Для выявления микобактерий туберкулеза мазки мокроты красят

Для микроскопического исследования мокроты прежде всего готовят неокрашенные (нативные) препараты мокроты. Полноценность исследования зависит от правильного приготов¬ления и количества просмотренных препаратов. Материал для исследования выбирают из разных мест и переносят металлической иглой на предметное стекло, затем покрывают покровным стеклом так, чтобы мокрота не выступала за его края.
Препараты должны быть тонкими, элементы в них должны располагаться однослойно. Микроскопию проводят сначала при малом увеличении микроскопа (объектив 8Х, окуляр 10Х), просмотр с малым увеличением дает представление о качестве выбранного материала, позволяет обнаружить скопление клеток, кристаллических образований, найти эластические волокна, спирали Куршмана, элементы новообразования. Дальнейшее исследование производится при большом увеличении микроскопа (объектив 40Х, окуляр 10Х).
При этом в мокроте можно обнаружить в большем или меньшем количестве лейкоциты и среди них по более темной окраске и наличию в цитоплазме обильной, четкой, преломляющей свет зернистости различить эозинофилы, наличие которых характерно для бронхиальной астмы и других аллергических состояний. Эритроциты в мокроте имеют вид желтоватых дисков. Единичные эритроциты встречаются в каждом виде мокроты, большое же их количество характерно для кровянистой мокроты и встречается при инфаркте легкого, легочных кровотечениях, застое в малом круге кровообращения.

Бактериоскопия.

Этот этап исследования мокроты включает в себя микроскопию препаратов, окрашенных по Цилю—Нильсену, для выявления микобактерий туберкулеза и препаратов, окрашенных по Граму, для изучения микрофлоры мокроты. Иногда для выявления микобактерий туберкулеза прибегают к обогащению методом флотации. Препараты мокроты для бактериоскопического исследования, приготовленные на предметном стекле, высушивают, фиксируют над пламенем горелки и затем окрашивают.

Окраска по Цилю—Нильсену.

Реактивы:
Карболовый фуксин: 1 г основного фуксина растворяют в 10мл этилового спирта, раствор выливают в 100мл 5% раствора карболовой кислоты.
3% солянокислого спирта: 3 мл НСl и 97 мл этилового спирта
Водный 0,5% раствор метиленового синего

На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор карболового фуксина, затем препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров, охлаждают и снова нагревают (3 раза). После остывания препарата сбрасывают фильтровальную бумагу и опускают его в солянокислый спирт для обесцвечивания. Обесцвечивают до полного удаления краски, промывают водой и докрашивают метиленовым синим 20—30с. Снова промывают водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой.
Туберкулезные микобактерий окрашиваются в красный цвет, все остальные элементы мокроты и бактерии — в синий. Туберкулезные микобактерий имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке.
При окраске по Цилю—Нильсену в красный-цвет красятся также кислотоупорные сапрофиты. Дифференциальная диагностика туберкулезных микобактерий и кислотоупорных сапрофитов ведется бактериологическими методами исследования

При исследовании следует избегать:
приготовления толстых мазков мокроты;
фиксации плохо высушенных мазков;
недостаточной фиксации;
обугливания препарата при длительной фиксации.

Если микобактерий выделяется мало, то в обычных мазках их не находят и прибегают к методу накопления.

Метод флотации (всплывание) по Поттенджеру.

Свежевыделенную мокроту (не более 10----15 мл) помещают в узкогорлую бутылку, приливают двойное количество 0,5% раствора едкой щелочи,-смесь энергично встряхивают 10—15 мин. Затем добавляют 1 мл ксилола (можно бензина, толуола) и около 30 мл дистиллированной воды для разжижения мокроты и снова встряхивают 10— 15 мин. Доливают дистиллированную воду в таком количестве, чтобы уровень жидкости поднялся до горлышка бутылки. Оставляют на 1 — 2 ч для отстаивания. Образовавшийся верхний беловатый слой снимают по каплям пипеткой и наносят на предметные стекла, предварительно подогретые до 60 °С (стекла для подогревания можно положить на металлический подносик и покрыть им водяную баню). Каждую последующую каплю наносят на предыдущую подсушенную. Препарат фиксируют и красят по Цилю—Нильсену.
Наиболее достоверные результаты в обнаружении микобактерий туберкулеза дают бактериологические методы исследования. Другие бактерии, встречающиеся в мокроте, например стрептококки, стафилококки, диплобациллы, палочки Фридлендера и пр., могут быть распознаны только методом посева. Бактериоскопическое исследование препарата в этих случаях имеет только ориентировочное значение. Препараты красят метиленовым синим, фуксином или по Граму.

Окраска по Граму.

Реактивы:
Карболовый раствор генцианового фиолетового: 1 г генцианового фиолетового растворяют в 10 мл 96 % спирта,, раствор выливают в 100 мл 1 — 2 % карболовой кислоты, взбалтывают
Ра¬створ Люголя: 1 г йода, 2 г йодида калия и 300 мл дистиллированной воды; йод и йодид калия расстворяют сначала в 5—8 мл воды, а затем: приливают остальную воду
96 % спирт или сырец
10 % раствор карболового фуксина: 10 мл карболового фуксина и 90 мл дистиллированной воды

На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианового фиолетового. Красят 11/2—2 мин. Бумажку сбрасывают и заливают препарат раствором Люголя на 2 мин, а потом прополаскивают препарат в спирту до сероватого цвета. Промывают водой и окрашивают 10% раствором карболового фуксина 10—15 с. После этого препарат опять промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионным объективом.

Консультант по гематологии,

цитохимии и микробиологии

Важное место в общем комплексе клинико-лабораторных исследований, применяемых для профилактики, диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений у больных в лечебно-профилактических учреждениях занимают микробиологические исследования. Современная клиническая медицина предъявляет к микробиологическим (бактериологическим) исследованиям возрастающие требования по увеличению объема, повышению качества исследований, разработке и внедрению новых более совершенных методов. Это связано как с новыми научными достижениями в области эпидемиологии и бактериологии, так и с увеличением гнойно-воспалительных заболеваний, ростом госпитальных инфекций.

Материалом для изучения этиологии заболеваний дыхательных путей служат: отделяемое зева и носа; мокрота; содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому (у больных, находящихся на аппаратном дыхании); экссудаты; резецированные ткани и др. Материал собирают с соблюдением правил асептики в предварительно простерилизованные баночки или пробирки и доставляют в лабораторию. Хранение материала способствует размножению сапрофитирующей микрофлоры, развитию процессов гниения и брожения, что искажает результаты анализа. Интервал между взятием материала и его посевом не должен превышать 1-2 часа. Самым простым методом выявления микобактерий туберкулеза в выделениях больных является микроскопия мазка, приготовленного из мокроты. При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии.

Чувствительность метода люминесцентной микроскопии значительно выше - от 10 000 до 100 000 микобактерий в 1 мл материала, кроме того, этот метод дает возможность за значительно более короткое время просмотреть необходимое количество препаратов. Эффективность бактериоскопии повышается также при передаче изображения на компьютер при помощи присоединенной к микроскопу видеокамеры.

Чтобы диагностировать туберкулез, необходимо сделать все возможное для выявления возбудителя заболевания. Микробиологически диагноз может быть подтвержден на основе результатов культурального исследования на комплекс M. tuberculosis (или, при возможности, путем идентификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот) в пробах, взятых в месте локализации патологического процесса. Однако на практике в настоящее время многие лаборатории не располагают материально-технической базой для проведения культуральных исследований. К счастью, микроскопия окрашенных препаратов мокроты доступна практически везде, поэтому диагностика туберкулеза может проводиться на основе выявления кислотоустойчивых микобактерий. На территориях с высокой распространенностью туберкулеза выявление кислотоустойчивых микобактерий в окрашенных препаратах мокроты демонстрирует высокую специфичность, поэтому положительный результат микроскопии мокроты можно рассматривать как подтверждение диагноза. Кроме высокой специфичности к комплексу M. tuberculosis, выявление кислотоустойчивых микобактерий при микроскопии играет важную роль по трем причинам: это – наиболее быстрый метод диагностики туберкулеза; позволяет выявить больных с тяжелым развитием патологии, чреватым высоким риском летального исхода; дает возможность выявить больных, являющихся распространителями инфекции.

Оценка качества работы лабораторий микроскопии должна проводиться соответствующим государственными органом (как правило, представителями национальной программы борьбы с туберкулезом).

Неправильный диагноз, поставленный перед началом лечения, приводит к риску ненужного, неправильного или неудачного лечения. Более того, подобный подход чреват несвоевременной постановкой правильного диагноза и назначением соответствующего лечения. При надлежащем подходе и контроле в большинстве случаев у детей в возрасте пяти лет и старше могут быть получены образцы мокроты. У подростков (хотя они часто относятся к детской возрастной группе, по крайней мере, до 15 лет) получить пробы мокроты не составляет большого труда. Поэтому фактор возраста не может рассматриваться как препятствие для сбора проб мокроты у детей и подростков.

Исходя из имеющихся данных, можно прийти к заключению, что для диагностики туберкулеза необходимо взять не менее двух проб мокроты. В случаях, когда имеются соответствующие возможности, можно направлять для лабораторного исследования еще и третью пробу, но исследование более трех проб мокроты вряд ли целесообразно, поскольку не может в значительной мере повысить эффективность диагностики. Кроме того, исследование третьей пробы может оказаться полезным только для подтверждения диагноза, если одна или две предыдущие пробы дали положительный результат. Крайне желательно, чтобы результаты микроскопии мокроты направлялись лечащему врачу в течение одного рабочего дня с момента отправки проб. Не меньшее значение имеет также и время сбора проб. Результаты исследований показывают, что эффективность лабораторных анализов максимальна, если пробы мокроты получены утром, после пробуждения от ночного сна. Возможно, совершенно необязательно собирать только утренние пробы, но, про крайней мере, одна из них должна быть получена утром.

Как правило, внелегочные очаги туберкулезного процесса содержат гораздо меньшее количество M. tuberculosis, поэтому микроскопическое выявление кислотоустойчивых микобактерий в пробах из внелегочных очагов весьма затруднено, и в таких случаях результаты культуральных исследований приобретают большое значение. Учитывая низкую результативность микроскопии, при внелегочном туберкулезе культуральные и морфологические исследования приобретают особое значение, например, в диагностическом исследовании проб ткани лимфатических узлов, полученных при помощи игловой биопсии.

Лечение пациентов, у которых наблюдаются тяжелое или быстро развивающееся заболевания, ассоциированные с туберкулезом, необходимо начинать немедленно, даже до лабораторного подтверждения диагноза. Лечение следует начинать до получения результатов лабораторного исследования и лишь позднее внести необходимые поправки и изменения в схему лечения с учетом результатов микроскопии.

Хотя микроскопия мокроты является наиболее доступным бактериологическим тестом, там, где ресурсы позволяют и имеются условия для качественной лабораторной диагностики, в диагностический алгоритм необходимо включать культуральные исследования мокроты, в случаях отрицательных результатов микроскопии. Правильное проведение культуральных исследований связано с определенными трудностями и дополнительными затратами, но этот метод отличается более высокой чувствительностью и повышает вероятность раннего выявления больных туберкулезом.

Микроскопия мазков мокроты по Циль-Нильсену является важнейшим элементом диагностики туберкулеза. Исследование 3 мазков мокроты позволяет выявить более 60% случаев туберкулеза легких и 95% наиболее заразных случаев (исследование одного мазка мокроты выявляет 75% наиболее заразных случаев, исследование второго мазка мокроты добавляет еще 20%, а исследование третьего - еще 5%).

Микроскопия мазков мокроты по Циль-Нильсену позволяет быстро получить результаты, выявить основные источники инфекции, является менее дорогостоящей, чем посев мокроты и широко доступна для применения. Но она должна быть надежной и хорошо контролироваться. Вероятность обнаружения МБТ при бактериоскопии мазков мокроты прямо пропорциональна концентрации возбудителя в исследуемом материале. Например, когда в 1 мл мокроты содержится от 1000 до 10000 МБТ, то вероятность получения положительного результата составляет около 40-50%. При концентрации МБТ менее 1000 в 1 мл мокроты вероятность их обнаружения резко снижается – отрицательные результаты получаются примерно в 96% случаев.

Основным и наиболее часто изучаемым биоматериалом в пульмонологической практике является мокрота. Требования к забору и качеству мокроты следующие:
1) первую пробу мокроты желательно получить до начала курса антибиотикотерапии;
2) мокроту оптимально собирать утром, до приема пищи, после тщательного туалета полости рта (полоскание кипяченой водой);
3) больным нужно доступно объяснить, что требуется получить именно содержимое нижних отделов дыхательных путей, а не ротоглотки, и, по возможности, проконтролировать их действия;
4) забор материала проводить в стерильные интактные контейнеры;
5) продолжительность хранения мокроты в контейнерах не должна превышать 2 ч (в летнее время желательно не более 1 ч);
6) в условиях лаборатории качество мокроты оценивается после окрашивания мазка по Граму (при наличии в мазке менее 25 лейкоцитов и более 10 эпителиальных клеток, при просмотре не менее 8-10 полей зрения при малом увеличении, мокрота признается некачественной, дальнейшее ее исследование нецелесообразно, так как, скорее всего, материал получен из ротовой полости);
7) высокая диагностическая ценность исследования признается при выделении возбудителя в концентрации і106 КОЕ/мл.

Вообще, в диагностике заболеваний туберкулезом можно выделить несколько этапов:

· Преаналитический этап (предварительный диагноз, выбор материала и метода исследования, забор биомтериала и его транспортировка)

· Аналитический этап (непосредственно проведение анализа)

· Постаналитический этап (оценка результатов)

Часть этих этапов проводится вне лаборатории, поэтому очень важна согласованная и качественная работа всех специалистов, привлеченных в этот процесс. Важен правильный выбор исследуемого материала. Важным этапом диагностики являются процедуры взятия и доставки материала в лабораторию.При взятии всех видов исследуемого материала следует ориентироваться на стандартные системы для этой цели: тампоны, цитощетки, тубсеры, контейнеры и т.п. Эффективность аналитического этапа во многом определяется уровнем технического оснащения лабораторий. Постаналитический этап исследования включает две составляющие: проверку достоверности полученного результата и оценку этиологической значимости выделенных штаммов. В лаборатории должен осуществляться строгий внутренний контроль качества исследований, важной составляющей которого является проверка полученных результатов на достоверность. Оценка этиологической значимости выделенных микроорганизмов принципиальна для выбора адекватной терапии. Процедура приготовления мазков начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые, отмытые и обезжиренные в спирте или смеси для обезжиривания предметных стекол (производство АБРИС+) стекла без царапин и сколов. При повторном использовании стекла могут быть недостаточно хорошо отмыты от предыдущего материала, что может привести к получению ложноположительных результатов. Не рекомендуется использовать саморезанные стекла, которые приводят к значительным аберрациям исследуемого изображения. Стекла должны соответствовать ГОСТу. Стекла, на которых при микроскопическом исследовании были обнаружены кислотоустойчивые микобактерии, сохраняются в лаборатории в течение 1 года, а затем подлежат обязательному уничтожению и не должны использоваться повторно. Новые предметные стекла кипятят 15 минут в 1% растворе питьевой соды (10 г двууглекислого натрия на 1 л воды), промывают в 1% растворе соляной кислоты (к 1 л воды добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты), а затем промывают в проточной воде и протирают насухо.

БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОКРОТЫ.

Это этап исследования мокроты включает микроскопию препаратов, окрашенных по Циль-Нильсену для выявления микобактерий туберкулёза (кислотоустойчивых бактерий, КУБ), препаратов, окрашенных по Граму, для изучения микрофлоры мокроты (стрептококки, стафилококки, пневмококки). В последнем случае бактериоскопическое исследование имеет ориентировочное значение. Правильность выявлений этих бактерий всегда подтверждают посевом.

Техника приготовления окрашенных препаратов.

На край предметного стекла кладутся кусочки из мокроты, растираются другим предметным стеклом до гомогенной массы. Препарат должен занимать не более половины стекла, для удобства при приготовлении, фиксации и окраски. Затем препараты высушивают, фиксируют путём троекратного проведения над пламенем горелки и окрашивают.

Для бактериоскопического исследования готовят обычно два препарата: один для обнаружения микобактерий туберкулёза, другой – для обнаружения прочих микроорганизмов. Для первого препарат отбирают частицы, которые были предназначены для микроскопии, для второго – гнойные частицы.

Первый препарат окрашивают по методу Циль-Нильсену, а второй по Граму.

ОКРАСКА ПО ЦИЛЬ-НИЛЬСЕНУ.

1. Карболовый фуксин Циля.

2. 3% солянокислый спирт.

3. Водный 0,5% р-р метиленовой сини.

1. На препарат кладут квадратик фильтровальной бумаги.

2. Наливают р-р карболового фуксина Циля.

3. Препарат нагревают над пламенем горелки до 3-х кратного отхождения пара.

5. Сбрасывают бумажку и опускают препарат в солянокислый спирт для обесцвечивания.

6. Промывают препарат водой.

7. Докрашивают препарат метиленовым синим в течение 20-30 сек.

8. Промывают водой и высушивают на воздухе.

9. Микроскопируют с иммерсионной системой.

Микобактерии туберкулёза окрашиваются в красный цвет , а все остальные элементы - в синий. Микобактерии имеют вид точек, слегка изогнутых, расположенных группами или поодиночке.

Если микобактерий с мокротой выделяется мало, то в обычных мазках их не находят и прибегают к методу накопления (обогащения).

МЕТОД ОБОГАЩЕНИЯ ПО ПОТТЕНДЖЕРУ.

1. 10-15 мл свежевыделенной мокроты помещают в узкогорлую бутылку.

2. Доливают двойным объёмом 0,5% р-ра NaOH или КОН.

3. Смесь энергично встряхивают 10-15 мин.

4. Добавляют 1 мл летучего вещества (ксилола, толуола, бензола) и 100 мл воды.

5. Снова встряхивают 10-15 мин.

6. Доливают дистиллированной воды до горлышка.

7. Оставляют на один час для отстаивания.

8. Верхний беловатый слой (флотационное кольцо) снимают пипеткой по каплям и наносят на предметные стекла, подогретые на воздушной бане до 60 0 С. Каждую новую каплю наносят на высохшую предыдущую.

10. Красят по Циль-Нильсену.

МЕТОД СЕДИМЕНТАЦИИ МОКРОТЫ.

1. 1 часть мокроты смешивается с 2 частями 10% трёхзамещённого фосфорнокислого натрия ( Na ₁₂ H ₂ О).

2. Смесь ставят в термостат на 1 сутки (можно не ставить).

3. Слить надосадочную жидкость.

4. 10 мл надосадочной жидкости центрифугируют при 2000 об/мин в течение 12 мин.

5. Быстро сливают надосадочную жидкость.

6. Из осадка делают препараты, высушивают при Т 90 0 С в течение 30 мин., затем окрашивают по Цилю-Нильсену.

Метод седиментации предпочтительнее, так как при флотации по Поттенджеру образуется аэрозоль, что увеличивает риск заражения мед.персонала.

МЕТОД ОКРАСКИ ПО ГРАМУ.

1. Фуксин Пфейффера.

2. Реактив Люголя.

3. 1% Карболовый раствор генцианового фиолетового.

4. 96 0 этиловый спирт.

1. На фиксированный препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги.

2. Наносят несколько капель 1% карболового раствора.

3. Через 1-2 мин бумажку сбрасывают и на препарат наливают 1-2 капли реактива Люголя.

4. Через 1-2 мин препарат обесцвечивают 96 0 этиловым спиртом.

5. Препарат промываю водой и докрашивают фуксином Пфейффера 10-15 сек.

6. Промывают водой и высушивают.

7. Микроскопируют с иммерсионной системой.

Грамположительные бактерии окрашивают в фиолетовый цвет (синий), а грамотрицательные – в красный цвет.

В препаратах, окрашенных по Граму, обнаруживают пневмококки, стрептококки, стафилококки, актиномицеты и другие микроорганизмы.

В будущем не трудно будет решить, что это – туберкулез или нет… Демонстрация туберкулезной бациллы… решит вопрос

Роберт Кох

Лабораторная диагностика обеспечивает выполнение главной задачи диагностики и лечения туберкулеза – выявление у больного МБТ. В лабораторную диагностику на современном этапе входят следующие методики:

1. сбор и обработка мокроты;
2. микроскопическая идентификация МБТ в выделяемых субстанциях или тканях;
3. культивирование;
4. определение резистентности к препаратам;
5. серологические исследования;
6. выполнение новых молекулярно-биологических методов, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Сбор мокроты, содержащую МБТ, проводится в специально подготовленном помещении больницы или в амбулаторных условиях. Собранные образцы должны быть немедленно отосланы в соответствующую лабораторию. Для этого должны использоваться специальные контейнеры. Контейнеры должны быть прочными, устойчивыми к разрушению, иметь широкую горловину с герметически завинчивающейся пробкой, чтобы предотвратить случайное вытекание из нее содержимого. Имеются два удобных для этого типа контейнеров. Один – распространяемый международной организацией UNICEF (ДЕТСКИЙ ФОНД ООН), является пластмассовой пробиркой с черным основанием, прозрачной крышкой, утилизация которого может быть обеспечена сжиганием. На контейнере (не на крышке) отмечаются данные обследуемого. Другой тип контейнера – сделан из прочного стекла, с завинчивающейся крышкой. Такой контейнер может многократно использоваться после дезинфекции, кипячением (10 мин.) и c полной очисткой.

При сборе образцов риск инфекции очень большой, особенно когда больной выкашливает мокроту, в связи с этим процедуру необходимо проводить как можно дальше от посторонних лиц и в специальном помещении.

Дополнительные процедуры для сбора МБТ.

Забор образцов из гортани тампоном.
У пациентов, не имеющих мокроту, для получения материала для посева МБТ можно использовать тампоны на палочке. Оператор должен носить маску и закрытый халат: язык пациента вытягивается изо рта, одновременно тампон вводится, за языковое пространство ближе к гортани. Во время кашля пациента можно собрать часть слизи. Тампон помещается в закрытый сосуд и направляется в бактериологическую лабораторию.

Промывные воды бронхов.
Для своевременной диагностики туберкулеза легких и и трахеобронхиальной системы большое значение имеет раннее распознавание поражения бронхов. Для этой цели в практике применяется исследование промывных вод бронхов. Методика получения промывных вод не сложна, но надо помнить о противопоказаниях ее применения. Людям старческого возраста промывание бронхов следует делать, с большой осторожностью. Процедура противопоказана при заболеваниях бронхиальной астмой, а также при явлениях сердечно-легочной недостаточности. Для получения промывных вод бронхов больному анестезируют дыхательные пути. Гортанным шприцем вводят 15—20 мл физиологического раствора, подогретого до 37°. Это усиливает секрецию слизистой бронхов. Откашливая, больной выделяет промывные воды. Их собирают в стерильную посуду и обрабатывают обычным способом для бактериоскопии и посева на средах для выращивания БК. Производится исследование отдельного бронха или целого ветвления. Метод бактериоскопии промывных вод, и особенно их посев, увеличил число находок БК на 11—20%.

Промывные воды желудка.
Промывные воды желудка нередко исследуются у детей, которые не умеют откашлять мокроту, а также у взрослых при скудном количестве мокроты. Метод не труден и дает довольно большой процент обнаружения БК в промывных водах желудка или бронхов у больных не только легочным туберкулезом, но и туберкулезом других органов (кожи, костей и суставов и др.).
Для получения промывных вод больной, утром натощак должен выпить стакан кипяченой воды. Затем желудочным зондом собирают воды желудка в стерильную посуду. После этого воды центрифугируют, мазок де¬лают из гнойных элементов полученного осадка, обрабатывают и красят обычным способом, как мокроту.

Исследование спинномозговой жидкости.
При подозрении на туберкулезный менингит необходимо в первые дни сделать анализ спинномозговой жидкости. При взятии спинномозговой жидкости обращается внимание на степень давления, под которым она вытекает из спиномозгового канала. Жидкость, вытекающая непрерывной струей под большим давлением, свидетельствует о повышенном внутричерепном давлении. Жидкость, выделяющаяся крупными частыми каплями, говорит о нормальном давлении, а редкими малыми каплями- о пониженном давлении или о препятствии для истечения ее. Материал для исследования берут в две стерильные пробирки. Одну оставляют на холоде и через 12—24 часа, в ней образуется нежная паутинообразная пленка. Из другой пробирки берут ликвор для биохимических исследований и изучения цитограммы.

Бронхоскопия.
Когда другие методы не сумели обеспечить постановку диагноза, применятся сбор материала непосредственно из бронхов, через бронхоскоп. Биопсия выстилающих бронхи тканей может иногда содержать типичные для туберкулеза изменения, с последующим гистологическим исследованием.

Плевральная жидкость.
В плевральной жидкости МБТ могут быть выявлены с помощью флотации, но обычно обнаруживаются только в культуре. Чем большее количество жидкости используется для культурального исследования, тем вероятней положительный результат.
Биопсия плевры.
Биопсия плевры может быть полезна, в тех случаях, когда имеется ее поражение. При этом необходима специальная биопсийная игла, средства для проведения гистологического исследования и обученный персонал.
Биопсия легкого.
Биопсия легкого должна выполняться хирургом, в стационарных условиях. Диагноз может быть сделан на основе гистологического исследования или обнаружения МБТ в секционном материале.

Метод, который до сих пор используются это карбол-фуксиновый (метод Циля-Нильсена). Основной принцип этого метода состоит в способности наружной оболочки МБТ адсорбировать карбол-фукцин. Поглощая красный карбол-фуксин, наружная мембрана МТБ настолько прочно абсорбирует краску, что ее нельзя удалить обработкой серной кислотой или соляно кислым спиртом. Затем образец обрабатывается метиленовым синим. При эмерсионной микроскопии МБТ появляются в виде красных палочек на синем фоне.

Начиная с 1989 в современных лабораториях флюоресцентная микроскопия в значительной степени вытеснила старые методы, основанные на кислотоустойчивости микобактерий. Этот метод основан на тех же свойствах МБТ, связанные со способностью наружной мембраны МБТ, богатой липидами, удерживать соответствующий краситель в этом случае – аурамин-родамин. МБТ поглощая это вещество, одновременно устойчива обесцвечиванию соляно-кислым спиртом. При этом, МБТ, окрашенные аурамин-родамином, флюоресцируют под воздействием ультрафиолета или другими световыми спектрами света, выделенными соответствующими фльтрами. При этом МБТ проявляются как ярко-желтые палочки на черном фоне.

При поступлении в современную лабораторию диагностического материала, с возможным содержанием МБТ, проводятся следующие диагностические манипуляции:

1. Обработка материала миколитическими разжижающими веществами, с целью удаления белковых масс.
2. Деконтаминация образца, с целью удаления сопутствующей бактериальной флоры.
3. Встряхивание смеси и ее отстаивание.
4. Холодное центрфугирование.
5. Содержимое центрифужной пробирки используется для микроскопии, посева на:
   1. плотную яичную среду (Левенштейна-Йенсена или Финна III);
   2. агаровые среды (7Н10 и 7Н11);
   3. на атоматизированную систему бульонного культивирования (MB/BacT или BACTEC MGIT 960)

Расшифровка генома МБТ открыла неограниченные перспективы, в разработке генетико-молекулярных тестов, в том числе в изучении и выявлении МБТ и ее диагностике в организме человека. Классические методы, применяемые для обнаружения наличия в организме микобактерий туберкулеза, такие как бактериоскопия, культуральный, иммуноферментный, цитологический весьма эффективны, но отличаются или недостаточной чувствительностью, или длительностью выявления МВТ. Развитие и совершенствование молекулярно-диагностических методов открыло новые перспективы для быстрого выявления микобактерий в клинических образцах.

Наибольшее распространение получили метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Метод полимеразной цепной реакции основан на амплификации особых фрагментов бацилярной ДНК, которая обнаруживается в диагностических образцах. Тест предназначен для выявления МБТ в мокроте или для идентификации разновидности бактерий, которые произрастают в культуральной среде. Реакция ПЦР позволяет проводить идентификацию МВТ в диагностическом материале за 5-6 часов (включая обработку материала) и обладает высокой специфичностью и чувствительностью (в диапазоне от 1-10 клеток в образце).