Трансформация клеток кишечной палочки
Один из наиболее распространенных способов получения клеток E.coli для последующей трансформации с очищенной ДНК – инкубация бактерий при низкой температуре в жидкой среде, содержащей катионы Ca. Данная методика была разработана японскими специалистами в области генной инженерии в 1996 году. Метод включает несколько последовательных этапов.
Выращивание колоний E.coli в агаризированной среде SOB
Мягкие и твердые стерильные одноразовые микробиологические петли из полистирола производства итальянской компании Promed выпускаются объемом 1 и 10 мкл
Для этого в стерильных условиях в пробирку с культурой E.coli вводится простерилизованная многоразовая или стерильная одноразовая бактериологическая петля, с помощью которой осуществляется забор материала, перенос его на селективную питательную среду и распределение по ее поверхности зигзагообразным движением.
Выращивать колонии в чашках Петри можно при 37°C или при 18°C. В первом случае материал для дальнейшей работы будет готов уже на следующее утро, однако уровень компетентности выращенных таким образом бактериальных клеток получится умеренным.
Для получения клеток с более высокой компетентностью материал рекомендуется инкубировать при t 18°C, однако нужно учитывать, что в таком температурном режиме нужной плотности колонии достигнут лишь через несколько суток.
Глубинное культивирование и охлаждение
После инкубирования 10-12 колоний диаметром от 2 до 3 мм отбираются в колбу емкостью 0,5-1л с 40 мл жидкой среды SOB. Колба помещается на качалку, установленную в термостат, где при температуре 37°C и интенсивном встряхивании (200-300 об/мин) осуществляется глубинное культивирование культуры в течение 2-2,5 часов до достижения оптической плотности 0,6.
После этого сосуд с материалом ставят в мелко-колотый лед, где и производятся все дальнейшие манипуляции.
Центрифугирование и ресуспензирование
Охлаждение после культивирования осуществляется в течение 30 минут, после чего из колбы отбирают 30 мл культуры и центрифугируют материал в пробирке емкостью 50 мл при температуре 4°C в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин.
Затем супернатант сливают и центрифугируют бактериальные клетки в течение 20 секунд при аналогичных указанным выше скорости и температуре. После этого жидкую фракцию удаляют пипеткой, а осадок суспензируют в 10 мл буфера ТВ и оставляют на 10-15 минут в мелко-колотом льду (t - 0°C).
Диметилсульфоксид используется при выращивании компетентных клеток E.coli в качестве криопротектора
Вслед за этим материал вновь подвергается двукратному центрифугированию вышеописанными способами. Выпавшие в осадок клетки ресуспензируются в 2 мл буфера.
Затем к культуре добавляется диметилсульфоксид (криопротектор) до достижения концентрации 3,5%, и сосуд выдерживается при 0°C в течение 10-15 минут.
Вслед за этим культура вновь центрифугируется при 4°C и скорости 3000 об/мин в течение 10 минут, после чего супернатант сливается.
Разлив и хранение
Выбор оборудования и материалов
Встряхиватель KS 130 kontrol nol марки IKA может работать при температурах от 5 до 50 градусов Цельсия
Выбрать устройство для встряхивания не составляет проблемы – рынок современных лабораторных шейкеров и качалок представлен широким перечнем высокотехнологичных приборов, среди которых можно без труда подобрать аппарат с оптимальными характеристиками.
Для центрифугирования идеальным решением по сочетанию цены, функциональности и эксплуатационных характеристик станет выбор в пользу оборудования британской марки Centurion Scientific. Главное преимущество рефрижераторных моделей этой марки – использование уникальной запатентованной технологии принудительного охлаждения, обеспечивающей исключительную точность и стабильность температуры по всему объему центрифужной камеры.
Под этой маркой выпускаются лабораторные центрифуги со сменными роторами, работающие в различных диапазонах скоростей и предназначенные для решения разных задач.
Универсальная центрифуга PrO-Hospital HLR идеально справится с подготовкой E.coli для последующей трансформации и позволит успешно решать другие задачи
Если работу с материалом планируется вести по стандартным методикам, вполне достаточным может оказаться функционал охлаждаемых универсальных центрифуг для клинических исследований с 10 ячейками встроенной памяти. Эти приборы относятся к серии Pro-Hospital. Такие же модели, как, например, цитоцентрифуга Pro-CYTLCD или ее более простая модификация Pro-CYTLED, а также центрифуги для разделения крови серии Pro-PRP разработаны с целью подготовки образцов для гистологического анализа методом жидкостной цитологии и получения богатой тромбоцитами плазмы соответственно. Они совместимы с определенными типами роторов, оснащаются предустановленными программами центрифугирования в строго определенных режимах и работают при комнатных температурах. Поэтому при выборе оборудования для работы с клеточными культурами следует обращать внимание именно на аппараты линейки Pro-Hospital с подходящим функционалом – HLR или LLR.
Для нужд научно-исследовательских лабораторий великолепно приспособлены аппараты серии Pro-Research с сенсорной панелью управления, максимально гибкой настройкой и большим объемом встроенной памяти, позволяющей одномоментно хранить и быстро запускать до 108 методик с различными параметрами.
Крайне важно использовать высококачественные среды и реактивы – это на порядок повышает продуктивность и сводит к минимуму риск порчи биоматериала. Один из лидеров в этой нише рынка – французская компания Biochem, в перечень продукции которой входят стандартные растворы, готовые буферы и среды, а также реактивы для их приготовления.
В настоящее время E. coli, несомненно,
представляет собой самую изученную,
клетку из всех существующих.
Кишечная палочка Escherichia coli - классический объект молекулярной генетики, на котором исследованы наиболее принципиальные проблемы организации генетического материала. Штамм E. coli K12 был успешно использован Дж.Ледербергом и Э.Тейтумом в 1946 г. для доказательства существования рекомбинаций у бактерий. Позже Дж.Ледерберг построил для нее первую генетическую карту, а Ф.Жакоб и Э.Вольман - первую кольцевую карту. В 1963 г. Дж.Кернс сфотографировал кольцевой геном E. coli в процессе его репликации.
Зачем это нужно? Клеточный геном представляет собой сбалансированную систему генов - архив генетической информации, достаточной для контроля всего клеточного метаболизма, развития, морфогенеза, самовоспроизведения [1, 2]. В частности, геном клетки содержит гены всех основных генетических процессов - репликации, транскрипции, трансляции, репарации, рекомбинации, сегрегации и т.д. Полное секвенирование генома позволяет сопоставить и оценить генетическую сложность тех или иных молекулярных систем и геномов, выявить ранее неизвестные гены, выполнить сравнительный анализ функционального и структурного сходства различных генов и геномов, выявить общие принципы организации сложных клеточных молекулярно-генетических систем управления.
Работа по проекту полного секвенирования генома E. coli K12 была начата в 1991 г. под руководством д-ра Фреда Блаттнера (лаборатория генетики, Висконсинский университет, г. Медисон, США). В январе 1997 г. основные результаты были переданы в компьютерную базу данных GenBank [3], а в сентябре 1997 г. в американском журнале "Science" появилась итоговая статья коллектива участников секвенирования [4]. Полная последовательность ДНК генома E. coli K12 стала достоянием науки. Ниже мы приведем в сводной форме основные результаты этих работ с необходимыми комментариями, имея в виду, что такой уникальный материал позволяет ответить на многие принципиальные вопросы молекулярно-генетической организации и эволюции.
| Таблица 1 Общие характеристики некоторых секвенированных прокариотических и эукариотических клеточных геномов | |||
Заметим также, что параллельно с E. coli были секвенированы многие другие клеточные геномы бактерий и эукариот. К концу 1997 г. было опубликовано 8 полных клеточных геномов, а к лету 1998 г. - уже 15 (табл. 1). Среди них геномы микоплазм, энтеробактерий, архебактерий, дрожжей, нематоды. На очереди геномы других бактерий и грибов, а также дрозофилы, арабидопсиса, пшеницы, риса, кукурузы, мыши и, наконец, человека. В целом это направление теперь называют геномикой. Это, вероятно, одна из главных точек роста современной молекулярной генетики.
Общие характеристики последовательности ДНК генома E. coli K12 таковы: 87,8% генома занимают реальные и вероятные белок-кодирующие гены, или цистроны. Примерно 1/3 из них была известна ранее, а остальные выбраны среди огромного числа новых открытых рамок трансляции (возможных цистронов, или ORF) путем сложного сопоставления многих свойств, имеющих характерные различия между кодирующими и некодирующими районами. Функции 38% этих цистронов неизвестны.
- 0,8% - гены стабильных фракций РНК (т-РНК, р-РНК и др.).
- 0,7% - некодирующие повторы.
- 11,0% генома - функциональные сайты и другие участки, выполняющие регуляторные и другие функции.
Таким образом, геном E. coli K12 очень плотно нагружен генами (
88,5%), а межгенные участки занимают относительно малую долю (
11%). Среди 4288 выявленных или предсказанных цистронов 1853 описаны ранее, а 2435 - новые. Самый большой цистрон содержит 7149 нп. (2383 кодона), функция его неизвестна. Средний размер цистрона 951 нп. (317 кодонов). Средний интервал между цистронами - 118 нп. Однако межгенны интервалы в большинстве своем содержат различные функциональные сайты, то есть выполняют регуляторные функции. Кроме того, цистроны не содержат интронов - внутренних некодирующих участков.
Известно, что цистроны выделяются в ДНК и м-РНК начальными и конечными знаками пунктуации. В общей форме они были известны ранее и внесены в генетический код. Однако в геноме E. coli они встречаются с различными частотами:
Начальные знаки пунктуации
Конечные знаки пунктуации
ATG - 3542
TAA - 2705
GTG - 612
TGA - 1257
TTG - 130
TAG - 326
ATT - 1
CTG - 1
Интересно, что у 405 пар смежных цистронов вообще нет межгенных интервалов: знак начала трансляции одного частично перекрывается с конечным знаком другого:
По данным на январь 1998 г. [5] сложность молекулярно-генетической системы управления и метаболической сети E. coli можно охарактеризовать следующим образом:
1. Длина ДНК генома (Мб)
2. Полное число генов
3. Число цистронов
4. Число кодируемых ими ферментов
5. Число метаболических реакций
6. Число метаболических путей
7. Число химических веществ, участвующих в метаболизме
8. Число фракций т-РНК (генов т-РНК)
79 (86)
9. Число регуляторных белков
В таких случаях специалисты говорят: "жизнь при 4909 генах". Метаболизм сложен, но не запредельно. В дальнейшем приведенные цифры могут возрасти в ходе исследований за счет новых знаний.
Более подробная классификация цистронов по 22 функциональным классам представлена в таблице 2. Здесь примерно 1/4 клеточных ресурсов связана с метаболизмом малых молекул, 1/8 - с метаболизмом макромолекул и 1/5 - с клеточными структурами и процессами. В метаболизме малых молекул ключевую роль играет синтез, распад и преобразование нуклеотидов (58 цистронов), аминокислот (131); энергетические процессы (243), транспорт (146), центральный промежуточный метаболизм (188) и другие процессы. В частности, системы, выполняющие основные генетические процессы, содержат:
- репликацию, рекомбинацию, модификацию и репарацию ДНК - 115 (2,68%);
- трапскрипцию, синтез, метаболизм и модификацию РНК - 55 (1,28%);
- трансляцию и посттрансляционную модификацию белков - 182 (4,24%) + 21 ген р-РНК + 86 генов т-РНК.
Кроме того, найдено 9 цистронов, контролирующих синтез шаперонов - вспомогательных белков, способствующих формированию правильной пространственной упаковки всех остальных белков. Этот процесс называется самоорганизацией, или фолдингом белков.
Помимо различных вспомогательных функций, эти системы в совокупности образуют сайзер - универсальную систему самовоспроизведения клетки [1, 2]. Сайзер составляет сердцевину молекулярно-генетической системы управления клетки. Несмотря на внушительное число участвующих генов (
460, свыше 10% всех генов), принципиальная блок-схема сайзера достаточно проста [1, 6].
Далее рассмотрим разнообразие функциональных единиц транскрипции. Для генома E. coli и других энтеробактерий характерно присутствие управляемых единиц транскрипции - оперонов. Первые опероны были открыты именно у E. coli: lac-опе-рон, контролирующий сбраживание сахара лактозы, trp-оперон, контролирующий синтез аминокислоты триптофана, и др. [см. 6]. Важной особенностью оперонов является наличие обратной связи между концентрацией контролируемого метаболита и наработкой ферментов его синтеза или распада. Всего в геноме E. coli выявлено и предсказано 2584 оперона. Среди них: 73% содержат 1 цистрон;
- 16% - 2 цистрона;
- 4,6% - 3 цистрона (в том числе lac -оперон);
- 6% - 4 и более цистронов (в том числе trp-, his -опероны).
Все они имеют не менее 1 промотора - начального знака транскрипции.
Опероны управляются регуляторными белками через специфические функциональные сайты управления. Например, белок-репрессор lac -оперона узнает его оператор - функциональный сайт и через него подавляет функцию инициации транскрипции. Иногда опероны подчинены нескольким регуляторным белкам и имеют несколько регуляторных сайтов [1, 6].
Всего по данным секвенирования выявлены 45 цистронов белков с регуляторными функциями и еще цистроны 133 предполагаемых регуляторных белков. Большинство из них, вероятно, участвует в управлении оперонами.
Так, внутри областей с предсказанными сайтами управления (в основном оперонов)
- 89,2% регулируются 1 белком (в том числе trp- оперон);
- 8,4% - 2 белками (в том числе lac -оперон); - 2,4% - 3 и более белками.
В свою очередь эти области содержат
- 81,2% - 1 сайт управления;
- 12,2% - 2 сайта управления (в том числе lac- оперон);
- 6,6% - 3 и более сайтов управления.
Это значит, что большинство оперонов регулируется достаточно просто. Этим они существенно отличаются от генов эукариот, которые подвержены действию многих общих и специфических белковых факторов управления.
Геном E. Coli содержит 2 функциональные единицы репликации. Ф.Блаттнер и др. назвали их реплихорами [4].
Общее двустороннее начало репликации (ori, origin) локализовано на участке примерно 84,5 мин конъюгационного переноса и занимает
250 нп. В этой зоне инициируется двусторонняя репликация. Реплихор 1 ориентирован по часовой стрелке, реплихор 2 - против нее. Оба процесса заканчиваются на противоположном участке генетической карты,
34-35 мин., где каждый из них имеет свой отдельный ориентированный терминальный знак (ter) - T1 и T2. Следует отметить, что традиционно участки репликации, ограниченные знаками ori и ter, называют репликонами [6].
Что такое горизонтальный перенос генов и насколько он распространен
Авторы недавнего (и, по мнению специалистов, довольно плохого) обзора про ГМО-еду вспомнили старую страшилку, заключающуюся в том, что фрагменты ДНК из пищи, которую мы употребляем, могут попадать в клетки человека или населяющих его микроорганизмов и влиять на экспрессию генов хозяина или даже встраиваться в геном. Подобных примеров современная наука не знает, но вообще случаи горизонтального переноса генов — попадания в организм фрагментов ДНК не от родителей, а извне, из окружающей среды, ученым известны, и многие из них описаны довольно хорошо. Мы решили разобраться в этом вопросе.
Несмотря на то, что позвоночные животные едят ДНК-содержащую еду миллионы лет, свидетельств тому, что съеденные гены как-то влияют на собственный геном, ученые пока не нашли. Тем не менее, получить ДНК не от родителей, а откуда-то извне возможно — этот феномен называется горизонтальным переносом генов. С началом эры массового секвенирования геномов и биоинформатики стало понятно, что горизонтальный перенос сыграл значительную роль в эволюции как прокариот (бактерий и архей), так и высших эукариот, например, растений.
Тем не менее, заполучить чужую ДНК не так-то просто, а наличие и количество, к примеру, бактериальной ДНК в геноме человека до сих пор остается дискуссионным вопросом.
Для того чтобы в геноме появился новый элемент, необходимо, чтобы новая ДНК попала в клетку и встроилась в хромосому. Логично, что проще всего выполнить эти условия, если организм одноклеточный и у него нет дополнительной ядерной оболочки, защищающей геном. По всей видимости, прокариоты (бактерии и археи) действительно пользуются горизонтальным переносом очень активно — для них это еще и аналог полового процесса, позволяющий внести разнообразие в генетическую информацию, наряду со случайным мутагенезом.
В лаборатории свойство компетентности используют для того, чтобы искусственно доставлять ДНК в бактериальные клетки, а в природе к развитию компетентности и натуральной трансформации способны как минимум несколько десятков видов бактерий, среди которых множество патогенных. Как в случае с опытами Гриффита, внешним источником ДНК могут быть погибшие клетки, кроме того, некоторые бактерии выделяют ее наружу намеренно, с использованием систем секреции.
Помимо трансформации, бактерии способны обмениваться ДНК путем конъюгации. Этот специализированный процесс передачи ДНК между клетками при непосредственном контакте был открыт на кишечной палочке в середине XX века. Для того чтобы передать ДНК, клетки кишечной палочки должны содержать небольшую кольцевую экстрахромосомную молекулу ДНК — плазмиду, которая содержит гены, необходимые для конъюгации, и которая, собственно, и передается.
Конъюгация осуществляется с образованием половых пилей — белковых трубочек, при помощи которых устанавливается физический контакт. Кроме кишечной палочки, процесс был найден и у множества других бактерий. Помимо генов, необходимых для собственного распространения, конъюгативная плазмида может содержать гены других полезных признаков, поддерживаемых отбором, например, устойчивости к антибиотикам.
Молекулярный механизм передачи F-плазмиды путем конъюгации у бактерий
Встроить в геном можно не любую ДНК — в общем случае полученный фрагмент просто разрушится внутриклеточными ферментами — нуклеазами и рестриктазами, которые защищают клетку от вторжения. Обмен генами происходит чаще между близкородственными штаммами, у которых большой процент похожих последовательностей. В таком случае новый фрагмент ДНК может встроиться в геном по механизму гомологичной рекомбинации, для которой необходимо наличие одинаковых или близких по составу нуклеотидных последовательностей.
Если существование горизонтального переноса было установлено еще до расшифровки последовательностей генома, то масштабы явления стали понятны только с наступлением эры секвенирования. Попытки построить для всех живых организмов универсальное филогенетическое дерево на основании последовательностей геномов привели к ряду филогенетических конфликтов. Нередко какие-то гены обнаруживаются там, где по логике эволюционного наследования, их быть не должно. Отсутствие гена у предков организма часто наводит исследователей на мысль, что он получен путем горизонтального переноса.
Расшифровка множества эукариотических геномов позволила предположить, что горизонтальный перенос сыграл важную роль в эволюции не только бактерий, но и одноклеточных эукариот, в частности, простейших, а также водорослей и высших растений, многих беспозвоночных животных.
У прокариот механизмы доставки новых генов более или менее изучены и понятны, но у эукариот ДНК дополнительно защищена ядерной мембраной и белками-гистонами. Кроме того, если речь идет о многоклеточных организмах с половым размножением, то для того, чтобы закрепиться в поколениях, хромосома с новым элементом должна попасть в половые клетки. Таким образом, на пути горизонтального переноса у более сложных организмов, нежели бактерии, стоит множество барьеров. Поэтому в его наличие стоит верить только при существовании вероятного механизма передачи.
Обмен генетической информацией между ядерным геномом и митохондриальным детектируют и в настоящее время, например, у человека он иногда наблюдается при злокачественном преобразовании клеток. Происходить это событие может, например, во время митоза, когда ядерная оболочка разрушается. Как при этом преодолевается барьер митохондриальной мембраны, не совсем понятно, скорее всего митохондрии просто деградируют, и митохондриальная ДНК выходит в цитоплазму.
Биологам известны и современные примеры эндосимбиоза и эндопаразитизма, сопровождающиеся горизонтальным переносом генов. К примеру, внутриклеточный симбионт членистоногих и некоторых червей-нематод бактерия вольбахия нередко встраивает большие куски своего генома в геном хозяина. Вероятно, это происходит случайно в процессе репарации ДНК, и большой пользы хозяевам вольбахии от этого нет, так как большинство бактериальных генов при этом неактивны или превращаются в псевдогены, то есть необратимо ломаются.
Микрофотография вольбахии внутри клетки насекомого
Genome Sequence of the Intracellular Bacterium Wolbachia. PLoS Biol 2004
Мораторий Берга
Летом 1973 г. Р. Поллак, сотрудник Дж. Уотсона, который к тому времени уже возглавлял лабораторию в Колд-Спринг-Харборе, позвонил Полу Бергу в Стэнфордский университет, что неподалеку от Сан-Франциско в Калифорнии. Незадолго до этого звонка Поллак узнал, что Берг разрабатывает планы введения генов ракового вируса СВ-40 в кишечную палочку с помощью ее плазмиды. В ходе эксперимента планировалось клонировать раковые гены. Это было необходимо для того, чтобы иметь возможность изучать эти гены с помощью методов молекулярной биологии.
Здесь необходимо сделать остановку, чтобы разъяснить значение некоторых слов, иначе будет непонятен дальнейший рассказ. Итак, раковый вирус СВ-40. Он был выделен у обезьян и хорошо трансформировал их клетки в культуре ткани.
Культурой ткани называется способ выращивания клеток в стеклянных чашках и пробирках. Этот метод был создан французом А. Каррелем, который долгое время работал в Америке. В 1912 г. Каррель был удостоен за свое открытие Нобелевской премии по медицине.
Но метод культуры не мог получить широкого распространения до появления антибиотиков, которые предотвращали развитие болезнетворных микроорганизмов. Как удавалось Каррелю в конце XIX и начале, XX в. – когда об антибиотиках никто и не слышал – поддерживать свои культуры, до сих пор остается загадкой. А ведь некоторые культуры он сохранял по тридцать лет!
Почему это так произошло – тема другого рассказа, сейчас же скажем, что наука о раковых вирусах сделала огромный скачок после войны, когда антибиотики позволили широко распространить по лабораториям метод культуры тканей.
ЭБВ оказался очень интересным: в Африке он вызывает – если это действительно так – лимфому Беркита, в Юго-Восточной Азии – опухоль в носоглотке. Поэтому ЭБВ так и считали одним из раковых. Но вот в Филадельфии случайно выяснилось, что у представителей белой расы этот вирус вызывает инфекционный мононуклеоз, похожий по своим симптомам на гепатит, то есть воспаление печени.
Так вот, Гершензон заразил гусениц не молекулой ДНК вируса, а его РНК, выделенной из клеток, пораженных ВЯП. И получил прекрасные вирусные частицы, свидетельствовавшие о том, что информация могла считываться не только с ДНК для синтеза РНК, но и наоборот! Это было непостижимо, ведь все знали, что генетическая информация идет только в одном направлении, как же она может идти в обратном!
Письмо профессора было опубликовано журналом, поскольку никто не мог спорить с нашим приоритетом в данной области. Но хотелось бы сделать и одно небольшое пояснение.
Ажиотаж вокруг результатов Темина и Балтимора, которым всего через пять лет вместе с Р. Дульбекко вручили Нобелевскую премию, возник не только потому, что они открыли, или повторили открытие нового биологического явления, а потону, что они выделили новый фермент, чего в лаборатории Гершензона не было сделано, потому что не было такой совершенной техники анализа. Все преимущество американских исследователей сегодня перед миром как раз и заключается в этом техническом совершенстве, превосходном лабораторном оборудовании, которое создают и разрабатывают многочисленные первоклассные фирмы. Ведь тому же Темину тоже десять лет никто не верил, пока он не представил на всеобщее обозрение наработанный им фермент. Фермент, который сделал возможным звонок Поллака Бергу.
Один из таких ферментов был выделен из кишечной палочки и назван ДНК-полимераза. ДНК-полимераза осуществляет синтез ДНК на матрице ДНК. Обратная транскриптаза тоже относится к классу ДНК-полимераз, только синтез при этом осуществляется на матрице РНК. Таким образом ученые получили в свое распоряжение ферменты, сшивающие и полимеризующие ДНК.
В. Арбер работал в Цюрихе с фагами и нашел у них фермент, с помощью которого эти вирусы разрезают хозяйскую ДНК и вставляют в нее свой геном. Американец Х. Смит из университета им. Дж. Гопкинса в Балтиморе получил этот фермент в пробирке, а Д. Натанс стал его систематически применять, все трое получили за новый прорыв Нобелевскую премию в 1978 г.
С помощью рестриктаз и сшивающих ДНК ферментов операции на генах стали обычным делом. Не удивительно поэтому, что в 1973 г. у П. Берга из Стэнфорда созрела идея эксперимента по переносу ракового гена в кишечную палочку. Эта идея взволновала Поллака, который и позвонил Бергу, чтобы выразить свои сомнения в необходимости такого опасного эксперимента и его правомочности.
Опасения были весьма оправданны. Тогда никто еще не знал, что такое гены раковых вирусов и какое отношение к генезу раковых опухолей у человека они имеют. Перенос гена в широко распространенную кишечную палочку действительно мог создать непредсказуемую опасность. Поллак вспоминал потом:
Рис. 4. Клетка кишечной палочки под электронным микроскопом (темная область – клеточная ДНК)
С целью привлечения всеобщего внимания к этой проблеме П. Берг организовал в Асиломаре на берегу Тихого океана неподалеку от Стэнфорда конференцию. На ней почти единогласно были приняты предложения оргкомитета, в состав которого входил Берг, призывающие проводить некоторые работы с рекомбинантными ДНК в специально оборудованных лабораториях, чтобы не распространять в окружающую среду биологическую опасность.
В дискуссию вступали и другие ученые, которые, казалось бы, были далеки от молекулярной генетики. Нобелевский лауреат Дж. Уолд, получивший свою награду за исследование механизмов зрения на молекулярном уровне, заявил, что новые опыты с бактериями могут умножить число генетических заболеваний.
Ему ответил М. Мезельсон, декан факультета биохимии Гарвардского университета, который в свое время первым экспериментально подтвердил одно из главных положений модели Уотсона и Крика – то, что ДНК двухцепочечна. В отличие от Уолда, Мезельсон всю свою сознательную научную жизнь занимался именно ДНК, поэтому для него эти рекомбинации, плазмиды, гены и полимеразы были хлебом насущным. Мезельсон заявил, что жизненно важное направление научных исследований, сулящее человечеству большие выгоды и избавление от многих бед, находится под угрозой срыва из-за преувеличенной боязни довольно слабо разбирающихся в этом людей.
В других случаях это может происходить по-иному. Забегая вперед, скажем, что в 1985 г. с помощью новейших методов биотехнологии были открыты так называемые гены-протекторы, которые защищают наши клетки от действия онкогенов. Сегодня один из таких генов уже выделен, идет интенсивная работа по расшифровке кодируемого им белка и выяснению его функции. При утере гена протектора клетка и весь организм остаются незащищенными от действия онкогенов и раковых белков. Возникает опухоль.
Выделение генов и создание способов их введения в клетки открыло перед биологами путь к началу современной биотехнологии, то есть технологии прямого манипулирования генами и их белковыми продуктами в промышленном масштабе. Благо, что промышленность, производящая биотехнологический продукт, уже работала. Что же это за промышленность, которая была создана загодя?
Введение. После открытия антибиотиков в середине прошлого века антибиотикотерапия позволила добиться снижения численности и тяжести проявления инфекционных болезней. Тем не менее, частым следствием их применения в производственной среде является появление резистентных штаммов микроорганизмов, причем механизмы развития антибиотикорезис-тентности у бактерий многосторонни, а фенотипическим следствием приобретения устойчивости к антибактериальным препаратам является появление морфологически абберантных разновидностей в микробиологическом явлении, называемом морфологической пластичностью. Морфологическая пластичность бактерий является особым феноменом, благодаря которому бактерии приобретают адаптивные преимущества для приспособления к изменяющимся условиям среды. В настоящее время, совокупность факторов окружающей среды, которые могут индуцировать образование фенотипически гетерогенных форм бактерий, в целом определена, но лежащие в основе молекулярные механизмы остаются в основном неизвестными. Физические и химические воздействия, вызывающие морфологические вариации у бактерий, в основном связаны с изменениями механизмов биосинтеза компонентов клеточной стенки. К таким факторам относят голодание, оксидативный шок, протестное хищничество, антимикробные агенты, температурные стрессы, осмотический шок и механические ограничения. Морфологическая абберация приводит к трансформации микроорганизмов в различные морфологические варианты, причем большинство из них в конечном итоге реверсируют к типичной морфологии клеток [5].
Характерная морфология бактерий поддерживается в течение бесконечного числа поколений и рассматривается в качестве видоспецифического фенотипического признака, однако периодически она может меняться в разные этапы жизненного цикла. Бактериальная форма генетически детерминирована, однако физические и химические факторы в настоящее время признаются в качестве основных участников морфогенеза бактерий.
Бактериальная морфология в основном определяется пептидог-ликано-вым (ПГ) экзоскелетом [6], полимерной макромолекулярной структурой, которая окружает цитоплазматическую мембрану и является основным жестким элементом в бактериальной оболочке. Пептидогликановая оболочка в бактериях обеспечивает постоянство морфологии бактерии, однако она также и достаточно пластичная, допуская динамические модификации. Пептидогликан представляет собой полимер гликановых цепей, сшитых пентапептидными мостиками [4]. Структура мономерной субъединицы, N-ацетилглюкозаминил-Ы-ацетилмурамил-1_-аланил-0-глутаминил-1_-(мезо) диаминопимелил-D-аланил-Э-аланин (GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-L-mesoDAP-D-Ala-D-Ala), устойчиво единообразна по всему филогенетическому древу бактерий. Немногочисленные вариации представляют собой либо изменение аминокислотной последовательности пептида (почти всегда диаминокислоты в положении 3), либо следствия дополнительных реакций, которые модифицируют основную субъединицу (например, O-ацетилирование сахаров или амидирование дикарбоновой аминокислоты) [1].
Фенотипическая пластичность известна у разных видов бактерий. В зависимости от селективного давления, физических ограничений, моделей роста и деления, морфология бактерий очень разнообразна даже у близкородственных родов. Для некоторых бактерий в их естественной среде обитания, таких как Caulobacter crescentus в пресной воде с ограниченным наличием питательных веществ и уропатоген-ной кишечной палочки Escherichia coli (UPEC) в мочевых путях млекопитающих, морфологическая пластичность играет ключевую роль в большей выживаемости в неблагоприятных условиях. Модуляция морфогенеза бактерий, вызванная различными факторами окружающей среды, чаще имеет взаимосвязь между воздействиями окружающей среды и молекулярными путями метаболизма, которые прямо или косвенно изменяют сборку пептидогликана, приводя к трансформации бактериальной морфологии. Например, превращение UPEC и Mycobacterium tuberculosis в филаментные (нитчатые) бактерии вызвано ингибированием дивисом через активацию SOS-системы бактерий или индуцировано продукцией активных форм кислорода [5]. Филаментация представляет одну из разновидностей морфологической пластичности бактерий.
Целью настоящей работы стало рассмотрение кишечной палочки (Escherichia coli) в качестве основной иллюстрации морфологической пластичности бактерий, чтобы обсудить причину морфологической аб-берации и вероятную связь антибиотикотерапии с появлением филаментных форм бактерии.
Материалы и методы исследований. Материалом для исследования служил биоматериал, полученный от 12 птиц и 8 свиней из двух различных сельскохозяйственных предприятий Гомельской области. Бактериологическому исследованию были подвергнуты пробы внутренних органов (печень, брыжеечные лимфатические узлы, селезенка, почки). Предприятия - источники происхождения биоматериала для исследования были благополучными по инфекционным болезням; противоэпизоотические мероприятия осуществлялись в полном объеме согласно плану. В поголовьях предприятий отмечаются единичные случаи падежа молодняка животных, регистрируемые как следствие незаразной патологии. В качестве лечебно-профилактических средств используются антибиотики различных групп, в том числе цефалоспоринового ряда.
У павших животных при жизни отмечали диарейный синдром средней интенсивности, животные подвергались лечению одним из антибиотиков цефалоспориновой группы.
Бактериологическое исследование проводили с целью идентификации возбудителя, учитывая возможный спектр диареагенных микроорганизмов (кишечная палочка, сальмонеллы, энтеробактерии ассоциативных кишечных инфекций). Первичную изоляцию микроорганизмов проводили на среде Эндо с последующей идентификацией по биохимическим тестам на цветном ряде. Исследование морфологии выделяемых микроорганизмов и определение подвижности проводили микроскопическим методом.
Таблица 1. Чувствительность изолята E. coli к антибиотикам (диско-диффузионным методом в мм)
Читайте также:
- У аскариды в отличие от планарии тело
- Сдать кал на паразиты на розы люксембург
- Вазелиновое масло для щенков при глистах
- Народные средство от зуда при глистах
- Дружба в одни ворота подруги паразиты
Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.
Copyright © Иммунитет и инфекции