Что такое кишечная палочка о 144

Установление причинной роли кишечных палочек в возникновении острых кишечных заболеваний довольно затруднительно, поскольку эти микроорганизмы широко распространены в природе, постоянно присутствуют в кишечнике здоровых людей [9] и животных, очень устойчивы к различным физико-химическим факторам и способны развиваться на самых разнообразных средах, в том числе и на пищевых продуктах. Кишечные палочки являются по существу комменсалом человека и важным антагонистическим фактором для гнилостных микроорганизмов, ограничивающим их развитие в кишечнике. Характерно, что по количеству микробов различные отделы желудочно-кишечного тракта здорового человека резко различаются. Количество микроорганизмов возрастает по направлению от желудка к толстому отделу кишечника. При нормальном функционировании желудка микрофлора в нем почти полностью отсутствует. Желудочный сок обладает чрезвычайно выраженными бактерицидными свойствами. В толстом отделе кишечника содержится колоссальное количество микробов. В составе микрофлоры кишечника взрослых людей обнаружено более 260 видов микроорганизмов. Основную массу (96 - 99 %) составляют анаэробные бактерии (бифидобактерии, бактероиды). На факультативно-анаэробную микрофлору, к которой относятся кишечная палочка, лактобациллы, энтерококки, приходится около 1 - 4 % всей кишечной микрофлоры. Менее 0,01 - 0,001 % составляет так называемая остаточная микрофлора [6]. Кишечная палочка играет, безусловно, положительную роль в процессе пищеварения, витаминном балансе, а также в создании местного, кишечного, иммунитета. Большое значение имеет она и в построении общего иммунитета, предполагающего выработку специфических и неспецифических антител. Однако при известных обстоятельствах этот вид микроорганизма способен вызвать различные патологические состояния: колиты, энтериты, циститы, холециститы, сепсис. Иными словами, существует возможность превращения симбиозов нормально биологических в симбиозы патологические. Условно-патогенные микроорганизмы начинают играть роль паразита в том случае, если после окончания заболевания у макроорганизма не установятся с ним вновь симбиотические взаимоотношения [8].

Кишечная палочка (Escherichia coli) впервые была выделена из испражнений человека Т. Эшерихом в 1885 году [3]. Заболевания, вызываемые кишечной палочкой, называют коли-инфекциями, или эшерихиозами [6]. Кишечные инфекции, занимающие ведущее положение в структуре эшерихиозов, связаны с четырьмя различными группами, Е. coli-энтеротоксигенными (ЭТКП), энтероинвазивными (ЭИКП), энтеропатогенными (ЭПКП) и энтерогеморрагическими (ЭГКП) кишечными палочками. Штаммы этих групп различаются прежде всего по факторам патогенности, а также по клиническим проявлениям заболеваний, возбудителями которых они являются.

Энтеротоксигенные штаммы Е. coli вызывают диарею с выраженным болевым синдромом за счет воздействия на ганглиозидные рецепторы энтероцитов продуцируемых ими термолабильного и термостабилыюго энтеротоксинов, что приводит к активизации аденилатциклазиой системы, внутриклеточному накоплению цАМФ и, как следствие, секреции жидкости и электролитов в просвет кишечника [4].

Энтероинвазивные E. coli. обладают способностью к проникновению, инвазии, в слизистую оболочку кишечника и ведут себя в патогенетическом отношении как возбудители дизентерии [6]. Наиболее часто при этом заболевании выделяются О -124 [2], О-136 и О-144 серотипы кишечных палочек [5].

Энтеропатогенные эшерихии, группируемые в 2 класса на основе характера взаимодействия с клеточными культурами НЕр-2 и HeLa, колонизируют эпителий слизистой оболочки тонкой кишки, вызывая возникновение эрозий на его поверхности. Наличие у микроорганизмов плазмидокодируемого О-полисахарида с молекулярной массой 54 мДа способствует антифагоцитарной устойчивости возбудителей и развитию бактериемии.

Патогенез диареи, вызванной энтерогеморрагическими E. coli, связан с синтезом изолятами этой группы двух типов веротоксина, один из которых (SLT-1) имеет структурное и антигенное сродство с токсином S. dysenteriae
серовара 1.

В настоящее время в самостоятельную группу выделяют так называемые энтероадгезивные или аутоагглютинирующие штаммы Е. coli, однако их роль в развитии инфекций ЖКТ выяснена не до конца.

Штаммы патогенных эшерихии различаются также по антигенной структуре [4]. Они имеют три антигена:

1. О-антиген (соматический) - термостабильный, не разрушается при длительном кипячении и автоклавировании при температуре
   120 °С.
2. К-антиген - комплекс поверхностно расположенных антигенов, среди которых различают термолабильные (L,В,Vi) и термостабильные (А, М) антигены.
3. Н-антиген - жгутиковый термолабильный антиген.

Диагностическое значение имеют все три комплекса антигенов. К настоящему времени патогенные формы кишечных палочек подразделяются на 149 разновидностей по О-антигену, на 94 серологическую разновидность по К-антигену и на 56 серологических разновидностей по Н-антигену [5].

Болезнь, вызываемая ЭПКП, ЭИКП и ЭТКП, клинически проявляется в основном одинаково, варьируя от умеренной диареи до тяжелого холероподобного состояния. Некоторые данные позволяют предположить, что болезнь, вызванная штаммами ЭТКП, вырабатывающими только термостабильный энтеротоксин, протекает быстрее, чем вызванная теми штаммами ЭТКП, которые вырабатывают оба энтеротоксина - термостабильный и термолабильный [6].

Инкубационный период длится от 3 до 6 дней (чаще 4-5 дней) [2]. Начало болезни чаще всего острое. Обычно заболевание начинается с болей в животе, поноса, рвоты и повышения температуры [7], протекая в форме энтерита. Энтерит может быть легкий, среднетяжелый и тяжелый. Стул бывает 3 - 5 раз, иногда до 15 раз в сутки. Испражнения жидкие, пенистые, зловонные. Выздоровление наступает через 5 - 7 дней. Относительно часто бывают рецидивы. В разгар заболевания наблюдаются небольшое повышение СОЭ, умеренный лейкоцитоз со сдвигом влево, моноцитоз, иногда повышение гематокрита [6]. В легких случаях явления токсикоза выражены слабо, температура повышается только до субфебрильной [2]. Среднетяжелые и особенно тяжелые формы сопровождаются повторной рвотой, упорными поносами и повышением температуры до 38 - 39 °С. В результате резкого обезвоживания (IV степень, потеря жидкости, составляющая 10 % массы тела) может наступить гиповолемический шок.

В диагностике эшерихиоза решающее значение приобретает высев возбудителя. Пробы (испражнения для выделения копрокультуры) от больного следует брать с 1 дня заболевания до принятия им антибиотиков или других химиотерапевтических препаратов, которые снижают возможность выделения возбудителя. Испражнения больных собирают в индивидуальное чистое подкладное судно или горшок (у грудных детей - с пеленок). Сбор материала можно производить, не дожидаясь дефекации, с помощью ректальных ватных или ватно-марлевых тампонов (укрепленных на деревянной палочке или проволочной петле), стеклянной ректальной трубки (длина трубки 15 - 20 см диаметр для детей 5 мм, для взрослых 10 мм). Ректальный тампон или трубку вводят в прямую кишку детям на 8-10 см, взрослым - на 10 - 15 см, укладывая больных на левый бок с полусогнутыми коленями [6].

Профилактические мероприятия сводятся к соблюдению санитарногигиенического режима и правил личной гигиены. Специфическую профилактику не проводят. Для лечения используют левомицетин, неомицин и другие антибиотики. При хронической инфекции применяют бактериофаги и аутовакцину. При кишечном дисбактериозе используют колибактерии, приготовленный из живой культуры штамма кишечной палочки М₁₇ [1].

Эшерихии разбираются по схеме:

E.coli – играет основную роль в патологии человека, сравнительно редко при различных поражениях выделяют:

Вид Escherichia coli крайне гетерогенный, его диареегенные варианты рассматриваются как патогенные, остальные – как условно-патогенные.

К постоянным признакам относятся:

Не продуцируют сероводород.

Не растут на цитратном агаре Симмонса.

Положительная реакция Фогеса-Проскауэра.

Сущность реакции: способность бактерий образовывать ацетилметилкарбинол при ферментации глюкозы.

Постановка реакции: в культуру, выросшую на МПБ с глюкозой, вносят

несколько капель -нафтола и 1 мл 10% раствора КОН.

Оценка реакции: при положительном результате среда окрашивается в

Остальные биохимические свойства вариабельны.

О-антиген: липополисахарид (антигенную специфичность обуславливает полисахаридный компонент), термостабильный, серологическая классификация по О-антигену – ведущая у эшерихий, различают 173 серовара;

К-антиген: поверхностный, часто препятствует проявлению агглютинации культуры в соответствующей О-сыворотке, образуется кислыми полисахаридами и, редко, протеинами, может служить рецептором для бактериофагов, подразделяется на три группы (L, В и А), различают 80 сероваров.

Н-антиген: жгутиковый, термолабильный, различают 56 сероваров.

При идентификации кишечной палочки определяют все антигены, которыми обладает данный штамм, например E.coli O55:K5:H21.

Инфекции, вызываемые эшерихиями разбираются по схеме:

Так как эшерихии являются нормальными обитателями кишечника не только человека, но и животных, установить роль последних в качестве источника инфекции затруднительно.

Основной механизм (путь) передачи

Основной механизм распространения диареегенных эшерихий – фекально-оральный, а в стационарных и закрытых коллективах всех типов более значим контактный путь передачи.

Дополнительный механизм (путь) передачи

а) энтеротоксигенные кишечные палочки вызывают:

гастроэнтериты у детей младшего возраста в странах тропического пояса,

схожие с ними поражения, зарегистрированные во время военных действий в странах с жарким климатом (в частности, во время войны в Персидском заливе),

с 70-х гг. гастроэнтериты такого типа регистрируются в развитых странах Европы и США;

б) энтероинвазивные кишечные палочки вызывают дизентериеподобную инфекцию;

в) энтеропатогенные кишечные палочки являются основными возбудителями диареи у детей, заболевания протекают очень тяжело и могут продолжаться 2 недели и более.

Бактериемия. До 50-х годов кишечная палочка из крови пациентов практически не выделялась, а на сегодняшний день она является причиной 17 – 35% бактериемий у детей и взрослых (серовары О6. О4. О2 и др.). У новорожденных в 15 – 20% случаев заболевание обусловлено манипуляциями на мочевыводящих путях, но обычно источник остается неизвестным. У взрослых первичные источники инфекции – мочевыводящие пути (40-60%) и кишечник (25-30%), в 25% случаев установить источник инфекции не удается.

Менингит. У взрослых развиваются редко, в основном – это патология новорожденных и в большинстве случаев развиваются как осложнения бактериемии. Летальность у новорожденных достигает 12-35% и у 20-50% выживших сохраняются остаточные неврологические расстройства. Большинство штаммов кишечной палочки, вызывающих менингит, имеет капсульный антиген (К1), схожий с капсульным полисахаридом менингококка.

В зависимости от своих свойств, а следовательно - от особенностей патогенеза, кишечные палочки, вызывающие поражения, сопровождающиеся диареей, подразделяются на 5 групп.

Энтеротоксигенные (ЕТЕС) кишечные палочки (серовары О1, О15, О148 и др.) прикрепляются к клеткам слизистой оболочки нижних отделов тонкого кишечника (с помощью пилей и особых фимбриальных факторов, облегчающих адгезию и способствующих колонизации эпителиоцитов). Выделяют энтеротоксин, по своему эффекту аналогичный токсину холерного вибриона, вследствие чего усиливается секреция в просвет кишечника жидкости и растворенных в ней электролитов. В итоге развивается секреторная диарея.

Энтероинвазивные (ЕIEC) кишечные палочки (серовары О124, О144 и др.) прикрепляются к колоноцитам и, обладая выраженными инвазивными свойствами, подобно шигеллам, проникают внутрь клеток. В результате развивается язвенно-катаральное воспаление с дизентериеподобным синдромом (воспалительная диарея).

Энтеропатогенные (ЕРЕС) кишечные палочки (серовары О26, О55, О111 и др.) прикрепляются (способность к адгезии обусловлена особой плазмидой) к эпителиальным клеткам кишечника, но не проникают внутрь их. Развивается вакуализация с последующей гибелью ворсинок этих клеток и наблюдается сглаживание слизистой оболочки кишечника. В дальнейшем могут развиваться эрозии. Захват энтеропатогенных кишечных палочек макрофагами и лейкоцитами может привести, при разрушении этих клеток к развитию бактериемии.

Энтерогеморрагические (ЕНЕС) кишечные палочки (серовары О26, О111, основной серовар этой группы – О157, впервые выделенный в 1982 г.) атакуют эпителиальный клетки нижних отделов подвздошной кишки и толстого кишечника (адгезия обуславливается наличием фимбрий, кодируемых особой плазмидой). Вследствие выработки кишечными палочками этой группы особого цитотоксина (соответствующий ген переносится бактериофагом), вызывающего гибель клеток HeLa и Vero in vitro (шигеллоподобный токсин) слизистая оболочка толстого кишечника разрушается и развивается геморрагический колит, а в дельнейшем возможно развитие гемолитико-уремического синдрома (гемолитическая анемия + почечная недостаточность).

Энтероадгезивные кишечные палочки впервые выделены в особую группу в 1985 г. по способности адгезировать к клеткам культутуры Нер-2. Кишечные палочки этой группы слабо изучены.

Иммунитет: Заболевания, вызываемые условно-патогенными кишечными палочками (коли-бактериозы)развиваются на фоне иммунодефицитных состояний и не сопровождаются развитием невосприимчивости. Выздоровлению способствует активация неспецифических факторов защиты.

Заболевания, вызываемые диареегенными кишечными палочками (коли-инфекция) сопровождается выработкой слабовыраженного группоспецифического иммунитета, связанного в первую очередь с выработкой IgAS.

ПФ: У детей раннего возраста естественный иммунитет против возбудителей коли-инфекции обеспечивается:

антителами грудного материнского молока, стимулирующего, кроме того, размножение бифидобактерий кишечника ребенка,

IgG против дизентериеподобных эшерихий проходят через плаценту, поэтому маленькие детеи не восприимчивы к ним, как и к шигеллам; в то же время IgM против энтеропатогенных штаммов через плаценту не проходят, поэтому материнского иммунитета против этой группы кишечных палочек не существует.

Микробиологическая диагностика разбирается по схеме:

Микробиологическая диагностика при эшерихиозах важную роль так как клиническая симптоматика мало патогномична.

Выбор патологического материала зависит от диагностируемой клинической формы

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Сидорчук Л.И., Ротар Д.В., Гуменная А.В., Сидорчук И.И.

Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Сидорчук Л.И., Ротар Д.В., Гуменная А.В., Сидорчук И.И.

THE ROLE OF ENTEROPATHOGENIC E.COLI IN THE DEVELOPMENT AND PROGRESSION OF CHRONIC NON-ULCERATIVE COLITIS

Орипнальш досл1дження Original Researches ■ Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

4. Ентерогеморагiчнi кишковi палички (ЕГКП) — за вiрулентнiстю щ ешерихи переважають попереднi. Захворювання, що спровоковаш ЕГКП, супроводжуються загальною iнтоксикацiею (нудота, блювота), в тяжких ви-падках — гемолiтичною анемiею та гострою печiнковою недостатнiстю.

За даними iмунотипування штамiв E. coliдиференцш-ють 173 варiанти. Основним е подт за О-антигеном, саме з ним пов'язана вiрулентнiсть E. coli. Результати вивчення таксономiчного складу кишкових паличок у вмiстi порожнини ТК хворих на ХНВК наведеш у табл. 1.

Продемонстровано, що за еколопчними показниками кишкових паличок, яи не видляються у практично здо-рових людей, у хворих на ХНВК вони персистують як до-даткова мiкробiота — E. coli Hly+, E. coli Lac— та ЕПКП, а ЕТКП, Е1КП та ЕГКП у мiкробiоценозi порожнини ТК вщграють роль випадково! мкробюти. У вмiстi порожнини ТК практично здорових людей щ мiкроорганiзми не виявленi.

Вщомо, що кишковi палички за морфолопчними, тинкгорiальними, культуральними та бiохiмiчними вла-стивостями практично не вiдрiзняються вщ E. coli, що формуе нормофлору кишечника. Для встановлення шта-мiв (варiантiв) E. coli, що здатш викликати ешерихюзи, необхщно вивчити !х антигенну структуру за О-, К- i Н-

Таблиця 1. Таксоном1чний склад кишкових паличок у вмст порожнини товстоi кишки хворих

на хрон1чний невиразковий колт

Хворi на ХНВК (n = 157) Практично здоров'1 особи (n = 107) Те

Кишков! палички Видлено штам'в i- с о 1 к Ü 0 п кс е f Частота зустр'мальност'! 1ндекс видового багатства Маргалефа 1ндекс видового рiзноманiття У/ттекера 1ндекс видового домiнування С1монса Видлено штам'в к с о 1 к Ü 0 п кс е 1 Частота зустр'мальностi 1ндекс видового багатства Маргалефа 1ндекс видового рiзноманiття У/ттекера 1ндекс видового домiнування С1монса м ) 2 о Q) 2 ас зо а с P (за iндексом У/ттекер P (за ндексом С 'монса

E. coli 149 94,50 0,13 0,130 16,84 0,017 107 100,00 0,23 0,229 14,70 0,053 Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

О127а:К63 3 1,91 0,03 8,11 ± 0,42 1,84 0,03

О128ав:К67 8 5,10 0,09 7,97 ± 0,41 4,83 0,09

2. Ентеротоксигенн1 ешерихй'

О25:К11 10 6,37 0,11 8,89 ± 0,41 6,73 0,12

О128:К67 8 5,10 0,09 7,97 ± 0,37 4,83 0,09

3. Ентеро1нвазивн1 ешерихй'

О124:К72 9 5,73 0,10 8,98 ± 0,53 5,05 0,11

О144:К 5 3,18 0,06 8,03 ± 0,41 3,04 0,06

4. Ентерогеморапчн1 ешерихй'

О125:К70 3 1,91 0,03 8,90 ± 0,49 2,02 0,03

О128:К67 8 5,10 0,09 7,97 ± 0,41 4,83 0,09

антигенами. Результата вивчення серолопчних BapiamiB E. coli, персистуючих у порожниш ТК хворих на ХНВК, наведеш у табл. 2.

Ешерихюзна шфекщя характеризуемся вираженим полiморфiзмом клшчно! картини, що пов'язано, з нашо'1 точки зору, не тльки i3 захисними факторами вроджено-го iмунiтету хворого органiзму, але й з антигенними вла-стивостями ЕПКП. У хворих, у порожниш ТК яких ви-явленi E. coli О18ас:К77; 026:K60; О55:К59; О128ав:К67, захворювання мало перебiг за нозолопчною формою колiентериту. У хворих, iз порожнини ТК яких видтили сероварiанти 025:К11; 0144:К; 0124:К72 (ентерошва-зивш ешерихй), захворювання перебiгало як бактерiаль-на дизентерия. Захворювання деяких пащенлв, в яких персистували E. coli 025:К11 (у 4 хворих) i 0128:К67 (у 2 хворих), перебрало у холероподiбнiй формi.

У хворих на ХНВК виявлялись сероварiанти, що належать до ЕПКП, ЕТКП, Е1КП i ЕГКП. Найчастiше виявлялись ЕПКП, що включали 10 сероварiантiв, серед яких найчаспше були 0114:К90 (iндекс постiйностi (1П) — 6,37 %), 018ас:К77 (1П — 5,10 %) i 0128:К67 (1П — 5,10 %). Серед ЕТКП найчаспше виявляли сероварiанти 025:К11 (1П-6,37 %), серед Е1КП — серовар 0124:К72 (1П — 5,73 %) i серед ЕГКП — 0128:К67 (1П — 5,10 %).

1. У хворих на хрошчний невиразковий коли ви-являються звичайш кишковi палички у порожнинi ТК у 94,50 % хворих, разом з тим у 55 (35,03 %) хворих персистують ентеропатогенш ешерихй', у 41 (26,11 %)

хворого — E. coli Hly+, у 37 (23,57 %) — E. coli Lac—, у 18 (11,46 %) — ентеротоксигенш кишковi палички, у 14 (8,42 %) — ентерошвазивш ешерихй' та в 11 (7,01 %) — ентерогеморапчш ешерихй', яы, KpiM зви-чайних кишкових паличок, мають перехресно реа-гукш антигени з ештелюцитами слизово!' оболонки ТК, що формуе припущення про !'х етiологiчне зна-чення при даному захворюванш, яке просто немож-ливо iгнорувати.

2. Основними сероварiантами умовно-патогенних ешерих1й, що колошзують ТК хворих на хронiчний невиразковий коли i персистують в ii порожнинi, е 0114:K90; О25:К11; О124:К72; О128:К67; О18ас:К77, персистенцiя яких впливае на клiнiчну манiфестацiю вщ колiту до ди-зентерiеподiбного або до холероподабного захворювання.

Iнформацiя про наявнють чи вщсутшсть конфл1кгу ште-рес1в: конфлiкт iнтересiв вiдсутнiй.

1. Белоусова О.Ю. Хротчний неcnецuфiчнuй невиразковий колт у дтей (етюлогы, патогенез, класифжацы, клшчт прояви, дiагноcтика, лкування, диспансеризацы): метод. рекоменд. / О.Ю. Белоусова; Харк. мед. акад. мслядипл. освти МОЗ Укр. — К., 2007. — 19с.

2. Головатюк Л.М. Роль етiологiчних чинниюв у розвитку ушкоджень товстог кишки /Л.М. Головатюк // Всник морфологи. — 2015. — № 2. — С. 537-541.

3. Лопач С.И. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Ехсе1 / С.И. Лопач, А.В. Чубенко, Н.Н. Бабич. — К.: МОРИОН, 2000. — 320с.

4. Про затвердження утфкованих клшчних протоколiв ме-дичног допомоги дтям iз захворюваннями оргатв травлення: Наказ МОЗУкрагни№59вiд 29.01.2013р. Утфжований протокол медичног допомоги дтям is хротчним неcпецифiчним невиразко-вим колтом.

6. Shiga Toxigenic Escherichia coli in Iranian Pediatric Patients With and Without Diarrhea: O-Serogroups, Virulence Factors and Antimicrobial Resistance Properties. [Electronic resource] / B. Dormanesh, S. Siroosbakhat, P. Karimi Goudarzi [et al.] // Iran. Red. Crescent. Med. J. — 2015. — № 17 (Vol. 10) — P. 297-306. doi: 10.5812/ircmj.29706.

СидорчукЛ.И., Ротар Д.В., Гуменная А.В., СидорчукИ.И.

РОЛЬ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК В РАЗВИТИИ И ТЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОГО НЕЯЗВЕННОГО КОЛИТА

зологической форме колиэнтерита. У пациентов, у которых выделяли сероварианты 025:К11; 0144:К; 0124:К72, заболевание протекало как бактериальная дизентерия, а если 025:К11 и 0128:К67 — то в холероподобной форме. Обсуждение. У 94,50 % больных выявляются обычные E. coli, но в 55 (35,03 %) персисти-руют энтеропатогенные эшерихии, у 41 (26,11 %) — E. coli Hly+, у 37 (23,57 %) — E. coli Lac—, у 18 (11,46 %) — энтеротоксигенные E. coli, у 14 (8,42 %) — энтероинвазивные и у 11 (7,01 %) — энте-рогеморрагические эшерихии. Выводы. 0пределено, что основными серовариантами условно-патогенных эшерихий, которые колонизируют толстую кишку больных хроническим неязвенным колитом и персистируют в ее полости, являются 0114:К90; 025:К11; 0124:К72; 0128:К67; 018ас:К77, персистенция которых влияет на клиническую манифестацию от колита до дизен-териеподобного или холероподобного заболевания.

Ключевые слова: хронический неязвенный колит, энтеропа-тогенные кишечные палочки.

SydorchukL.I., RotarD.V., HumennaA.V., SydorchukI.Y.

Higher State Educational Institution of Ukraine «Bukovinian State Medical University, Chernivtsi, Ukraine

КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

Название Разработка объединенной схемы типирования кишечной палочки и шигелл и улучшение средств диагностики и вакцинопрофилактики дизентерии на основе комплексного исследования О-антигенов

Руководитель Книрель Юрий Александрович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ 2017 - 2018

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-203 - Общая биохимия

Ключевые слова антиген, бактерия, кишечная палочка, дизентерия, вакцина, диагностика, классификация, иммуноспецифичность, полисахарид, генный кластер О-антигена, клеточная стенка

Код ГРНТИ 34.15.37

Статус Успешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Кишечная палочка (Escherichia coli) - клональный вид бактерий, включающий как комменсальные, так и патогенные штаммы. К последним относятся возбудители диареи (эшерихиоза) и ряда более серьезных заболеваний, таких как энтероколит, геморрагический колит и гемолитико-уремического синдром. Шигеллы (Shigella spp.) - возбудители бактериальной дизентерии (шигеллеза), которые недавно на основании генетических данных предложено включить в вид E. coli. Настоящий проект является продолжением проекта, поддержанного в 2014-2016 гг. РНФ (грант № 14-14-01042), и посвящен в основном завершению работы по созданию объединенной классификационной схемы эшерихий и шигелл, основанной на структурно и генетически охарактеризованных О-антигенах. В его рамках будут установлены новые структуры остававшихся неизученными О-антигенов типовых штаммов 10 О-серогрупп E. coli (O33, O34, O44, O50, O89, O92, O93, O106, O144 и O179) из общего числа более 200 О-серогрупп. Кроме того, будет проведен структурный анализ О-антигенов новых штаммов E. coli (не менее трех), выделенных из окружающей среды, которые отличаются от О-антигенов типовых штаммов, и будет определено место этих штаммов в новой классификационной схеме. Будет проведена аннотации генов биосинтеза О-антигенов всех штаммов эшерихий, которые будут исследованы в рамках продолжающегося проекта. Будет завершен генетический анализ О-антигенов E. coli O57 и O62, строение О-полисахаридов которых было установлена ранее и генные кластеры биосинтеза О-антигенов которых в типичном для эшерихий месте инактивированы. Альтернативные функциональные генные кластеры будут обнаружены в другом месте генома этих бактерий, будет экспериментально подтверждена их роль в синтезе экспрессируемых O-антигенов и будут аннотированы входящие в них гены. Гены гликозилтрансфераз, участвующих в сборке олигосахаридных звеньев всех исследуемых О-антигенов, будут отнесены к гликозидным связям и на основании полученных нами и другими исследователями данных будет создана первая база данных гликозилтранфераз кишечных бактерий. Таким образом, впервые будут многосторонне структурно и генетически охарактеризованы О-антигены беспрецедентно широкого круга близкородственных микроорганизмов (более 200 клонов кишечных бактерий). Это позволит выявить новые антигенные взаимосвязи между этими О-антигенами, в том числе между родительскими и дочерними клонами, и прольет свет на пути и молекулярные механизмы формирования наблюдаемого разнообразия О антигенных форм в ходе эволюции кишечных бактерий. В рамках проекта будет проведено также структурно-генетическое исследование О-антигенов ближайшего к E. coli бактериального вида Eschericha albertii, которые ранее не исследовались. Будут изучены О-антигены представителей всех выявленных к настоящему времени семи молекулярных типов E. albertii, будут установлены их структуры и аннотированы гены их биосинтеза, будет выяснена степень родства между О-антигенами двух видов эшерихий. На основании полученных данных будет предложена первая классификационная схема штаммов E. albertii. Будет дана оценка целесообразности объединения классификационных схем E. coli и E. albertii. Кроме того, будет изучено взаимодействия О-антигена E. coli O157 с рецепторными белками хвостовых фибрилл специфического вирулентного бактериофага CBA120. Ранее в рамках проекта РНФ № 14-14-01042 было найдено, что рецепторный белок 163d бактериофага CBA120 расщепляет О157-антиген по гидролитическому механизму по L-фукозидным связям. Дальнейшее исследование показало, что бактериофаг CBA120 имеет четыре различных рецепторных белка (162d-165d), два из которых, включая изученный белок 163d, способны инфицировать бактерию, а два другие - нет, хотя все они связываются с О157-антигеном и, возможно, модифицируют его. В рамках продолжающегося проекта будут выяснены механизмы взаимодействия белков 162d, 164d и 165d с О-антигеном E. coli O157, которые лежат в основе биохимических процессов, предшествующих инфицированию клеток бактериофагом.

Ожидаемые результаты
Будет установлено строение и аннотированы гены биосинтеза О-антигенов типовых штаммов всех О-серогрупп эшерихий, остававшихся неисследованными в этом отношении, и не менее трех новых штаммов E. coli, выделенных из окружающей среды. В результате будет расширено представление о разнообразии структур О-антигенов кишечных бактерий и о генетических факторах, участвующих в диверсификации этих структур. Будет завершено создание расширенной объединенной классификационной схемы эшерихий и шигелл, основанной на всех известных структурно и генетически охарактеризованных О-антигенах. Назревшая необходимость объединения этих бактерий в рамках одной классификационной схемы диктуется как недавним пересмотром таксономического положения шигелл, которые предложено включить в вид E. coli, так и тесным родством О-антигенов этих бактерий. Эта схема необходима для повышения эффективности и надежности типирования штаммов кишечных бактерий и, как следствие, для улучшения эпидемиологического мониторинга и разработки улучшенных методов диагностики и вакцинопрофилактики инфекций, вызываемых патогенными штаммами. В результате аннотации генов биосинтеза О-антигенов будут выявлены гены, специфичные для каждой О-серогруппы, которые будут предложены в качестве новых мишеней для молекулярной экспресс-диагностики кишечных инфекций. Будет создана первая база данных гликозилтранфераз кишечных бактерий с определенными функциями, которая будет востребована для функционального анализа других бактериальных гликозилтранфераз. Будет разработана первая необходимая для эпидемиологических целей схема типирования бактерий E. albertii - возбудителей спорадических и эпидемических кишечных инфекций у людей и птиц - на основе всех известных в настоящее время структурно и генетически охарактеризованных О-антигенных форм. Будет выяснен механизм (или механизмы) взаимодействия рецепторных белков хвостовых фибрилл специфического вирулентного бактериофага CBA120 с О-антигеном E. coli O157 как биохимическая основа первой стадии инфицирования бактерий бактериофагом. Этот бактериофаг имеет потенциал использования в качестве средства фаготерапии гемолитико-уремического синдрома и геморрагического колита - особо опасных инфекций, вызываемых штаммами E. coli O157.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Кишечная палочка (Escherichia coli) является одним из компонентов нормальной микрофлоры кишечника, но при определенных условиях может вызывать диарею, а некоторые штаммы ответственны за более серьезные заболевания, такие как энтероколиты, геморрагическую лихорадку и гемолитико-уремический синдром. E. coli - один из наиболее гетерогенных видов бактерий в отношении О-антигенов, которые представляют собой полисахаридные цепи липополисахаридов, встроенных во внешнюю мембрану бактериальной клетки. Большинство специфических генов, кодирующих ферменты пути биосинтеза О-антигенов, собраны в генный кластер на хромосоме, и вариации этих генов определяют наблюдаемое разнообразие структур О-полисахаридов. Схема типирования штаммов кишечной палочки, необходимая для серодиагностики инфекционных заболеваний, основана на иммуноспецифичности О-антигенов и включает более 180 О-серогрупп. В настоящее время серодиагностика вытесняется молекулярной диагностикой, основанной на специфических генах биосинтеза О-антигенов. В рамках проекта проводится структурно-генетическое изучение О-антигенов с целью создания надежной основы и уточнения классификации E. coli. К настоящему времени неизученными остаются менее 10 О-серогрупп этих бактерий. За отчетный период охарактеризованы О-антигены двух ранее неисследованных серогрупп (O50 и O92) и трех штаммов выделенных из окружающей среды (F5, F17 и 8up). О-полисахарид серогруппы O92 идентифицирован как новый фруктан, отличающийся по структуре от известных фруктанов левана и инулина. О-полисахарид серогруппы O50 оказался гетерополисахаридом, родственным О-полисахариду E. coli серогруппы O2, который отличается только присутствием дополнительного бокового моносахарида 3-ацетамидо-3-дезокси-D-фукозы (D-Fuc3NAc). В генных кластерах О-антигенов обеих бактерий, которые идентичны на 99%, присутствуют гены для биосинтеза D-Fuc3NAc, но в серогруппе O50 один из этих генов инактивирован и, как следствие, биосинтез D-Fuc3NAc в этом штамме заблокирован. Структура О-полисахарида и генный кластер биосинтеза О-антигена одного из штаммов из окружающей среды F17 не встречались у других бактерий. На основании этого для штамма F17 предложено создать новую О-серогруппу E. coli и считать его типовым штаммом этой серогруппы. О-полисахариды двух других штаммов из окружающей среды F5 и 8up оказались структурными вариантами О-полисахаридов серогрупп O28 и O109, соответственно. Они отличались положением замещения глицерофосфата (O28/F5) или характером О-ацетилирования (O109/8up). Как ожидалось, генные кластеры О-антигенов этих бактерий характеризовались высокой степенью гомологии. На основании полученных данных предложено разделить каждую из серогрупп E. coli O28 и O109 на подгруппы и включить в эти серогруппы штаммы F5 и 8up в качестве новых подгрупп. В рамках проекта найдено, что установленная нами ранее структура О-полисахарида E. coli O62 не соответствует генному кластеру О-антигена, который по составу и организации генов практически идентичен генному кластеру другой серогруппы - E. coli O68. Оказалось, что у бактерии E. coli O62 этот генный кластер не является функциональным вследствие инактивации одного из генов, участвующих в биосинтезе L-рамнозы - одного из основных компонентов О-полисахарида E. coli O68. В результате E. coli O62 не синтезирует O68-антиген, но экспрессирует О-полисахарид с другим составом (он содержит D-глюкопиранозу и D-галактофуранозу) и другой структурой. Полногеномное секвенирование позволило обнаружить генный кластер биосинтеза этого альтернативного О-антигена в другом месте генома E. coli O62. В нем присутствует ген glf для синтеза D-галактофуранозы, гены гликозилтранфераз для построения основной цепи О-полисахарида из остатков D-галактофуранозы и гены ABC-транспортера для трансмембранного переноса синтезированного О-антигена. Гены для присоединения двух боковых остатков глюкозы найдены вне генного кластера О-антигена в геноме профага, включенного в хромосому E. coli O62. Функциональность альтернативного генного кластера О62-антигена подтверждена мутацией wzm – одного из генов ABC-транспортера, которая привела к потери способности синтезировать О-полисахарид. Комплементация плазмидой с геном wzm E. coli O62 восстановила исходный хемотип. Биоинформатический анализ показал, что альтернативный функциональный генный кластер О62-антигена на 97% идентичен генетической области в хромосоме Enterobacter aerogenes CAV1320. Был сделан вывод, что штамм E. coli O62 произошел от штамма E. coli O68 в результате двух событий: инактивации генного кластера О68-антигена и приобретения нового генного кластера O-антигена от бактерии E. aerogenes. Кроме О-полисахаридов E. coli в рамках проекта проводится структурно-генетическое исследование О-антигенов Escherichia albertii - нового вида энтеробактерий, близкородственного E. coli. Штаммы этого вида являются возбудителями спорадических и эпидемических кишечных инфекций у людей и птиц. На основании О-антигенов выявлено cемь О-серотипов (EAO1-EAO7), из которых четыре (EAO1-EAO3 и EAO6) исследованы в отчетный период. О-антигены двух серотипов E. albertii EAO3 и EAO6 оказались близкородственными О-антигенам E. coli O181 и О3, соответственно. Так, они либо имеют идентичные по структуре О-полисахариды (EAO6/O3), либо отличаются только присутствием в одном из О-полисахаридов О-ацетильной группы (EAO3/O181). Соответственно, генные кластеры О-антигенов этих бактерий попарно практически идентичны (ген ацетилтрансферазы, модифицирующий О-полисахарид E. coli O181, находится вне генного кластера О-антигена). В связи с антигенным родством и близостью многих других характеристик, рекомендуется объединить классификационные схемы E. coli и E. albertii и включить серогруппы E. albertii EAO3 и EAO6 в существующие серогруппы E. coli O181 и O3, соответственно, в качестве новых подгрупп. О-полисахариды E. albertii EAO1 и EAO2 имеют уникальные структуры, и в объединенной классификационной схему E. coli и E. albertii они должны получить статус типовых штаммов новых серогрупп. Отметим особенность состава O-полисахарида E. albertii EAO1, который включает два производных редковстречающихся в природе кислых моносахаридов 2,3-диамино-2,3-дидезокси-D-маннуроновой кислоты и 2,3-диамино-2,3-дидезокси-D-глюкуроновой кислоты. При этом производное D-глюкуроновой кислоты с ацетимидоильной группой CH3C(=NH) при атоме азота в положении 2 обнаружено впервые в природе. Фаготерапия является перспективным методом борьбы с инфекционными заболеваниями, имеющим ряд преимуществ перед антибиотикотерапией. Важное значение имеет первая стадия взаимодействия бактериофагов с бактериями, включающая связывание и расщепление бактериального поверхностного полисахарида рецепторным белком бактериофага, так как она позволяет фаговой частице приблизиться к поверхности бактериальной клетки и осуществить последующую инъекцию фагового генома внутрь клетки. В связи с этим проводится поиск вирулентных бактериофагов, специфичных к патогенным бактериям, таким как E. coli O157, вызывающей геморрагическую лихорадку и гемолитико-уремический синдром. Одним из вирулентных бактериофагов, специфичных к E. coli O157, является фаг CBA120, который имеет четыре рецепторных белка, отличающихся по своей специфичности. В отчетный период нами изучен механизм расщепления О-полисахарида E. coli O157 рекомбинантным рецепторным белком gp163dd бактериофага CBA120, а также О-полисахаридов двух других O-серогрупп E. coli рекомбинантными рецепторными белками gp164 и gp165d этого же бактериофага. Найдено, что все три изученных рецепторных белка являются полисахаридными деполимеразами (гидролазами), расщепляющими различные О-полисахариды по различным гликозидным связям. Каждый из трех белков gp163dd, gp164 и gp165d строго специфичен к определенному O-полисахариду, а именно E. coli O157, O78 и O77, соответственно. В качестве продуктов расщепления О-полисахаридов идентифицированы олигосахариды, соответствующие повторяющемуся звену О-полисахарида (E. coli O157 и O78) и/или его олигомеру (E. coli O157 и O77). Наличие у одного бактериофага нескольких рецепторных белков с различной специфичностью по отношению к полисахаридным субстратам является уникальным и обнаружено в природе впервые. Таким образом, все работы, запланированные на отчетный период, выполнены. По результатам исследования опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах и сделано 3 сообщения на российских и международных научных конференциях.

1. Науменко О.И., Чжэн Х., Сенченкова С.Н., Ван Х., Ли Ц., Шашков А.С., Ван Ц., Книрель Ю.А., Сюн Я. Structures and gene clusters of the O-antigens of Escherichia albertii O3, O4, O6, and O7 Carbohydrate Research, Т. 449, С. 17-22 (год публикации - 2017).

2. Сенченкова С.Н., Сюй Г., Ци Я., Перепелов А.В., Шашков А.С., Лю Б., Книрель Ю.А. New fructan - the O-specific polysaccharide from Escherichia coli O92 Russian Chemical Bulletin, Т. 66, № 7, С. 1304-1307 (год публикации - 2017).