Белок м2 вируса гриппа

Вирусы гриппа передаются воздушно-капельным путём и могут сохранять жизнеспособность в течение 2-8 часов на одежде и бумаге, а на металлических поверхностях — даже до суток (8 и 9). Инфекция легче распространяется зимой, и некоторые исследователи связывают это с тем, что в условиях холодного и сухого воздуха вирус дольше сохраняет вирулентность. Дополнительный фактор — то, что температура в верхних дыхательных путях человека в этот период больше подходит для размножения вируса (10).

Чаще всего от осложнений, вызываемых гриппом, погибают пожилые люди старше 65 лет, дети до двух лет, а также люди с хроническими заболеваниями. Однако следует отметить, что от пандемии свиного гриппа 2009 года погибло аномально большое число молодых людей. Этот факт объясняют тем, что у пожилых людей мог сохраниться иммунитет к схожим штаммам гриппа, которые циркулировали в популяции значительно раньше (11 и 12).

При переходе от одного штамма к другому вирулентность и уровень смертности от гриппа сильно варьируются. Так, птичий грипп H5N1, вызвавший региональную эпидемию в Восточной Азии в 1997 году, отличался крайне высоким уровнем смертности среди заболевших (до 50%), однако передавался он весьма неэффективно, и количество заражённых не превысило нескольких сотен человек (18).

Морфология и структурные белки

Вирусы семейства Orthomyxoviridae имеют липидную оболочку, образованную частью мембраны хозяйской клетки (19 и 20). В мембрану включены поверхностные белки. У вирусов гриппа их два — гемагглютинин (H), необходимый для того, чтобы связываться с клеточными рецепторами и проникать внутрь клетки хозяина, и нейраминидаза (N), которая отрезает новообразованную частицу вируса от клеточных рецепторов и дает ей возможность переместиться к новой клетке. Также мембрана вируса содержит образованные белком М2 каналы — они служат для распаковки частицы в цитоплазме. Под мембраной вируса находится слой матрикса, сформированный структурным белком М1. В центре частицы располагается генетический материал, представленный восемью молекулами РНК, каждая из которых соединена со структурными белками NP (nucleoprotein) и полимеразным комплексом, ответственным за их копирование (5, 21, 22).

Вирусы гриппа могут иметь как сферическую, так и филаментную форму (23). Диаметр сферических частиц сопоставим с диаметром ВИЧ — 80-120 нм. Вариации в форме разных типов и штаммов обусловлены различиями в строении белков матрикса, который располагается непосредственно под мембраной (24 и 25). Отдельные белки вируса гриппа являются объектом исследования как вероятные мишени для противовирусных препаратов. Так, большое внимание уделяется разработке ингибиторов нейраминидазы, блокирующих работу этого фермента, что не дает новому вирусу покинуть клетку (26). По этому принципу, в частности, работают лекарства Тамифлю и Реленца (27). Разработаны также препараты, мешающие частице распаковываться в цитоплазме зараженной клетки или содержащие антитела к различным типам гемагглютинина (28).

Ключевые белковые молекулы, обеспечивающие жизнедеятельность и воспроизводство вируса гриппа — поверхностный белок гемагглютинин, энзим нейраминидаза и белки матрикса M1. По принципу строения гемагглютинин напоминает поверхностный белок вирусаЭбола (29 и 30). Этот белок является гомотримером, имеющим трансмембранную и поверхностную части, которые связаны между собой дисульфидными связями. Попадание вируса в клетку происходит после того, как гемагглютинин связывается с клеточными рецепторами, несущими сиаловую кислоту (31). Вирус попадает в цитоплазму в составе везикулы. Когда среда внутри везикулы становится более кислой, гемагглютинины меняют свою конформацию и вызывают слияние вирусной мембраны и мембраны везикулы (32). Белки М2 формируют каналы, через которые ионы водорода попадают внутрь вирусной частицы, нарушая взаимодействие между матриксом и генетическим материалом вируса и обеспечивая тем самым возможность последнему попасть в цитоплазму (33). Препараты Ремантадин иАмантадин (а также их аналоги) нацелены на ингибирование белка М2 и предотвращение распаковки вируса — однако, они менее эффективны, чем ингибиторы нейраминидазы, и сейчас их уже редко рекомендуют для лечения гриппа (27).

Работа нейраминидазы важна на завершающих стадиях жизненного цикла вируса. Этот белок состоит из четырех одинаковых субъединиц (34), а его функция заключается в отщеплении терминальных остатков сиаловой (нейраминовой) кислоты от гликозилированных рецепторов, с которыми связывается гемагглютинин. Без этого вновь образованные вирусные частицы не смогут отсоединиться от поверхности хозяйской клетки (35). Отщепление сиаловой кислоты также препятствует повторному заражению клетки другими вирусными частицами. Ингибиторы нейраминидазы, замедляющие распространение вируса в организме, являются действующим компонентом противогриппозных препаратов Занамивира и Озельтамивира (36). Впрочем, озельтамивир (действующее вещество препарата Тамифлю) перестаёт действовать, если в нейраминидазе вируса 274-я аминокислота гистидин меняется на тирозин. Занамивир (действующее вещество препарата Реленца) в этом случае не теряет активности, однако он провоцирует побочные эффекты, поэтому его рекомендуют применять только в тех случаях, когда Тамифлю не действует (27 и 37).

Белки матрикса М1 играют ключевую роль в сборке новых вирусных частиц (38 и 39). Перед формированием новых вирионов они скапливаются с внутренней стороны клеточной мембраны, взаимодействуя при этом как с поверхностными белками, так и с находящимися в цитоплазме комплексами вирусного генома, благодаря чему все компоненты будущего вируса собираются воедино. Наличие матрикса характерно для вирусов с липидной мембраной — таких, например, как ВИЧ или вирус Эбола (40 и 41). Кроме того, этим вирусам присуще почкование из специфических областей клеточной мембраны — липидных рафтов, молекулярный состав которых делает их несколько менее лабильными в сравнении с другими участками мембраны (42).

Внутри вируса: как упакован генетический материал

Основная цель любого вируса — это воспроизводство собственного генома путём создания копий. Информация обо всех структурных и функциональных компонентах вируса находится в РНК. Каждая вирусная частица содержит одну копию генома, компактно уложенную в виде восьми отдельных спиральных структур. Совокупная длина этих молекул рибонуклеиновой кислоты превышает диаметр вируса в N раз. В переносе и хранении генетической информации важную роль играет то, что РНК содержится в вирусе в составе рибонуклеиновых комплексов.

Генетический материал гриппа разделён на части, каждая из которых отвечает за синтез отдельных вирусных белков. Поэтому в случае попадания в одну клетку разных штаммов при сборке новых частиц могут образовываться гибридные штаммы, что ускоряет эволюцию вирусов и осложняет борьбу с ними (43). Сегменты РНК гриппа не равнозначны, и в частицу должен попасть фиксированный набор из восьми разных РНК, каждая из которых выполняет свою функцию. Как это достигается в природе, понятно не до конца. Видимо, между вирусными рибонуклеопротеиновыми комплексами (РНП) существует специфическое взаимодействие, обеспечивающее сборку разных частей генома в нужном составе (44).

Публикации результатов исследований, описывающих структуру вирусных РНП, стали появляться сравнительно недавно. Одну из последних и наиболее детальных работ на эту тему подготовили и опубликовали в журнале Science (45) коллективы лабораторий Хайме Мартина-Бенито и Хуана Ортина. Доктор Мартин-Бенито комментирует специфику их исследований:

Когда мы приступили к изучению структуры полного РНП нативных вирусов гриппа в Национальном центре биотехнологии в Мадриде, вся доступная информация на эту тему была ограничена данными рентгеноструктурного анализа нуклеопротеина без РНК (46 и 47) и фрагментов полимеразы (48 и 49). РНП представляют собой разные по размеру, гибкие и суперскрученные структуры (50), что очень затрудняет исследования. В этой ситуации криоэлектронная микроскопия оказывается уникальным методом, способным выдать приемлемый результат. Основные проблемы были обусловлены различием длины отдельных РНП, а также их подвижностью. Чтобы это преодолеть, мы отдельно анализировали центральные и конечные части РНП, изолированных из выделенных вирионов, после чего проводили их 3D-реконструкцию (45). Здесь наиболее трудным этапом стала классификация полученных изображений. Необходимо было получить гомогенные группы, что позволило бы сделать финальную реконструкцию. Для того чтобы сгенерировать финальную структуру, было использовано более 90 тысяч изображений. Мы потратили на это миллионы часов компьютерного времени«.

Хайме Мартин-Бенито (Испанский национальный центр биотехнологий, Мадрид, Испания)

Строение и конформации РНП, а также их взаимодействие с другими белками вируса обеспечивают им специфические свойства и функции. Геном гриппа представлен восемью молекулами РНК негативной полярности и разной длины. Такое число сегментов генома характерно для всех ортомиксовирусов (кроме тоготовирусов, содержащих по шесть молекул РНК). РНК связывается с полимеразными комплексами (48) и белком NP (51), формируя РНП (44). РНП организованы в двойные спирали из двух цепей РНК, ассоциированных с белками НП и расположенных друг против друга (45).

Различие длины разных РНП гриппа обусловлено различиями длин сегментов их РНК. Три наиболее протяженных сегмента имеют длину порядка 2500 нуклеотидов, тогда как длина самого короткого сегмента лишь немногим превышает 800 нуклеотидов. РНП обычно группируются в частице вокруг одного из наиболее длинных РНП таким образом, чтобы полимеразные концы всех РНП оказывались собранными вместе, взаимодействуя при этом с белками матрикса на одном из полюсов вириона. В эту же область попадают и белки NEP, чья функция — экспорт новосинтезированных РНП из ядра клетки к месту сборки вируса.

Одной из проблем, вызывающих сейчас активный интерес сообщества структурных вирусологов, является изучение причин специфической упаковки необходимого набора разных РНП в каждую новую частицу. Считается, что молекулы РНК в составе каждого РНП способны специфически взаимодействовать с РНК соседних сегментов. Мы отразили этот момент в нашей модели, однако конкретные механизмы такого взаимодействия — объект дальнейших исследований (44, 45, 52).

Для многих мембранных вирусов характерно присутствие в вирионах белков, захваченных из клетки хозяина. Так, внутри ВИЧ обнаруживают актин и циклофилин, а в мембране этого вируса присутствуют белки, относящиеся к главному комплексу гистосовместимости, что делает вирус менее уязвимым для иммунной системы (53, 54, 55). Наличие человеческих белков в вирусной частице гриппа на данный момент не продемонстрировано с должной достоверностью, хотя некоторые данные по этому вопросу опубликованы (56).

Высокая изменчивость и непредсказуемость вируса гриппа рано или поздно может привести к новой пандемии. Во избежание этого предпринимаются разные меры — как на глобальном, так и на локальном уровне. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) и региональные организации в разных странах ведут постоянный мониторинг циркулирующих штаммов гриппа, поскольку год за годом состав сезонных штаммов меняется, пополняясь новыми потенциально опасными вариантами. Изменчивость вирусов гриппа — большая проблема для фармацевтических компаний, разрабатывающих противовирусные препараты (27 и 57). Так, в настоящее время растет процент штаммов гриппа, устойчивых к озельтамивиру.

Профилактические вакцины от гриппа совершенствуются каждый год в зависимости от преобладающих штаммов. Их разрабатывают как с использованием целых инактивированных вирионов, так и на основе фрагментированных вирусных частиц или даже отдельных поверхностных белков. Обычно вакцины направлены на профилактику заражения как штаммами типа А, так и вирусами типа В (58).

Часто присущие гриппу симптомы (повышенная температура, боль в горле и мышцах, головная боль) бывают вызваны и другими вирусами. Среди возбудителей простудных заболеваний есть коронавирусы, риновирусы и аденовирусы (59). Выявление конкретного возбудителя в таких случаях не всегда целесообразно, поэтому подобные заболевания часто относят к группе острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ).

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Цыбалова Л.М., Степанова Л.А., Котляров Р.Ю., Блохина Е.А., Шуклина М.А.

Разработка универсальной вакцины против гриппа вакцины, направленной на все субтипы вирусов гриппа человека, является наиболее актуальной современной задачей в специфической профилактике гриппа . В настоящей статье дана сравнительная характеристика специфической активности нескольких вариантов рекомбинантного вакцинного белка, включающего антигенные детерминанты вируса гриппа эктодомен белка М2 (М2е) и фрагмент второй субъединицы гемагглютинина (аминокислотная последовательность 76 -130). В качестве белка-носителя и адъюванта был выбран флагеллин белок Salmonella typhimurium как полноразмерный, так и с делетированной гипервариабельной частью. На экспериментальных животных показана высокая иммуногенность препаратов и способность предотвращать летальность при инфицированнии вирусом гриппа . Наибольшей протективностью обладал гибридный белок Flg-HA2-4M2 полноразмерный флагеллин с НА2 (76 130) и М2е на С-конце. Препарат обеспечивал 100% выживаемость при заражении высокой дозой вируса гриппа A(H3N2) 10 LD50. Белки, содержащие только полноразмерный флагеллин с М2е или укороченную форму флагеллина с М2е на С-конце и с НА2 в гипервариабельном участке, защищали 75% животных от летальной инфекции. Белок Flg-HA2-4M2 перспективен для дальнейшего исследования в качестве вакцины.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Цыбалова Л.М., Степанова Л.А., Котляров Р.Ю., Блохина Е.А., Шуклина М.А.

Strengthening the Effectiveness of the Candidate Influenza Vaccine by Combining Conserved Sequences of Hemagglutinin and M2 protein

The development of universal influenza vaccine a vaccine directed to all subtypes of human influenza A viruses is the really actual problem task. This paper presents the comparative characteristic of the specific activity of various recombinant proteins consisting of antigenic determinants of influenza A virus the ectodomain of the M2 protein (M2e) and a fragment of the second subunit of the hemagglutinin (the amino acid sequence 76 130). Flagellin Salmonella typhimurium protein was used as carrier protein and as adjuvant. We use two forms of flagellin: full size and with deleted hypervariable region. The proteins showed high immunogenicity , and the ability to prevent lethal infection of influenza virus in mice. Full-length flagellin with HA2 (76 130) and M2e on the C-terminus (protein Flg-HA2-4M2e) demonstrated the most protective properties. It provides 100% survival immunized mice that were challenge with a high dose of influenza A (H3N2) 10 LD50. Proteins containing only full sized flagellin with M2e or flagellin truncated form with M2e at the C-terminus and HA2 within the hypervariable region, protected 75% of animals from lethal infection. Protein Flg-HA2-4M2e is promising for further study as a vaccine.

Усиление эффективности кандидатной вакцины против гриппа сочетанием консервативных последовательностей гемагглютинина и М2 белка

Л. М. Цыбалова1 (sovet@influenza.spb.ru), Л.А. Степанова1, Р.Ю. Котляров2, Е. А. Блохина2, М.А. Шуклина1, Е.С. Марданова2, А. В. Коротков1, М. В. Потапчук1, Н. В. Равин2

Разработка универсальной вакцины против гриппа - вакцины, направленной на все субтипы вирусов гриппа человека, - является наиболее актуальной современной задачей в специфической профилактике гриппа. В настоящей статье дана сравнительная характеристика специфической активности нескольких вариантов рекомбинантного вакцинного белка, включающего антигенные детерминанты вируса гриппа - эктодомен белка М2 (М2е) и фрагмент второй субъединицы гемагглютинина (аминокислотная последовательность 76 -130). В качестве белка-носителя и адъюванта был выбран флагеллин - белок Salmonella typhlmurlum как полноразмерный, так и с делетированной гипервариабельной частью.

На экспериментальных животных показана высокая иммуногенность препаратов и способность предотвращать летальность при инфицированнии вирусом гриппа. Наибольшей протективностью обладал гибридный белок Flg-HA2-4M2 - полноразмерный флагеллин с НА2 (76 - 130) и М2е на С-конце. Препарат обеспечивал 100% выживаемость при заражении высокой дозой вируса гриппа A(H3N2) - 10 LD50. Белки, содержащие только полноразмерный флагеллин с М2е или укороченную форму флагеллина с М2е на С-конце и с НА2 в гипервариабельном участке, защищали 75% животных от летальной инфекции. Белок Flg-HA2-4M2 перспективен для дальнейшего исследования в качестве вакцины. Ключевые слова: грипп, вакцинация, рекомбинантный белок, иммуногенность, протективность

Strengthening the Effectiveness of the Candidate Influenza Vaccine by Combining Conserved Sequences of Hemagglutinin and M2 protein

L.M. Tsybalova1 (sovet@lnfluenza.spb.ru), L.A. Stepanova1, R.Yu. Kotlyarov2, E.A. Blokhlna2, M.A. Shukllna1, E.S. Mardanova2, A.V. Korotkov1, M.V. Potapchuk1, N.V. Ravln2

The development of unlversal lnfluenza vacclne - a vacclne dlrected to all subtypes of human lnfluenza A vlruses - ls the really actual problem task. Thls paper presents the comparatlve characterlstlc of the speclflc actlvlty of varlous recombinant protelns conslstlng of antlgenlc determlnants of lnfluenza A vlrus - the ectodomaln of the M2 proteln (M2e) and a fragment of the second subunlt of the hemagglutlnln (the amlno acld sequence 76 - 130). Flagellln - Salmonella typhlmurlum proteln was used as carrler proteln and as adjuvant. We use two forms of flagellln: full slze and wlth deleted hypervarlable reglon. The protelns showed hlgh lmmunogenlclty, and the ablllty to prevent lethal lnfectlon of lnfluenza vlrus ln mlce. Full-length flagellln wlth HA2 (76 - 130) and M2e on the C-termlnus (proteln Flg-HA2-4M2e) demonstrated the most protectlve propertles. It provldes 100% survlval lmmunlzed mlce that were challenge wlth a hlgh dose of lnfluenza A (H3N2) - 10 LD50. Protelns contalnlng only full slzed flagellln wlth M2e or flagellln truncated form wlth M2e at the C-termlnus and HA2 wlthln the hypervarlable reglon, protected 75% of anlmals from lethal lnfectlon. Proteln Flg-HA2-4M2e ls promlslng for further study as a vacclne.

Key words: lnfluenza, vacclnatlon, recombinant proteln, lmmunogenlclty, protectlon

Главная задача в области профилактики гриппа в настоящее время заключается в создании вакцин, эффективных против широкого круга вирусов. Преимущество такого рода универсальных вакцин над традиционными очевидно: отсутствует необходимость в ежегодном получении новых реассортан-тов и обновлении штаммового состава вакцин; исключаются случаи несоответствия циркулирующих в конкретном сезоне вирусов и вирусов, вошедших

в состав вакцин; исключается отставание в наработке нужного количества вакцин от скорости распространения нового вируса; не требуется ежегодная вакцинация населения.

В силу высокой консервативности и обильной презентации на инфицированных клетках, эктодо-мен белка М2 (М2е) - один из наиболее популярных кандидатов для создания универсальных вакцин [2 - 5]. Рядом авторов была показана, в том числе и в клинических исследованиях, высокая иммуногенность конструкций c М2е на разных белковых носителях: флагеллине, коровом антигене вируса гепатита В, Р-белке норовируса, на на-ночастицах золота и т.д. [3, 5 - 7]. Большинство кандидатных вакцин с М2е ускоряло выздоровление при последующем заражении вирусами гриппа, уменьшало выраженность симптомов, предотвращало гибель лабораторных животных. Вместе с тем, очевидно, что для более полного купирования инфекции необходимо комбинировать М2е с другими белками, индуцирующими вирус-нейтра-лизующие антитела (АТ). Одна из стратегий создания вакцин широкой направленности заключается во включении в состав вакцинного белка второй субъединицы гемагглютинина (НА2). В отличие от первой субъединицы гемагглютинина (НА1) вторая субъединица (стебель) менее подвержена мутациям и является более консервативной [8]. Показано, что антитела к М2е и эпитопам НА2 защищают от инфекции при пассивном переносе сывороток от иммунных животных [9] и что комбинация этих эпи-топов в одном препарате делает его более эффективным и универсальным [10].

Значимость НА2 специфических антител для ге-теросубтипической защиты обусловлено их кросс-реактивностью, которая реализуется несколькими путями: НА2 специфические антитела ингибируют слияние вирусной и клеточной мембран, предотвращают конформационные изменения НА, индуцируемые низким рН, блокируют процесс внедрения пептида слияния в эндосомальную мембрану. Ряд авторов показали эффективность включения в вакцину укороченного фрагмента НА2, содержащего пептид слияния и большую а-спираль [8, 11]. Нейтрализующие АТ к эпитопам НА образуются при вакцинации и естественной инфекции, но относительно в небольшом количестве. Предполагается, что эти АТ бустировались во время пандемии 2009 года и внесли вклад в затухание циркуляции сезонных (допандемических) вирусов гриппа А(Н^1).

Вместе с тем, и М2е, и НА2 76 - 130, имея небольшой молекулярный вес, являются сами по себе слабыми иммуногенами и нуждаются в крупной молекуле-носителе. В качестве белкового носителя вирусных пептидов был взят флагел-

лин - жгутиковый белок Salmonella typhimurium. Флагеллин обладает выраженными адъювантными свойствами, так как является лигандом TLR5 и через адаптерный белок MyD88 активирует клетки CD4+ и дальнейшую индукцию синтеза специфических иммуноглобулинов. Еще одним преимуществом флагеллина как носителя является возможность введения гибридных белков на его основе интраназально.

Цель настоящего исследования состояла в создании рекомбинантных белков, включающих консервативные для вируса гриппа А антигенные детерминанты и в оценке их иммуногенности и протективности.

Материалы и методы

Конструирование и экспрессия рекомбинантных белков. В качестве консервативных пептидов вируса гриппа, предназначенных для включения в состав рекомбинантных вакцинных белов, были выбраны:

M2h - консенсусная последовательность протеина М2е штаммов вируса гриппа А человека: SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD;

M2k - M2e вируса птичьего высоко патогенного гриппа A/Kurgan/05/2005 H5N1: SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD;

НА2 - консенсусная аминокислотная последовательность (ак 76 - 130) второй субъединицы НА вирусов гриппа А субтипов Н3 и Н7, относящихся ко второй филогенетической группе: RIQDLEKYVED TKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQL RENA.

Соответственно на основе флагеллина были сконструированы три белка:

Flg-4M2е - молекула флагеллина с присоединенными на С конце двумя копиями М2к в последовательности M2h-M2k-M2h- М2к;

Flg-HА2-4M2е - последовательность флагеллина, к которой на С конце присоединен консенсус-ный фрагмент для субтипов Н3 и Н7 второй субъединицы (ак 76 - 130) НА и последующие 4 копии М2е (M2h-M2k-M2h- M2k);

FlgSh-HA2-4M2е - молекула флагеллина, в которой гипервариабельная (ГВ) часть заменена на консенсусный фрагмент второй субъединицы НА (ак 76-130) вирусов гриппа А II филогенетической группы. К С-концу присоединены 4 копии М2е пептида от человеческих и птичьего вирусов.

Аминокислотная последовательность НА2 разных вирусов была взята из баз данных GISAID и GenBank. Последовательности выравнивали с использованием сервера MAFFT и алгоритмов FFT-NS-i, FFT-NS-2 и анализировали в программном пакете Unipro UGENE v.1.14.0. Поиск экспериментальных B- и СD4+ T-клеточных эпитопов, гомологичных участкам НА2, проводили в базе данных Immune Epitope Database. Поиск вероятных Т-клеточных эпитопов осуществляли с использованием NetCTLpan1.1 Server.

Искусственно созданные гены, кодирующие химерные белки, вводили в плазмиду pQE30 (Qiagen) с помощью стандартных генно-инженерных методов. Были получены экспрессионные векторы: pQE30-Flg-4M2e, pQE30-Flg-HA2-4M2e, pQE30-FlgSh-HA2-4M2e. Для создания штаммов-продуцентов рекомбинантных белков соответствующими экспрессионными векторами трансформировали штамм E. coli DLT1270 - производный от штамма DH10B, в хромосому которого интегрирован ген репрессора лактозного оперона lacI. Культуры штаммов-продуцентов выращивали в среде LB при 37 °С, при достижении оптической плотности культуры OD 600

0,5 - 0,6 в среду вносили IPTG (до 0,1 мМ). Штаммы-продуценты рекомбинантных белков культивировали далее 12 - 14 часов при 28 °C (Flg-4M2e), 4 часа при 28 °C (Flg-HA2-4M2e), либо в течение ночи при 30 °С (FlgSh-HA2-4M2e). От клеточного лизата белки очистили с помощью металло-аффинной хроматографии на Ni сорбенте. Белковые препараты анализировали с помощью SDS-PAGE.

Электрофорез и иммуноблот. Электрофорез в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) проводили в денатурирующих условиях по методу Лэммли. Подробное описание методики приведено ранее [4]. Полосы рекомбинантных белков определяли окрашиванием мембраны мышиными монокло-нальными анти-М2е АТ 14C2 (ab5416, Abcam, UK) и кроличьим поликлональными АТ, специфичными для бактериального флагеллина (ab93713, Abcam, UK). Мембрану инкубировали 1 час при комнатной температуре с первичными антителами, разведенными в ФБР с 0,1% Твин 20 (ФБРТ) и 3% БСА, затем отмывали в ФБРТ. Белки выявляли окрашиванием мембраны в течение 1 часа при комнатной температуре вторичными антителами (козьи анти-мыши-ные IgG, Abcam, UK), меченными пероксидазой хрена и последующей инкубацией в течение 5 мин с субстратом TMB (тетраметилбензидин) Immunoblot solution (Invitrogen, США).

(протокол заседания Комиссии по биоэтике №10/1 от 14 марта 2016 г.).

Получение сывороток крови и бронхоальвео-лярных лаважей. Образцы крови и бронхоальве-олярные лаважи (БАЛ) получали от пяти мышей каждой группы через 2 недели после третьей иммунизации, после эвтаназии в С02-камере (Vet Tech Solutions, Великобритания). Для получения сыворотки кровь инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С. После образования сгустков крови образцы помещали на поверхность льда и охлаждали в течение 1 ч с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 400 g. Аликвоты сыворотки крови (по 30 мкл) замораживали при температуре -20 °С. Для получения БАЛ труп животного фиксировали на операционном столике. Производили разрез кожи по средней линии от нижней челюсти. В нижнюю часть трахеи в направлении легких вводили катетер на глубину 3 - 5 мм. Дважды промывали бронхи и легкие 1 мл ФБР. БАЛ центрифугировали в течение 15 мин при 400 g, отбирали аликвоты надосадка и замораживали их при температуре -20 °С.

Репродукция вирусов гриппа в легких. На 6-ые сутки после заражения у 3 мышей из каждой группы после эвтаназии забирали легкие. Легкие го-

могенизировали, центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин. До начала работы все образцы были заморожены и хранились при температуре -20 °С. Выделение вируса проводили титрованием легочной суспензии мышей на культуре клеток MDCK. Клетки заражали серийными десятикратными разведениями легочного гомогената (в квадрипликатах) от 10-1 до 10-8 и инкубировали в термостате (36,0 ± 0,5 °С) в течение 72 часов. Уровень репродукции вируса в культуральной жидкости оценивали в реакции гемагглютинации эритроцитов с 1% взвесью в физиологическом растворе. Инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча (1938 г.). За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации и выражали в логарифмах 50% тканевой цитопатической инфекционной дозы вируса (^ ТЦИД50).

Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Рп7т V 6.0. Статистическую значимость различий титров антител оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни и сравнение показателей выживаемости - критерия Мантела-Кокса. Различия считали значимыми при р Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Иммунный ответ привитых мышей на НА2 также оценивали в реакции иммуноферментного анализа. Как видно на рисунке 2Б, более высокие титры IgG (1:1100) обнаружены в сыворотках мышей, привитых белком с локализацией НА 76 - 130 в гипервариабельной части молекулы флагеллина (р

Были проанализированы 201 штамм вирусов гриппа А и В, выделенные в эпидемические сезоны 2006–2009 годов и 10 пандемических вирусов гриппа А субтипа H1N1v 2009 года выделения.

С помощью программ Vector NTI8 и MEGA2.1 предсказаны первичные аминокислотные последовательности гемагглютинина, нейраминидазы и М2-белка, построены филогенетические деревья и элайнменты вирусов гриппа A двух субтипов (H1N1, H3N2) и вируса гриппа B, циркулировавших на территории России в 2007–2009 гг.

В последние годы наблюдалась активизация вирусов гриппа A субтипа H1N1. Доля этих вирусов увеличилась c 12% в 2005–2006 годах, до 60% в 2007–2008 годах от общего количества выделенных штаммов. Активизация была связана с появлением на эпидемической арене вирусов новой антигеной разновидности.

Для вирусов гриппа А субтипа H1N1 2006 и 2007 годов выделения было показано увеличение гетерогенности популяции. Вирусы гриппа А (H1N1), выделенные в 2006 году, подразделялись на две группы: вирусы подобные штамму А/Н.Каледония/20/99 (клайд 1) и вирусы, отличающиеся как от референс-штамма А/Н.Каледония/20/99, так и от референс-штамма 2007 года А/Соломоновы острова/3/06 (клайд 2а). Эти штаммы образовали клайд 2d. Вирусы 2007 года выделения содержали замены, характерные как для штаммов 2006 года (S36N, T82K, R145K, V165A), так и оригинальные (E169K, N183T, R188S, A189T).

Штаммы вируса гриппа А подтипа H1N1 2007–2008 годов выделения по молекулярно-генетическим характеристикам были родственны штамму вируса гриппа А/Брисбен/59/07 (клайд 2В), рекомендованному ВОЗ для производства гриппозных вакцин. Большинство изолятов 2008 года кластеризовались в отличную от изолятов 2006–2007 годов выделения эволюционную группу. У них были выявлены отличия по шести аминокислотным позициям от вакцинного штамма А/Новая Каледония/20/99, по пяти позициям от вакцинного штамма А/Соломоновы Острова/3/06 и по восьми аминокислотным позициям от российских изолятов 2006–2007 годов выделения.

Часть штаммов вируса гриппа А подтипа H1N1, выделенных в сезоне 2008–2009 года, по молекулярно-генетическим характеристикам была родственна вакцинному штамму вируса гриппа А/Брисбен/59/07 (клайд 2В), а часть штаммов — штамму вируса гриппа A/Москва/5/08, выделенному в эпидемический период 2007–2008 года (клайд 2С) и отличалась по 6 аминокислотным позициям в молекуле гемагглютинина от штамма вируса гриппа А/Брисбен/59/073.

Согласно предсказанным аминокислотным последовательностям HA пандемического вируса — штамма А/Санкт-Петербург/04/2009v содержит в 83 положении сериновый остаток, также как и референс-штамм А/Техас/05/2009. Вместе с тем, выявлены отличия Санкт-Петербургского штамма от прототипных штаммов — две замены аминокислотных остатков I189L и T203S. Все проанализированные штаммы (8 штаммов) содержали в нейраминидазе аминокислотную замену остатка валина на изолейцин в 136 позиции (также как и штамм А/Москва/01/2009v). Кроме того, штамм A/Санкт-Петербург/01/2009v содержит замену D128A, а штаммы A/Санкт-Петербург/02/2009v и A/Санкт-Петербург/04/2009v — D248N по сравнению с прототипными штаммами. Таким образом, согласно анализу предсказанных аминокислотных последовательностей белков пандемические штаммы вируса гриппа А/H1N1v, выделенные в Санкт-Петербурге, родственны штаммам А/Техас/05/2009 и А/Калифорния/07/2009.

Штаммы вируса гриппа А H3N2, выделенные в 2007 и 2008 годах, по результатам филогенетического анализа и предсказанной первичной аминокислотной последовательности гемагглютинина вирусы можно было разделить на три группы, эволюционно близкие к вакцинному штамму A/Висконсин/67/2005 (H3N2) (2007 год) и штамму вируса гриппа А/Брисбен/10/07 (H3N2), рекомендованному ВОЗ для производства гриппозных вакцин (2008 год). Большинство изолятов 2008 года кластеризовались в отличную от изолятов 2006-2007 года выделения эволюционную группу, с двумя аминокислотными заменами в НА1.

Штаммы вируса гриппа А подтипа H3N2 2008–2009 годов. выделения, по молекулярно-генетическим характеристикам родственны вакцинному штамму А/Брисбен/10/07 (H3N2) и являются эволюционным продолжением штаммов предыдущего эпидемического периода. Они сохранили замены, характерные для штамма А/Брисбен/10/07 E50G в антигеном сайте С.

Филогенетический анализ штаммов вирусов гриппа В, циркулировавших в эпидемические сезоны 2006–2009 годов. показал, что данные штаммы относились к двум линиям: Викторианской и Ямагатской. В 2006–2007 годах циркулировали преимущественно вирусы гриппа В, относящиеся к Викторианской линии. В 2008 году, согласно филогенетическому анализу все проанализированные российские изоляты (15 штаммов) относились к Ямагатской линии. Большинство штаммов (94%) вируса гриппа В 2008–2009 годов выделения (32 штамма) по молекулярно-генетическим характеристикам относятся к Викторианской линии.

Проведен анализ мутаций, определяющих устойчивость вирусов гриппа А к ремантадину. Установлено, что у 23,0% вирусов гриппа А подтипа H1N1и 100% штаммов подтипа H3N2 в 31 положении М2-белка находится аспарагин, что, может свидетельствовать об устойчивости этих штаммов к ремантадину. По данным секвенирования показано отсутствие штаммов вируса гриппа А подтипа H1N1, устойчивых к ремантадину и озельтамивиру одновременно.

Проведен анализ устойчивости изолятов вируса гриппа А субтипа H1N1 2007–2009 годов выделения к озельтамивиру методами RFLP (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) и секвенирования фрагмента гена NA. Показано, что 80,5–91,4% изолятов имели замену гистидина на серин в гене NA в положении 275, что определяло их устойчивость к озельтамивиру. Все проанализированные штаммы A H1N1v не имели подобной мутации.

У проанализированных штаммов A H1N1v показано отсутствие аминокислотных замен в белках М2 и NS2 по сравнению со штаммами вируса гриппа А/Техас/05/2009 и А/Калифорния/07/2009. Штаммы из Санкт-Петербурга, также как и прототипные штаммы имели мутацию в белке М2, ответственную за устойчивость к ремантадину.

По итогам выполнения опубликованы 4 статьи (3 из них в иностранных изданиях), 3 тезисов в материалах международных конференций, сделано 14 докладов на Российских и зарубежных конференциях и съездах.