Белки рнк гепатита с

Определение в крови иммуноглобулинов IgG к белкам вируса гепатита С, которое используется для диагностики этого заболевания.

Антитела к белкам гепатита С;

Antibodies to structural and non-structural proteins of HCV;

Antibodies to HCV.

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исключить из рациона жирную пищу в течение 24 часов до исследования;
Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Гепатит С – вирусное заболевание печени, отличительной чертой которого является бессимптомное течение и высокая частота прогрессии в хронический гепатит, цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному. Основной путь передачи гепатита С – через кровь и ее компоненты. Группы риска по заражению ВГС:

Медицинские работники;
Люди, использующие инъекционные наркотики;
Пациенты с ВИЧ;
Люди, которым были сделаны татуировки с помощью нестерильных инструментов;
Пациенты, получившие переливание крови или ее компонентов до 1992 г.;
Пациенты, получившие трансфузию факторов свертывания крови до 1987 г.;
Пациенты, получающие лечение гемодиализом в течение длительного времени;
Дети, рождённые от матерей с ВГС.

Следует отметить, что по крайней мере в 20 % случаев источник заражения установить не удается. В России наблюдается рост заболеваемости гепатитом С: в период с 1999 по 2011 гг. заболеваемость хроническим ВГС выросла в 3 раза. Как правило, пациенты с ВГС не догадываются о своем заболевании.

Вирус гепатита С (ВГС) – РНК-вирус, принадлежащий семейству Flaviviridae. При транскрипции его генома образуется единый белок длиной около 3000 аминокислот, который затем разрезается с помощью пептидаз клетки-хозяина и вирусных пептидаз с образованием структурных и неструктурных белков:

Структурные белки (коровый белок, Е1 и Е2, от англ. envelope glycoproteins – гликопротеины оболочки) необходимы для формирования вирусного капсида;
Неструктурные белки (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B, от англ. non-structural – неструктурные) выполняют различные регуляторные функции.

В ответ на заражение вирусом гепатита С в организме человека начинают вырабатываться антитела – иммуноглобулины M и G, которые можно исследовать для диагностики гепатита. Следует отметить, что при гепатите С синтез иммуноглобулинов М может наблюдаться на разных стадиях заболевания, как при остром, так и при хроническом гепатите, и поэтому не имеет никакого диагностического значения. Это важное отличие диагностики гепатита С от гепатита В (выявление иммуноглобулинов М при гепатите В наблюдается только в острую стадию). Таким образом, все серологические тесты для диагностики гепатита С основаны на выявлении иммуноглобулинов G к белкам этого вируса.

Структурные и неструктурные белки иммуногенны в разной степени. Показано, что наиболее выраженными иммуногенными свойствами обладают следующие белки (в скобках указан процент пациентов с хроническим гепатитом С, у которых в крови обнаруживаются антитела к указанному белку):

Менее иммуногенны белки E2 (31 %), NS4A(28 %) и E1 (22 %). NS2 и NS5B имеют очень слабые иммуногенные свойства, и антитела к ним у пациентов с ВГС выявляются редко.

Антитела к ВПС могут быть определены в крови приблизительно через 8 недель после первичного заражения. Ложноотрицательные результаты могут наблюдаться у людей с иммунодефицитом (например, ВИЧ-инфицированных), почечной недостаточностью и эссенциальной смешанной криоглобулинемией. Ложноположительные результаты также встречаются.

Вирусы гепатита С неоднородны по генетическому составу. На этом основании выделяют 6 генотипов ВПГ, геномы которых различаются на 30-35 %, и множество подтипов, различающихся на 20-25 %. В восточной Европе и США чаще встречаются генотипы 1a и 1b, тогда как для других стран характерны другие генотипы (например, Египет – генотип 4, Южная Африка – генотип 5). Показано, что иммунный ответ пациентов, инфицированных разными генотипами ВГС, различается. Это особенно справедливо в отношении антител к белкам E1, E2, NS3, NS4A и NS5A.

Качественный и количественный состав антител к ВГС у пациента остается достаточно постоянным в течение заболевания, в том числе и после проведенного лечения.

Антитела к гепатиту С – чувствительный, но недостаточно специфичный метод диагностики этого заболевания. Поэтому серологические тесты – это скрининговые тесты диагностики гепатита. При получении положительного результата исследования антител на гепатит С обязательно проводят подтверждающее исследование – анализ на РНК вируса с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР). Кроме того, при подтверждении диагноза "гепатит С" может понадобиться генотипирование ВГС и гистологическое исследование печени или неинвазивные методы определения состояния печени (такие как ФиброМакс).

Для чего используется исследование?

Для диагностики гепатита С.

Когда назначается исследование?

При профилактическом обследовании, особенно если пациент принадлежит к группе риска по гепатиту С;
в некоторых случаях при устройстве на работу.

Что означают результаты?

Выдается по компонентам:

IgG к антигену core

IgG к антигену NS3

IgG к антигену NS4

IgG к антигену NS5

гепатит С;
ложноположительный результат (чаще у пациентов, не относящихся к группам риска, например доноров крови).

норма;
ложноотрицательный результат (сопутствующая ВИЧ-инфекция, почечная недостаточность, эссенциальная смешанная криоглобулинемия).

Что может влиять на результат?

Время, прошедшее с момента заражения;
Состояние иммунной системы;
Сопутствующие заболевания почек;
Генотип вируса гепатита С.

Это скрининговый тест. При получении положительного результата необходим дополнительный, подтверждающий тест (определение РНК вируса с помощью ПЦР);
результаты анализа следует интерпретировать с учетом дополнительных клинических, лабораторных и инструментальных данных.

16 Гистологическое исследование гепатобиоптата (биоптата печени) с использованием стандартных методик

Кто назначает исследование?

Инфекционист, терапевт, врач общей практики.

Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Мироджов Г. К., Саттарова М. И., Одинаев Р. И., Юнусов М. С., Иноятова С. А.

The authors shown, that the presence of antibodies in structural core-protein and non structural NS5 to fibers of a C virus in whey of blood of patients having chronic hepatitis specifies high replication phase of virus, especially of its genotype 1b, which correlate with activity of pathological process.

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН ____________________________________2007, том 50, №3________________________________

Академик АН Республики Таджикистан Г.К.Мироджов, М.И.Саттарова, Р.И.Одинаев, М.С.Юнусов, С.А.Иноятова РОЛЬ СТРУКТУРНОГО И НЕСТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА С В РАЗВИТИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА

Основным структурным белком вируса гепатита С является соге-протеин, который обладает РНК-связывающей активностью и образует нуклеокаспид вируса [1]. Именно с этим структурным белком связывают прямое цитопатическое действие вируса С на печеночную клетку Одновременно с этим показано, что данный белок обладает онкогенным эффектом. В эксперименте было установлено, что соге-протеин вируса гепатита С подавляет процесс апоптоза и тем самым способствует развитию опухолевого процесса. Однако до настоящего времени все еще не выяснено, коррелирует ли наличие соге-протеина с уровнем РНК и различных генотипов вируса.

К неструктурным белкам вируса гепатита С, которые принимают важное участие в процессе его репликации, относятся: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, и NS5B [2]. Неструктурный белок NS2 является цинк-зависимой протеиназой, а NS3 - серин-протеиназой, участвующей в сборке вириона. Функция NS4 недостаточно известна, хотя предполагается, что этот белок участвует в качестве Ко-фактора для NS3 серин-протеазы [3]. Достаточно хорошо выяснена функция белка NS5A. Прежде всего показано, что данный белок является РНК-зависимой РНК-полимеразой - ферментом, который крайне необходим для синтеза вирусной РНК, т.е. репликации вируса С [4]. Рядом авторов [4, 5] установлено, что NS5A подавляет активность интерферона. G. Reyes (2002) показал, что NS5A ингибирует процесс апоптоза и тем самым становится фактором канцерогенеза.

Вместе с тем до настоящего времени не проводились сравнительные исследования на наличия анти-NSs, РНК вируса, его генотипов в сыворотке крови и структурных изменений печени больных хроническим гепатитом вируса С.

Целью настоящего исследования является выяснение роли структурного и неструктурных белков вируса гепатита С в патогенезе хронического гепатита.

Материалом исследования служили результаты исследования антител к соге-протеину, неструктурным белкам NS3, NS4 NS5, а также уровня РНК вируса С у 284 больных хроническим гепатитом. У 15 больных проведена пункционная биопсия печени. Антитела к

структурному и неструктурным белкам вируса С определяли иммуноферментным анализом,

а уровень РНК вируса С и его генотипов методом ПЦР .

Установлено, что наличие анти-ИСУ в сыворотке крови сопровождается различной степенью виремии. Из 284 больных хроническим гепатитом вируса С высокая виремия (более 100 тыс. копий/мл) обнаружена у 172, а низкая (30 тыс. копий/мл) - у 112 пациентов. Антитела к соге-протеину были выявлены у всех 172 (100%) больных с высокой и у 21 (18.8%) с низкой виремией. Эти данные свидетельствуют о том, что антитела к соге-протеину не всегда коррелируют с наличием РНК вируса в периферической крови. При низкой концентрации РНК антитела к соге-протеину образуются крайне редко.

При изучении антител к неструктурным белкам выявлена следующая картина. Из 172 больных с высокой виремией антитела к N83 были обнаружены у 137 (79.6%), а у пациентов с низкой виремией эти антитела выявлялись у 79 (72.3%) из 112. Аналогичная картина была установлена также при изучении антител к N84. Из 172 больных с высокой виремией антитела к N84. были обнаружены у 126 (73.2%), а из 112 - с низкой - у 81 (72.3%).

Итак, уровень антител к неструктурным белкам N8;? и NS4 вируса С не коррелирует с его активной репликацией. Совершенно другая картина наблюдается при исследовании наличия антител к неструктурному белку N85. Из 172 больных с высокой репликаций вируса С антитела к неструктурному белку NS5 были выявлены у 143 (82.5%), а при низкой виремии из 112 - у 46 (41.1%) (табл. 1).

Наличие анти-соге и антител к неструктурным белкам в сыворотке крови больных ХГС

с различной степенью виремии

Степень виремии Всего больных ^М-к соге-протеину Антитела к N83 Антитела к N84 Антитела к N85

Высокая виремия (>100 тыс. копий/мл) 172 172 (100%) 137 (79.6%) 126 (73.2%) 143 (82.5%)

Низкая виремия ( Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

При гистологическом исследовании пунктатов печени 11 больных с высокой виремией и генотипом 1в, а также наличием антител к соге-протеину и NS5 обнаружена картина хронического активного гепатита. В пунктатах печени выявлялась выраженная жировая (мелко- и крупнокапельная) и гидропическая дистрофия гепатоцитов, инфильтрированные плазмолимфоцитарными элементами очаги некроза, иногда с формированием лимфоидных фолликулов, множество апоптотических тел. Портальные тракты были расширены за счет фиброза и гис-тио-лимфоцитарной инфильтрации.

В пунктатах печени 4-х больных (у 2-х с генотипом 2а и у 2-х - 3 а), у которых не были выявлены признаки высокой виремии, антитела к соге-протеину и N85 обнаруживались признаки хронического гепатита минимальной активности - мелкокапельное ожирение гепато-цитов, единичные очаги некроза и апоптотических тел, умеренное расширение, фиброз и гистио-лимфоцитарная инфильтрация портальных трактов.

Таким образом, нами установлена прямая корреляция между степенью виремии вируса С, наличием антител к NS5 и гистологической активностью процесса в печени. Эти данные свидетельствуют о том, что антитела к неструктурному белку являются также маркером активной репликации вируса С. Более того, нами установлено, что антитела к NS5 чаще всего обнаруживаются при генотипе 1в и его сочетании с генотипом 3 а. В то же время при генотипе 2а они практически не выявляются.

Ряд исследователей [4, 5] показали, что неструктурный белок №5 вируса С подавляет активность эндогенного интерферона и тем самым способствует активной репликации вируса, что подтверждается и нашими результатами.

Под влиянием неструктурного белка NS5 происходит нарушение баланса ионов кальция в гепатоците, в результате которого усиливается развитие окислительного стресса, являющегося важнейшим фактором некроза и коллагеногенеза в печени при гепатите С. Наблюдаемая у больных хроническим гепатитом С выраженная слабость также связана с усилением окислительного стресса [6]. Некоторые авторы выяснили, что неструктурный белок NS5 подавляет процесс апоптоза инфицированных гепатоцитов и тем самым становится фактором развития гепатоцеллюлярной карциномы [7]. Этот эффект осуществляется путем взаимодействия белка NS5 с белком Р53, который является ключевым регулятором регенерации и апоп-тоза гепатоцитов. Белок NS5 резко подавляет функцию Р53 и тем самым способствует онкогенезу [8].

Наличие структурного соге-протеина и неструктурного белка NS5 вируса С в периферической крови свидетельствует о высокой репликации вируса, что проявляется в повышении уровня РНК вируса с развитием стеатоза, некроза и фиброза печени.

Высокая частота обнаружения неструктурного белка NS5 у больных хроническим вирусным гепатитом С с генотипом 1в и высоким уровнем РНК подтверждает факт его участия в развитии резистентности к интерферонотерапии.

Институт гастроэнтерологии Поступило 7.09.2006 г.

АН Республики Таджикистан

1. Srinivas R.B., Ray R.B., Meyer K. - Virus Res., 1996, 45, 87-92.

2. De Francesco R. - J. Hepatol, 1999, 3L, p. 47-53.

3. Gale M.J., Blakey C.M., Kwieciszewski B. - Mol. Cell. Biol. 1998, 18, 5208-5218.

4. Enomoto N., Sauma I., Asahina V. - J. of virology. 1995, v. 96, p. 224-230.

5. Pfugheber J., Fredericken B., Sumpter R. - Proc. Natl. Acad. Sci USA., 2002, v. 99, p. 4650-4655.

6. Мансуров Х.Х., Мироджов Г.К., Мансурова Ф.Х. - Пробл. ГАЭЛ, 2005, №1-2, с. 76-83.

7. Lemon S.M., Lerat H., Weinman S.A. - Trans. Am. Climatol. Assoc., 2000, v. 111, p. 146-157.

8. Reyes G.R. - J. Biomedical Sci., 2002, v. 9, p. 187-197.

9. Lusida M.I., Nagano-Fujii M., Nidom C.A. - J. of clinical microb., 2001, v. 39, p. 3858-3854.

Г.К.Мирочов, М.И.Саттарова, Р.И.Одинаев, М.С.Юнусов, С.Иноятова НАКУПИ САФЕДАХ,ОИ СОХТОРЙ ВА ГАЙРИСОХТОРИИ ВИРУСИ С ДАР

ИНКИШОФИ ГЕПАТИТИ МУЗМИН

Муаллифон нишон доданд, ки микдори античисмчах,о ба мукобили сафедаи со-хтории еоге-протеин ва гайрисохтории NSS-и вируси С дар хуни беморони гепатити да-вомнок аз тачдиди вирус, намуди генотипи 1b ва чараёни баланди илтих,об ва некрози х,учайрах,ои чигар шах,одат медихднд.

G.K.Mirojov, M.I.Satorova, R.I.Odinaev, М.С/Yunusov, S.Inojatova ROLE OF STRUCTURAL AND NON STRUCTURAL PROTEINS OF C VIRUS IN DEVELOPMENT OF CHRONIC HEPATITS

Несмотря на то, что не удается получить ВГС в количествах, позволяющих провести его исчерпывающее электронномикроскопическое и вирусологическое изучение, определены следующие характеристики вируса гепатита С: диаметр вириона— 50 нм (по данным различных исследователей от 30 до 60 нм);

чувствительность к действию хлороформа; наличие белковой оболочки, коэффициент седиментации — не менее 150 S. Исследование плавучей плотности ВГС, полученного in vivo и in vitro, установило различия в их коэффициентах седиментации. Вирус, выделенный из плазмы больного острым гепатитом С и экспериментально зараженной шимпанзе, имел плавучую плотность в градиенте сахарозы — 1,06 г/см 3 , тогда как плотность вируса полученного на культуре клеток,— 1,12 г/см 3 . Считают, что более низкая плавучая плотность ВГС, полученного in vivo, определяется его ассоциацией с липопротеинами низкой плотности, что может способствовать проникновению вируса в гепатоцит. Обнаружение в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С частиц с высокой плавучей плотностью 1,17 г/см 3 связывают с наличием комплекса ВГС с антителами.

ВГС инактивируется при температуре +60° С - в течение 30 минут, а при 100° С — за 2 минуты.

Геном ВГС представлен однонитевой линейной молекулой РНК положительной полярности протяженностью около 9400 нуклеотидов. Результаты клонирования и полного секвинирования РНК ВГС, а также физико-химические характеристики вируса позволили отнести ВГС к семейству Флавивирусов, выделив в отдельный род Гепацивирусов. Сравнительный анализ РНК ВГС с геномами других вирусов, входящих в данное семейство, выявил сходство с фрагментами геномов вирусов Денге второго типа и вируса пятнистости гвоздики (группа кариновирусов). Кроме того, зарегистрированы так называемые “локальные” гомологии (не более 16 нуклеотидов в регионе) с пестивирусами (вирус холеры свиней и вирус бычьей диареи). Наличие гомологии РНК ВГС и с геномами вирусов растений позволило предположить, что ВГС занимает промежуточное положение в эволюции вирусов между вирусами животных и растений.

Организация генома ВГС (рис. 7 ) подобна организации геномов других флавивирусов (например, вируса желтой лихорадки). В РНК ВГС выделяют зоны, кодирующие структурные и неструктурные (функциональные) белки.

Гены, кодирующие структурные белки, расположены у 5' области генома вируса, а неструктурные — у 3' области. На концах РНК ВГС имеются некодирующие участки размером приблизительно 340 и 60 оснований. РНК ВГС содержит единственную открытую рамку считывания, несущую информацию о вирусспецифическом полипротеине, размером около 3000 аминокислотных остатков, который, благодаря действию нескольких протеолитических энзимов вирусного и клеточного происхождения, разделяется на отдельные белки.

Установлено, что 5' область генома ВГС, кодирующая структурные белки вируса, короче аналогичных областей флави- и пестивирусов. Считается, что эта зона контролирует синтез четырех белков: Кор-белка - негликолизированного гидрофильного протеида (р 19), считающегося нуклеокапсидным белком; двух оболочечных белков, кодированных зоной Е1 (р18 и gp33) и Е2, ранее идентифицированной как зона ВГС-NSl, (р38 и gp72) и небольшого белка с неустановленной функцией. Белки, синтезированные с участков гена Е1 и Е2, считают гликопротеидами внешней оболочки вируса гепатита С (Env). Они играют роль в прикреплении и проникновении вируса в клетку. Высказывается предположение, что белки, кодируемые структурной зоной РНК ВГС, могут быть мишенью для нейтрализующих и протективных антител, т. е. эти белки, возможно, будут использованы для изготовления вакцины против гепатита С.

Область РНК ВГС, кодирующая неструктурные белки, состоит из следующих участков: NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a и NS5b. Белки, синтезированные с зон NS2 (р 23) и NS4 (р10 и р27), предположительно связывают с клеточной мембранной функцией. Белок, кодированный NS4a зоной, — многофункциональный полипротеид. Он обладает стабилизирующей функцией и способствует протеиназной/хеликазной активности белка, кодированного зоной, NS3. Кроме того, он регулирует фосфорелирование белка (р70), кодированного зоной NS5a, который обладает функцией репликазы. Кристаллографический анализ ВГС - хеликазы продемонстрировал наличие трех доменов, необходимых для репликации вируса. Предполагают, что информация, полученная при изучении данных структур, может стать основой изготовления лекарственных препаратов, ингибирующих ВГС- репликацию. Зона NS5b несет информацию о белке (р56), функция которого окончательно не установлена, однако считается, что он представляет собой РНК-зависимую РНК- полимеразу, необходимую для репликации вируса.

На 5' и 3' — концах РНК ВГС расположены нетранслируемые регионы. На 3' конце он состоит приблизительно из 50 нуклеотидов — полипиримидиновый (или полипуриновый) тракт.

Особенностью ВГС является чрезвычайно высокая гетерогенность его генома. Сравнительный анализ РНК изолятов ВГС, вы деленных не только в различных странах или в пределах одного государства, но даже от одного и того же больного на протяжении инфекции, выявил их вариабельность. Отличия в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях определены в участках РНК, кодирующих как структурные, так и неструктурные белки. Вместе с тем установлено, что максимальная гетерогенность генома регистрируется в генах, кодирующих оболочечные белки вируса. Выделяют два гипервариабельных участка РНК ВГС. Первый из них протяженностью в 90 нуклеотидов, расположен на 5' конце Е2 гена (HVR1 - hypervariable region). Второй (HVR2) гипервариабельный участок РНК ВГС (21 нуклеотид) примыкает к 3' концу HVR1. Изучение последовательностей РНК ВГС у больных, чей организм ответил или не ответил на лечение препаратами интерферона, позволил выявить участок РНК в NS5a регионе, возможно отвечающим за резистентность к лечению (interferon-sensitivity determining region - ISDR).

Анализ последовательностей РНК многочисленных изолятов ВГС, полученных в различных регионах мира, выявил существование основных групп вируса, обозначаемых типами или генотипами (с гомологией нуклеотидных последовательностей в РНК ВГС между ними менее 72%). Идентифицировано, как минимум, шесть основных генотипов вируса гепатита С, обозначаемых римскими цифрами от I до VI (по X. Окомото), или арабскими цифрами от 1 до 6 (по П. Симоне). Кроме того, исследования изолятов ВГС, полученных в Юго-Восточной Азии, позволили дополнительно выявить 5 генотипов (7—11). Сравнительный анализ гомологии РНК ВГС различных генотипов установил наличие более 100 субтипов (уровень гомологии между различными субтипами внутри генотипа - 72-86%). Кроме того, наличие различий в последовательностях в 1-14% определяет существование множественных вариантов вируса или квазивидов вируса. У инфицированного ВГС пациента одновременно могут находиться многие миллионы различных квазивидов ВГС. Их существование объясняют “ускользанием” вируса из-под иммунологического контроля организма, что определяет появление постоянно меняющихся антигенных структур вируса. Происходит постоянное соревнование между образованием новых антигенных вариантов и выработкой антигеннейтрализующих антител. Причем победителем постоянно оказывается вирус, а не иммунная система. Быстрое изменение вируса гепатита С лежит в основе длительного, возможно иногда и пожизненного, носительства ВГС.

Филогенетический анализ РНК ВГС позволил предположить, что разделение ВГС на генотипы могло произойти от 500 до 2000 лет назад, а разделение генотипа 1 на субтипы 1а и 1Ь более 300 лет назад.

При генотипировании ВГС, проведенном в различных регионах мира, установлено, что наибольшее распространение имеют генотипы Ia, Ib, 2a, 2b и За. Они доминируют в Европе, Северной Америке, Азии и Океании. В Европейских странах генотип Ib составляет — 50—91% (Германия—59%, Бельгия—65%, Венгрия—84%, Италия(Сицилия)—91%), а генотип Ia —не более 40% (Германия-32%, Дания-40%, Франция-35%). В США превалирует субтип 1а, который получил даже обозначение как “американский генотип ВГС”. Частота выявления генотипов 1а и Ib в США в среднем составляет 37% и 30% соответственно. Все остальные генотипированные вирусы представлены не более чем в 10%. В Японии, Тайване, Китае (особенно в Южном Китае), Сингапуре, Индонезии и Южной Корее наиболее часто типируют генотип Ib “японский генотип ВГС” (за исключением Филиппин, где частота генотипа 1а достигает-54,5%).

Генотипы 2a и 2b имеют более ограниченное распространение в мире, чем генотипы 1а и Ib , и имеют меньший удельный вес среди генотипов, представленных на данной территории. Наиболее часто 2 генотип представлен в странах Востока. Генотип 3 наиболее распространен в Таиланде (до 50%), Северной Европе (в Великобритании до 25%) и Австралии.

В странах Средней Азии, Северной и Центральной Африке широко представлен 4 генотип ВГС. Так, среди доноров носителей ВГС в Египте он представлен в 30-40%. Генотип 5а часто выявляется среди больных хроническим гепатитом в Южной Африке, а 6 генотип был идентифицирован в Гонконге.

В России доминирует генотип Ib , составляя в различных регионах Северной Евразии - 64,7%, на Дальнем Востоке - 80-83%, а в Центрально-Черноземном и Волго-Вятском регионах России - 50-56%. Генотип Ia наиболее часто типирован в Центральном, Северо-Западном, Волго-Вятском регионах — 11,2— 21,9%, в то время как на территории Восточной Сибири, Центрально-Черноземном районе и Урале его удается выявить крайне редко (до 5%). Генотипы За, 2а и 2Ь среди лиц с наличием ВГС в России также относят к редко выявляемым (За — 5,6—18,9%, 2а и 2b - 4,7-0,5%).

Применение генотипирования ВГС при изучении распространения гепатита С в различных группах населения продемонстрировало некоторые различия в частоте выявления того или иного генотипа в зависимости от пути инфицирования. Так например, в Европейских странах генотип 1а и За ассоциируется с заражением, произошедшим при внутривенном введении наркотиков, а 1Ь при переливании контаминированной ВГС крови или плазмы. В Италии установлено, что среди пациентов с ВИЧ-инфекцией чаще выявляется 1а генотип. Распространение того или иного генотипа ВГС связано с миграцией населения.

Косвенным показателем наличия того или иного генотипа ВГС может служить определение серотипа вируса. Обнаружение типоспецифических В-клеточных эпитопов, кодированных регионами NS4a и NS4b, делает возможным проведение серотипирования. Разработаны лабораторные и коммерческие варианты для серотипирования ВГС методом ИФА. Фирма Мюрекс (Murex Diagnostics, Dartford, UK) представила тест для определения серотипа ВГС с 1 по 6, используя для этого пептиды, кодированные NS4 зоной РНК ВГС. К сожалению, серотипирование не дает возможность разграничить субтипы ВГС (например, 1а и 1b ). При проведении серотипирования анти-ВГС необходимо помнить, что полученный результат может свидетельствовать как о текущей, так и о ранее перенесенной инфекции, вызванной ВГС, без наличия у данного пациента вируса.

Информация о репликации ВГС до сих пор крайне ограничена и в большинстве случаев носит противоречивый характер. Это положение можно объяснить частично крайне низкими концентрациями вируса в организме больных и носителей ВГС, а также отсутствием, до недавнего времени, доступной модели экспериментальной модели гепатита С. Однако исследования, проведенные в России (Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского) и в других странах (Канада), позволили разработать доступные экспериментальные модели “in vivo” и “in vitro”. Продемонстрирована способность ВГС вызывать вирусспецифическую гибель новорожденных мышей, инфицированных в мозг. Репродукция ВГС получена в первичных культурах клеток головного мозга мышей-сосунков, а также в культуре клеток почки эмбриона свиньи. Другая модель “in vivo”, созданная в Канаде, основана на имплантации линии клеток гепатомы человека (Huh-7) в печень голых мышей. После заражения Huh-7 клеток ВГС удавалось найти последовательности РНК ВГС в клетках печени и сыворотках крови мышей.

В соответствии с пунктом 3.1 приказа МЗ РФ 322 от 21 октября 2002 года с первого января 04 года запрещается использование в качестве подтверждающих для выявления анти-HCV антител тест-систем содержащих не полный спектр структурных и неструктурных белков. В связи с этим вопрос. Соответствуют ли на момент вступле-ния в действие данного требования все тест-системы, приведенные в приложении 4 к приказу (помимо приведенной под номером 6/2)?

Какие именно вирусные белки со-ставляют полный спектр и чье присутствие в тест-системе обязательно?

Кроме того, в литературе имеются сведения о значении для ранней диагностики гепатита С выявления антител относящихся к IgM. При остром течении заболевания антитела класса М появ-ляются на 2-3 недели раньше, чем антитела класса G. Ряд про-изводителей диагностических систем предлагают тест-системы, ориентированные на выявление именно антител класса М (к примеру, РекомбиБест анти-ВГС - IgM - стрип ). Для выявления антител, какого класса предназначены подтверждающие тест-системы?

Прочитано 173229 раз

Отвечаю на Ваши вопросы, несколько изменив их порядок

1. Какие именно вирусные белки составляют полный спектр и чье присутствие в тест-системе обязательно?

Геном гепатита С кодирует информацию о полипептиде, состоящем из структурных и неструктурных белков.

Структурные белки - это CORE или CAPSID (ядерные белки), Е1 и Е2 (или > E2/NS1) - оболочечные белки вируса.

Неструктурные белки - NS2, NS3, NS4, NS5 (кодируют хеликазу, протеазу, репликазу и РНК-полимеразу), т.е. белки не входящие в структуру вируса.

Разные участки генома обладают разной вариабельностью. Для тест-систем используют белки, кодируемые наиболее КОНСЕРВАТИВНЫМИ (не вариабельными) участками, Обязательные белки : это CORE, > NS3, NS4, эти белки есть у всех производителей, у многих производителей есть белок, кодированный зоной NS5.

2. В соответствии с пунктом 3.1 приказа МЗ РФ ? 322 от 21 октября 2002 года первого января 2004 года запрещается использование в качестве подтверждающих для выявления анти-HCV антител тест-систем, содержащих неполный спектр структурных и неструктурных белков. В связи с этим вопрос. Соответствуют ли на момент вступления в действие данного требования все тест-системы, приведенные в приложении 4 к приказу (помимо приведенной под номером 6/2)?

Прежде, чем отвечать, на данный вопрос, мне хотелось бы напомнить, что история создания диагностических препаратов развивалась от создания тест-систем первого поколения (с наличием белков, кодированных зонами NS3 и NS4) к второму поколению (дополнительно к уже имеющимся белкам был добавлен белок, кодированный Сore- зоной РНК ВГС) и к третьему поколению, в состав которого был добавлен белок информация о котором лежит в зоне NS5). По этому же пути шли и развивались подтверждающие тесты. При понимании данной ситуации необходимо помнить, что главными характеристиками использованных наборов для детекции антител является их чувствительность, специфичность и уровень выявляемости антител в той или иной популяции. Кроме того, существует правило для подтверждения специфичности полученного результата: применять тесты фирмы аналогичной с диагностикумом, примененным при скрининговом исследовании.

На наш взгляд, возникшая дискуссия, прежде всего, связана с диагностическим препаратом для выявления анти-ВГС фирмы (Франция), в котором не используется белок, кодированный зоной NS5, который присутствует во многих отечественных и зарубежных тест-системах. Многочисленные исследования, посвященные этому вопросу (прежде всего, научная группа и ), продемонстрировали, что этот белок не является столь обязательным для применения в диагностикумах. Это мнение основывалось на утверждении, что зона NS5 кодирует РНК-репликазу, а она есть у многих других РНК-содержащих вирусов и плюс является одним из наиболее вариабельных участков. По их мнению, наличие этого белка не дает преимуществ по чувствительности, а лишь увеличивает кол-во ложноположительных результатов.

Кроме того, по данным литературы (и по нашим собственным наблюдениям) образцы с наличием изолированных антител к белкам, кодированным зоной NS5, у лиц, инфицированных ВГС, не удается выявить. Показано, что значительное количество ложно-положительных результатов происходит из-за изолированной активности anti-NS5.

Считается, что высокое качество диагностических наборов прежде всего, определяется качеством подбора белков, кодированных CORE, NS3, NS4.

Подтверждением этого является и информация о том, что ученые такой уважаемой фирмы при разработке нового теста для выявления анти-ВГС на приборе отказались от использования белка, кодированного зоной РНК NS5.

В заключении моего ответа на поставленный вопрос, я хочу подчеркнуть, что я ни в коем случае не призываю к возвращению к диагностикумам . Еще раз считаю важным повторить, что критериями возможности применения диагностических препаратов, прежде всего, является чувствительность, специфичность и выявляемость анти-ВГС.

3. Кроме того, в литературе имеются сведения о значении для ранней диагностики гепатита С выявления антител, относящихся к IgM. При остром течении заболевания антитела класса М появляются на 2-3 недели раньше, чем антитела класса G. Ряд производителей диагностических систем предлагают тест-системы, ориентированные на выявление именно антител класса М (к примеру, РекомбиБест анти-ВГС-IgM-стрип ). Для выявления антител какого класса предназначены подтверждающие тест-системы?

Подтверждающие, как и скриннинговые тесты выявляют антитела класса G. Проведенные исследования продемонстрировали, что тест, предназначенный для выявления анти-ВГС класса IgM, может быть использован у некоторых больных для контроля за эффективностью лечения. Применение этого теста для диагностики острого гепатита С пока не нашло своего места. Это, прежде всего, связанно с тем, что применение ПЦР анализа для выявления РНК ВГС позволяет выявить инфицированных больных в более ранние сроки. Кроме того, не у всех лиц, инфицированных ранее ВГС, удается обнаружить анти-ВГС класса IgM.

Вопрос о возможности применения теста для выявления антител к вирусу гепатита С класса М, по прежнему, остается вопросом научного исследования. В службе переливания крови, этот тест для отбраковки доноров не применяется.

С уважением и наилучшими пожеланиями,

Руководитель лаборатории индикации НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Руководитель отдела вирусных гепатитов НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН,
Доктор мед.наук, проф.
М.И.Михайлов

Читайте также: