях ингибиторов 1—300 мкМ и трех концентрациях UTP (0,5; 5 и 50 мкМ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В предыдущей работе мы предложили механизм ингибирования RdRP производными DKA, в соответствии с которым дикетокислотный остаток ингибитора тремя атомами кислорода хе-латирует два иона Mg2+ в составе каталитического комплекса на стадии перенос

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

ИВАНОВ А.В., КОЗЛОВ М.В., КОЧЕТКОВ С.Н., КУЗЯКИН А.О., ПОЛЯКОВ К.М., ТУНИЦКАЯ В.Л., ФИЛИППОВА С.Е. — 2006 г.

КОРОВИНА А. Н., КОЧЕТКОВ С. Н., УСАНОВ Н. Н., ЯНВАРЕВ Д. В. — 2012 г.

АЖАЕВ А.В., КОРОВИНА А.Н., КОЧЕТКОВ С.Н., КУХАНОВА М.К., ШАРКИН Ю.А. — 2014 г.

ГОЛУБЕВА Н.А., ЗАКИРОВА Н.Ф., ИВАНОВ А.В., КОЧЕТКОВ С.Н., КУХАНОВА М.К., МУКОВНЯ А.В., ТУНИЦКАЯ В.Л., ХАНДАЖИНСКАЯ А.Л. — 2008 г.

Содержание

Русское название

Латинское название вещества Нарлапревир

Брутто-формула

Фармакологическая группа вещества Нарлапревир

Нозологическая классификация (МКБ-10)

Характеристика вещества Нарлапревир

Фармакология

Нарлапревир является сильным пероральным ингибитором NS3 сериновой протеазы вируса гепатита С. Оказывает ингибирующее воздействие путем ковалентного, но обратимого связывания с сериновым активным центром протеазы вируса гепатита С посредством кетоамидной функциональной группы. Таким образом, нарлапревир ингибирует полипротеиновый процессинг вируса и предотвращает его репликацию в инфицированных клетках хозяина.

Противовирусная активность в клеточной культуре

Противовирусная активность нарлапревира изучалась в биохимическом анализе медленных ингибиторов протеазы и системы репликона вируса гепатита С, которая представляет собой хорошо изученную модель репликации вируса. Константа ингибирования (K_i) нарлапревира для NS3 протеазы генотипа lb составляет 7 нМ. Также нарлапревир проявляет активность в отношении генотипов 1а, 2а, 3а и 4 (K_i=0,7; 3; 7 и 16 нМ соответственно). В системе бицистронного репликона генотипа lb показатели нарлапревира IC₅₀ и IC₉₀ (концентрация, вызывающая 90% ингибирование) составляют 20 и 40 нМ соответственно. В системе же репликона генотипа la IC₉₀ нарлапревира составляет 140 нМ. В присутствии 50% сыворотки крови человека IC₅₀ нарлапревира в репликоне lb увеличивается до 720 нМ.

При проведении биохимических тестов и исследований репликона продемонстрирована перекрестная устойчивость к нарлапревиру при мутациях резистентности, возникших при применении других кетоамидных ингибиторов протеазы вируса гепатита С. Активность нарлапревира умеренно снижается при следующих основных мутациях вируса, ассоциированных с резистентностью к другим ингибиторам протеазы вируса гепатита С: V36M (K_i=12 нМ, IC₅₀ для репликона = 430 нМ, IC₉₀=940 нМ), V170A (K_i=30 нМ, IC₅₀=300 нМ, IC₉₀=900 нМ) и Т54А (K_i=40 нМ, IC₅₀=400 нМ, IC₉₀=700 нМ). Активность нарлапревира значительно снижается в отношении мутаций в локусах 155 (R155K) и 156 (A156S/T). Кратность увеличения резистентности при двойных мутациях приблизительно эквивалентна суммам показателей для отдельных мутаций (т.е. зависимость мультипликативная, а не аддитивная). Нарлапревир в полной мере активен в отношении мутации D168V.

После назначения нарлапревира внутрь после приема пищи в дозах 300–1500 мг один раз в сутки в комбинации с ритонавиром в дозе 100 мг один раз в сутки у здоровых лиц средние значения Т_mах нарлапревира находились в диапазоне от 2,5 до 4,5 ч. Значения С_mах, C_min и AUC , количественно отражающие концентрацию нарлапревира в организме, увеличивались пропорционально повышению дозы нарлапревира. Нарлапревир рекомендуется принимать с пищей, т.к. при назначении нарлапревира после приема пищи средние общие значения AUC и С_mах увеличивались в 1,8 и 2,8 раз относительно показателей, полученных в условиях натощак. При этом не выявлено явной задержки в достижении Т_mах после приема пищи по сравнению с дозированием в условиях натощак.

Нарлапревир умеренно связывается с белками плазмы (от 86,5 до 91,4%) и характеризуется большим V_d , что предполагает экстенсивное распределение в тканях.

Нарлапревир экстенсивно метаболизируется путем окисления, редукции, расщепления и N-деалкилирования. Главным образом метаболизм нарлапревира и его основного метаболита обеспечивается изоферментом CYP3А 4 цитохрома Р450. Под действием изофермента CYP3A4 нарлапревир и его основной неактивный метаболит преобразуются в окисленные метаболиты. Таким образом, нарлапревир представляет собой субстрат изофермента CYP3A4 . Также нарлапревир проявляет слабые ингибирующие свойства в отношении изофермента CYP3A4 . При совместном применении нарлапревира с сильным ингибитором изофермента CYP3A4 ритонавиром наблюдается увеличение концентрации нарлапревира за счет оптимизации минимальных концентраций, что позволяет применять более удобный режим лечения — один раз в день.

Выведение нарлапревира изучалось в исследовании с радиоактивными изотопами, в котором здоровые добровольцы получали дозу 400 мг 14 С-нарлапревира внутрь в виде монотерапии или в комбинации с ритонавиром. Нарлапревир преимущественно экскретируется через кишечник (на 81,1%), почечный же клиренс вносит минимальный вклад (3,14%) в выведение нарлапревира. Применение ритонавира снижает клиренс и существенно повышает T_1/2 нарлапревира.

Применение вещества Нарлапревир

Лечение хронического вирусного гепатита С, вызванного вирусом генотипа 1, у пациентов старше 18 лет с компенсированным поражением печени, в комбинации с ритонавиром, пэгинтерфероном альфа и рибавирином, ранее не получавших противовирусную терапию пэгинтерфероном альфа и рибавирином, или у которых предшествующее двухкомпонентное лечение пэгинтерфероном альфа и рибавирином было неэффективным.

Нарлапревир нельзя применять в качестве монотерапии.

Противопоказания

Повышенная чувствительность к нарлапревиру; тяжелая нейтропения (уровень нейтрофилов QT , требует тщательного контроля параметров ЭКГ . Назначение многократных терапевтических доз нарлапревира (300 мг/сут) в комбинации с ритонавиром (100 мг/сут) не приводит к значимому удлинению интервала QTс. При назначении нарлапревира в дозе 1500 мг, многократно превышающей терапевтическую, в комбинации с ритонавиром 100 мг 1 раз в день в течение 5 дней наблюдалось удлинение интервала QT .

Применение при беременности и кормлении грудью

Комбинация нарлапревира с ритонавиром, пэгинтерфероном альфа и рибавирином противопоказана при беременности и в период грудного вскармливания. Нарлапревир в исследованиях in vivo не продемонстрировал эмбрио- и фетотоксичность, однако отмечались признаки токсичности для организма матери.

Женщинам, получающим лечение нарлапревиром, ритонавиром, пэгинтерфероном альфа и рибавирином, а также женщинам-партнерам мужчин, получающих комбинацию этих препаратов, следует соблюдать особую осторожность для предупреждения беременности. Во время терапии женщины и мужчины детородного возраста должны использовать барьерный метод контрацепции (презерватив и/или диафрагма/шеечный колпачок).

Побочные действия вещества Нарлапревир

Ниже представлены нежелательные реакции, наблюдавшиеся в ходе лечения нарлапревиром в комбинации с ритонавиром, пэгинтерфероном альфа и рибавирином.

Для градации частоты побочных эффектов использовалась классификация ВОЗ : очень часто (>1 случая на 10 назначений); часто (>1 случая на 100 назначений) и нечасто ( ЖКТ : часто — тошнота, диарея; нечасто — боль в верхней части живота, сухость во рту, необычный кал, рвота, дискомфорт в животе, хейлит, гастроэзофагеальный рефлюкс, кровоточивость десен, анальный зуд, анальная трещина, прокталгия.

Со стороны печени и желчевыводящих путей: часто — гипербилирубинемия.

Со стороны кожи и подкожных тканей: часто — кожный зуд, алопеция, крапивница, сыпь (папулезная, макулярная); нечасто — ксеродерма, сухость кожных покровов, дерматит, экзема, гипергидроз, сыпь.

Со стороны скелетно-мышечной системы и соединительной ткани: часто — миалгия, артралгия; нечасто — боль в спине, боль в конечности.

Со стороны почек и мочевыводящих путей: нечасто — гемоглобинурия, протеинурия.

Со стороны половых органов и молочной железы: нечасто — бартолинит.

Общие расстройства и нарушения в месте введения: очень часто — астения; часто — гриппоподобное состояние, озноб, пирексия, утомляемость, боль; нечасто — гипертермия.

Лабораторные и инструментальные данные: очень часто — снижение уровня Hb; часто — снижение массы тела, повышение температуры тела, повышение активности ГГТ , снижение количества тромбоцитов; нечасто — снижение количества нейтрофилов, снижение количества лейкоцитов, повышение активности АСТ , повышение активности ЩФ в крови, повышение АД , повышение уровня триглицеридов в крови.

Взаимодействие

Нарлапревир является субстратом и слабым ингибитором изофермента CYP3A4 , кроме того, ритонавир, обязательный компонент терапии с применением нарлапревира, является сильным ингибитором изофермента CYP3A4 , поэтому при применении с лекарственными средствами, являющимися субстратами, ингибиторами и/или индукторами изофермента CYP3A4 , возможно изменение концентрации как нарлапревира и ритонавира, так и сопутствующих препаратов.

Было показано, что прием нарлапревира в терапевтических дозах в комбинации с ритонавиром не приводит к удлинению скорректированного интервала QT (QTcF). Однако в дозах, многократно превышающих терапевтическую, нарлапревир в комбинации с ритонавиром может удлинять интервал QTcF. Поэтому нарлапревир следует применять с осторожностью у пациентов, одновременно принимающих препараты, удлиняющие интервал QT .

Передозировка

Максимальная концентрация нарлапревира в плазме была определена при применении нарлапревира в дозе 1500 мг однократно в сутки в сочетании с ритонавиром в дозе 100 мг однократно в сутки на протяжении 5 дней. При этом явления токсичности не наблюдались. Данные по передозировке нарлапревира отсутствуют.

Следует осуществлять общие профилактические мероприятия и тщательный мониторинг жизненных функций организма. Если пациент находится в сознании, следует вызвать рвоту, возможно применение активированного угля внутрь.

Пути введения

Меры предосторожности вещества Нарлапревир

Во время всего периода лечения рекомендуется контролировать показатели общего и биохимического анализа крови, а также уровень вирусной нагрузки.

Отмена терапии. Комбинированное лечение рекомендуется полностью прекратить в следующих случаях:

- при развитии вирусологического прорыва (увеличение уровня РНК вируса гепатита С на ≥1 lg 10 выше низшего уровня или определяемый уровень РНК вируса гепатита С во время лечения после первоначального падения ниже предела обнаружения);

- при сывороточном уровне РНК вируса гепатита С >100 МЕ/мл на 12-й нед лечения, свидетельствующем о недостаточной эффективности лечения и малой вероятности достижения стойкого вирусологического ответа;

- при наступлении беременности пациентки, получающей лечение нарлапревиром, ритонавиром, пэгинтерфероном альфа и рибавирином;

- при развитии декомпенсированного заболевания печени (цирроз печени класса В или С по классификации Чайлд-Пью).

Коррекция дозы или приостановление терапии. Снижение дозы нарлапревира и/или ритонавира во время терапии не допускается. В случае отмены терапии нарлапревиром по причине развития нежелательных реакций или неадекватного вирусологического ответа возобновление терапии нарлапревиром не допускается.

В случае развития нежелательных реакций, потенциально связанных с пэгинтерфероном альфа или рибавирином, и требующих коррекции дозы или приостановки терапии любым из этих лекарственных препаратов, необходимо руководствоваться указаниями, изложенными в инструкциях по применению соответствующего лекарственного препарата.

Снижение Hb ниже нормы отмечалось на 8–12 нед лечения у большей доли пациентов, получавших нарлапревир и ритонавир в комбинации с пэгинтерфероном альфа и рибавирином, в сравнении с пациентами, получавшими только пэгинтерферон альфа и рибавирин. В начале терапии нарлапревиром и ритонавиром в комбинации с пэгинтерфероном альфа и рибавирином чаще отмечалось снижение абсолютного числа лейкоцитов ниже нормы по сравнению с пациентами, получавшими только пэгинтерферон альфа и рибавирин. Однако после 4-й нед группы лечения по этому показателю не различались.

Влияние на способность к управлению транспортными средствами, механизмами. В настоящее время не были выявлены какие-либо эффекты нарлапревира, влияющие на способность управлять транспортными средствами и механизмами. Специальных исследований влияния нарлапревира на способность управлять транспортными средствами и механизмами не проводилось.

Из-за возможности появления утомляемости или сонливости на фоне комбинированной терапии нарлапревиром, ритонавиром, пэгинтерфероном альфа и рибавирином не рекомендуется управлять автомобилем и/или сложной техникой.