Что такое флотация гельминты

Каких паразитов можно обнаружить в фекалиях?

Фауну пищеварительного тракта делят на две большие группы-простейшие кишечника и гельминты. На сегодняшний день известно более 250 возбудителей гельминтозов у человека; из них наиболее распространены около 50 видов. Паразитирующие в организме человека гельминты, в основном, представлены круглыми (класс Nematoda); плоскими червями (класс сосальщиков Trematoda и ленточных червей Cestoidea).

К представителям круглых червей относятся острицы, аскариды, трихинеллы; власоглав; ленточных– бычий, свиной и карликовый цепни, эхинококки, широкий лентец; сосальщиков - кошачья и печеночная двуустки.

В фекалиях могут быть обнаружены вегетативные стадии и цисты более 20 видов простейших, яйца и личинки многих видов гельминтов

Прямые методы позволяют непосредственно выявить гельминты, их фрагменты, личинки или яйца. При исследовании прямыми методами чаще всего используются фекалии.

Иммунологические (косвенные) методы диагностики основаны на обнаружении в сыворотке крови спецефических антител к антигенам тех или иных гельминтов и простейших. Для некоторых паразитов (лямблии, аскариды, анизакиды, описторхи) иммунологические методы применяются для оценки адекватности иммунного ответа на антигены, также, они могут быть и самостоятельными диагностическими тестами.

Для ряда гельминтов (токсокара, эхиннокок), яйца которых не обнаруживаются прямыми методами копрологической диагностики, иммунологические методы являются основными диагностическими тестами.

На результаты исследования влияет срок поступления и хранения материала. При подозрении на инфицирование некоторыми паразитами кал должен быть исследован немедленно, или в течении 30-40 минут после дефекации. Более оптимальным является исследование кала с применением специальных консервантов.

Современные методы паразитологической диагностики включают методы флотации, седиментации, комбинированные, с использованием концентраторов и консервантов для оптимального сохранения материала.

-Исследование кала на простейшие и яйца гельминтов комплексным методом

-Исследование кала на простейшие без использования консерванта

-Исследование кала на простейшие (с использования консерванта)

-Исследование кала на яйца гельминтов методом Като

-Микроскопическое исследование отпечатков с поверхности кожи перианальных складок на яйца остриц

-Исследование кала на простейшие и яйца гельминтов комбинированным гельминтоовоскопическим методом

-Исследование кала на простейшие и яйца гельминтов комплексным методом с использованием концентратора Parasep

Правила подготовки к исследованию кала

- Кал собирают на протяжении 3 дней ежедневно (при дефекации каждый день) или через день (при запоре и опорожнении кишечника не ежедневно)

-Кал забирают ложечкой из контейнера (на кончике ложечки) из нескольких мест, общий ежедневный объем кала должен быть приблизительно с горошину, помещают в контейнер, перемешивают круговыми движениями, до исследования кал сохраняют в темном прохладном месте (не в холодильнике!) –оптимально на полу в туалетной комнате

-перед исследованием (за 1-2 дня) не рекомендуется употреблять в пищу грибы, печень, большое количество грубой клетчатки

-после приема масляных клизм должны пройти несколько суток

-в случае лечения антибиотиками широкого спектра действия кал для исследования рекомендуется собирается через 7-10 дней после окончания приема препаратов

-жидкий стул следует собрать однократно, в количестве не менее 2-4 мл (приблизительно объем с чайную ложку)

-Исследование кала на простейшие необходимо проводить 3-х кратно с интервалом в 5-8 дней (если врач не назначил Вам обследование по другой схеме)

Выявление антител к паразитам и оценка адекватности специфического иммунного ответа

Через неделю с момента заражения в сыворотке крови больного выявляются специфические антитела класса IgM, позже выявляются антитела класса Ig G. После выздоровления пациента антитела к антигенам паразитов класса IgG довольно длительное время могут сохраняться. Содержание этих антител постепенно снижается в течение 2 -12 месяцев после гибели паразитов.

Преимущества диагностики паразитозов с помощью метода ИФА:

Возможность ранней диагностики инвазии

Короткий срок получения результатов

Относительно невысокая стоимость

Выявление антител к паразитам и оценка адекватности специфического иммунного ответа

Антител к антигенам лямблий- Ig M, суммарные

Антител к антигенам паразитов:

Как подготовиться к исследованию крови на выявление антител к паразитам

Кровь для анализа сдается из вены натощак.

За 10 часов до исследования необходимо исключить употребление алкоголя

Лекарства искажают результаты исследований. Пациент должен сообщить специалисту о постоянном приеме каких-либо медикаментов.

Результаты исследования выдают в регистратуре поликлиники

Гельминтоовоскопия объединяет группу методов исследования, с помощью которых выявляют яйца возбудителей гельминтозов.

Предложено много методов овоскопии. Но не все они заслуживают практического внимания: одни сложны по технике выполнения, при исследовании другими требуется значительное время, третьи малоэффективны. В данной работе мы приведем только те методы, которые заслуживают практического внимания.

Удельный вес яиц тяжелее обычной воды, вследствие этого яйца гельминтов, как более тяжелые частички, вымываются из фекалий водой и оседают на дно сосуда с различной скоростью, в зависимости от удельного веса. Быстрее всего оседают яйца более крупного размера.

В растворах же солей высокого удельного веса яйца гельминтов наоборот всплывают (явление флотации) в верхний слой и концентрируются в нем.

На использовании этих физических закономерностей основана технология всех современных методов гельминтоовоскопии, которые подразделяются на три группы:

• 1) методы осаждения (седиментации) яиц гельминтов;
• 2) методы флотации яиц гельминтов;
• 3) комбинированные методы (осаждения и флотации) яиц гельминтов.

Методы осаждения (седиментации). Основаны на принципе осаждения взвешенных в жидкости яиц гельминтов, промывки осадка и исследования его. Эти методы применяются в основном для диагностики тех гельминтозов, возбудители которых выделяют яйца с высоким удельным весом (фасциолез, дикроцелиоз, парамфистоматозы и др.). Методики осаждения менее эффективны и более трудоемки, чем флотации. Это связано со сложностью обнаружения яиц гельминтов в осадке взвеси.

Метод последовательных смывов. Пробу фекалий весом 3-5 г кладут в стакан, вливают небольшое количество воды и размешивают палочкой или пинцетом до получения жидкой кашицеобразной массы, затем добавляют воду порциями до объема 50 мл при постоянном размешивании. После взвесь процеживают через металлическое сито или марлю в другой стакан, в нем отстаивают в течение 5-10 минут. Затем верхний слой жидкости над осадком сливают, а к осадку добавляют новую порцию воды и вновь отстаивают в течение 5-10 минут. Описанная процедура повторяется до тех пор, пока вода не станет прозрачной. Ее в последний раз сливают, а осадок (около 5 мл) разливают на предметные стекла или стекла большего размера (12x19) и микроскопируют.

Эта методика широко применяется в ветеринарных лабораториях для диагностики фасциолеза, дикроцелиоза, парамфистоматоза, эу- ритрематоза и других гельминтозов крупного рогатого скота. Вместе с тем, она трудоемка и по диагностической эффективности значительно уступает специальным флотационным и комбинированным методам гельминтоовоскопии.

Флотационные методы. Все методы флотации основаны на единой физической закономерности, обеспечивающей всплытие яиц гельминтов в насыщенных, растворах солей. Для этого рекомендуются растворы различных солей, но предпочтительнее дешевых и повсеместно доступных.

Отдельные методы флотации называются по именам авторов, впервые предложивших ту или иную соль для приготовления флотационной жидкости.

Метод Фюллеборна. Для этой методики нужен насыщенный раствор поваренной соли, который готовят путем кипячения 400-420 г соли на 1 л воды.

Пробу фекалий весом 3-5 г помещают в стакан, заливают небольшим количеством флотационной жидкости, тщательно размешивают, затем добавляют 50-100 мл этого раствора и процеживают через металлическое сито или марлю в один слой в сухой, чистый стакан. Взвесь отстаивают 40-60 минут, затем прикосновением петли снимают поверхностную пленку, переносят ее на предметное стекло для микроскопирования.

Этот метод в лабораторной практике может применяться для диагностики неоаскариоза, стронгилятозов стронгилоидоза, мониезиоза и тизаниезиоза крупного рогатого скота.

Следует отметить, что удельный вес неоплодотворенных и оплодотворенных яиц разный.

Плотность насыщенного раствора поваренной соли невысокая - 1,18-1,20, а, например, удельный вес яиц трихоцефалюса равен 1,16- 1,22. В данном случае насыщенный раствор поваренной соли способен флотировать только часть яиц гельминтов, по этой причине диагностическая эффективность данной методики невысокая. Кроме того, раствор на предметном стекле быстро кристаллизуется.

Метод Котельникова-Хренова с аммиачной селитрой. Технология этого метода такая же, как и метода Фюллеборна, но в качестве флотационной жидкости применяется нитрат аммония (техническая гранулированная аммиачная селитра), используемый для удобрений. При приготовлении флотационной жидкости в 1 литре кипящей воды растворяют 1,5 кг селитры. Плотность раствора - 1,32. Поверхностную пленку можно микроскопировать через 10 минут.

Данная методика обладает высокой диагностической эффективностью. Кроме того, гранулированная аммиачная селитра, применяемая для флотационного раствора - общедоступная дешевая соль и производится в огромном количестве как минеральное удобрение.

В лабораторной практике эта методика широко применяется для выявления яиц неоаскарисов, стронгилят пищеварительного тракта, трихоцефалюсов, авителлин крупного рогатого скота.

Недостатком этого метода является то, что флотационная жидкость из аммиачной селитры не способна поднять тяжелые яйца трематод (фасциол, парамфистом и др.), так как удельный вес этих яиц больше чем 1,3. Кроме того, раствор быстро кристаллизуется.

Метод Котельникова-Хренова с нитратом свинца. Техника проведения этого метода аналогична методу Фюллеборна. В качестве флотационной жидкости при этом используется насыщенный раствор нитрата свинца из расчета 0,65 кг на 1 л воды. Плотность этой жидкости достигает 1,5. Применение такого флотационного раствора дает возможность диагностировать широкий круг возбудителей гельмин- тозов. С его помощью легко выявляются и тяжелые яйла фасциол (удельный вес 1,31-1,35), парамфистомат (1,33-1,38), дикроцелиумов (1,3) и тем более яйца с меньшим удельным весом, к которым относятся яйца аскаридат, стронгилят, трихоцефалят, стронгилоидесов, аноплоцефалят (мониезий), а также капсулы тизаниезий.

Недостатком данной методики является дороговизна нитрата свинца. Вместе с тем, при работе данным препаратом петли покрываются белым налетом, (нитрат свинца входит в химическую реакцию с металлами), яйца трематод сильно деформируются, что создает определенные трудности при исследовании. Кроме того, используемый препарат соль тяжелого металла - свинца, который является высокоядовитым веществом, что создает опасность для здоровья исследователей и окружающих, отработанные растворы данного препарата запрещено сливать в канализационные стоки. По совокупности этих причин, указанная методика не нашла широкого применения в практике.

Кроме того, в качестве флотационных жидкостей авторами были предложены насыщенные растворы из следующих солей: нитрата натрия - 1 кг препарата на 1 л воды, р - 1,38 (метод Калантаряна), тиосульфата натрия - 1,75 кг препарата на 1 л воды, р - 1,40 (метод Болховитинова), карбоната калия - 0,6 кг на 1 л воды,/? - 1,41 (метод Вольфа). Однако все эти методы по тем или иным причинам также не нашли широкого применения в практике.

Комбинированные методы. Эти методы основаны на комбинации совершенно противоположных приемов обработки проб фекалий, то есть седиментации и флотации. Поэтому их называют седимента- ционно-флотационными или, наоборот, флотационно-седиментацион- ными методами.

Несмотря на усложнение приемов обработки проб, эти методы являются более эффективными, на исследования расходуется значительно меньше флотационной жидкости, следовательно, они более экономичны.

Благодаря комбинации противоположных приемов достигается обогащение осадка и поверхностной пленки яйцами гельминтов и удаление излишних посторонних частиц взвеси, которые мешают микроскопированию. Применение двойного центрифугирования взвеси - вначале с водой, а затем с флотационным раствором способствует в первом случае быстрому осаждению яиц в результате воздействия центростремительной силы, а во втором - всплыванию их за счет воздействия центробежной силы.

Впервые комбинированный метод гельминтоовоскопии был предложен американским паразитологом Дарлингом (1911). В последующем на основе этого метода были разработаны различные методики и модификации.

Метод Дарлинга. Пробу фекалий весом 3-5 г помещают в химический стаканчик и тщательно размешивают с 18-20 мл воды, процеживают через сито в другой стаканчик. Полученную жидкость переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 1-2 мин при 3000 об/мин. Затем надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют флотационную жидкость, состоящую из равных частей глицерина и насыщенного раствора хлорида натрия. Плотность такой жидкости равна 1,205 при 18°С. Содержимое взбалтывают и вновь центрифугируют в том же режиме, при этом яйца всплывают, их снимают проволочной петлей с поверхностной пленки и микро- скопируют на предметном стекле.

Этот метод применяют для диагностики нематодозов у животных.

Метод Щербовича. В качестве флотационных жидкостей автором предложены три раствора из насыщенных солей: нитрата натрия, сульфата магния и тиосульфата натрия.

Пробу фекалий величиной с грецкий орех кладут в стакан, добавляют 40-60 мл воды и тщательно размешивают до появления равномерной взвеси. При постоянном помешивании взвесь процеживают через металлическое сито или марлю в чистый стакан. После 5- минутного отстаивания надосадочную жидкость сливают. На дне оставляют такое количество взвеси, которое бы вместилось в центрифужную пробирку, и центрифугируют 1-2 минпри 3000 об/мин, после чего всю жидкость до осадка сливают, а к осадку добавляют флотационный раствор нужной плотности. Осадок взбалтывают до получения взвеси и снова центрифугируют 1-2 мин при 1500 об/мин. После этого петлей снимают пленку с жидкости, переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Насыщенные растворы тиосульфата натрия (1,75 кг Na2S₂03 на 1 л воды, р = 1,40); нитрата натрия (1 кг NaN03 на 1 л воды, р - 1,38) и сульфата магния (0,92 кг MgS04 на 1 л воды, р = 1,28) рекомендуются для диагностики трихоцефалеза, неоаскариоза и стронгилятозов пищеварительного тракта крупного рогатого скота.

Недостатком этого метода со всеми тремя флотационными жидкостями является то, что с его помощью не удается диагностировать тяжелые яйца трематод.

Метод Котельникова и Вареничева. В качестве флотационной жидкости в этой методике применяют насыщенный раствор хлорида цинка (2 кг ZnCl₂ на 1 л воды) с плотностью 1,82. Техника проведения этого метода аналогична как при методе Щербовича.

Метод Котельникова и Вареничева предложен для диагностики нематод, цестод и трематод у животных.

Недостатком этого метода является то, что из-за большого удельного веса флотационной жидкости (1,82), вместе с яйцами гельминтов поднимаются на поверхность после центрифугирования и не переваренные частицы корма, что затрудняет просмотр материала и в конечном итоге влияет на диагностическую эффективность этой методики.

Разработано также много других модификаций комбинированного метода гельминтоовоскопии. В качестве флотационной жидкости предложены насыщенные растворы из следующих солей: нитрата аммония - 1,5 кг NH4NO3 на 1 л воды, р = 1,30 (метод Котельникова и Хренова); углекислого калия - 0,6 кг К2СО3 на 1 л воды, р = 1,41 (метод Вольфа); сульфата цинка - 0,45 кг ZnSC>4 на 1 л воды, р = 1,39 (метод Вишняускаса). Другие растворы малоэффективны при трема- тодозах. По этой причине они также не нашли широкого применения на практике.

Модифицированный метод (Латыпов Д.Г., Лутфуллин М.Х., Горшкова Г.Г.). На кафедре паразитологии КГАВМ разработана новая модификация комбинированного метода гельминтоовоскопии. Техника проведения ее аналогична методу Щербовича. В качестве флотационной жидкости применяется смесь из трех ингредиентов — насыщенных солей хлорида цинка, хлорида натрия и сахара.

Вначале готовят отдельно базовые насыщенные растворы из указанных солей: 1 - насыщенный раствор хлорида цинка (2 кг ZnCh на 1 л воды, р = 1,82); 2 - насыщенный раствор хлорида натрия (0,42 кг NaCl на 1 л воды,/? = 1,19); 3 - сахара (1,67 кг С12Н22О11 на 1 л воды, р = 1,28). Для получения комбинированной флотационной жидкости смешивают эти растворы в соотношении 2:1:1. Плотность такого раствора составляет 1,53.

Модифицированный комбинированный гельминтоовоскопиче- ский метод КГАВМ является универсальным и позволяет диагностировать одновременно яйца нематод, цестод и трематод.

Экспресс-метод групповой гельминтоовоскопии животных (Латыпов Д.Г., Горшкова Г.Г.). Этот метод позволяет быстро определять паразитологическую ситуацию в стадах. Эта методика удобна также при контроле диагностической эффективности дегельминтиза-ции, особенно когда у животных встречаются ассоциативны е формы инвазии.

С каждой пробы фекалий (от 2 до 100 проб) с помощью пинцета отбирают примерно 1 г фекалий в стакан или банку емкостью 0,5 л. Затем взятые пробы заливают небольшим количеством воды и тщательно размешивают пинцетом или палочкой, после при постоянном помешивании добавляют воду порциями до объема 0,5 л. Взвесь фильтруют через металлическое сито с размером ячеек 0,5x0,5 в другой стакан или банку емкостью 0,75 л. Оставшийся на сите осадок промывают водой (200-250 мл). После взвесь снова фильтруют через сито с размером ячеек 0,25x0,25 в чистый стакан или банку емкостью 1 л. Оставшийся на сите осадок повторно промывают 200-250 мл воды. Двукратно отфильтрованную взвесь отстаивают в течение 10 мин, надосадочную жидкость осторожно сливают, оставляя над осадком лишь небольшое ее количество. Таким образом, осадок промывают 3- 5 раз. После последнего промывания примерно 50 мл осадка наливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 2 минуты при 1500 об/мин. Затем надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют флотационную смесь из трех ингредиентов (из насыщенных солей хлорида цинка, хлорида натрия и сахара в соотношении 2:1:1). Техника изготовления комбинированной флотационной жидкости аналогично как в модифицированном методе. Осадок взбалтывают до получения взвеси и снова центрифугируют в том же режиме. После центрифугирования пипеткой осторожно доливают флотационный раствор в центрифужные пробирки, чтобы получился выпуклый мениск, и сверху накрывают его предметным стеклом на 5 минут. Затем стекло быстро снимают, чтобы жидкость не стекала, поворачивают соприкоснувшейся стороной кверху и микроскопируют.

Метод с использованием специальной флотационной жидкости (Белова Л.М., Гаврилова Н.А., Пудовкин Д.Н., Токарев А.Н., Кузнецов Ю.Е.). Метод разработан сотрудниками кафедры паразитологии СПбГАВМ. В этом методе используется диагностическая жидкость с многофункциональными возможностями. В состав жидкости входят вода, натрия хлорид, лаурилсульфат натрия, полиэтилен гликоль, бензоат натрия.

Диагностическую жидкость используют следующим образом. Сначала центрифугированием получают осадок кала, который перемешивают с диагностической жидкостью. Затем полученную смесь центрифугируют 4 минуты со скоростью вращения центрифуги 1500 об./мин, что приводит к флотации объектов исследования. Яйца гельминтов всплывают и находятся в верхнем слое пробирки на поверхностной пленке, с которой их снимают копрологической петлей.

Использование диагностической жидкости позволяет подтвердить диагнозы на большинство гельминтозов. Данная жидкость позволяет очищать пробы фекальных масс от сопутствующих артефактов, затрудняющих просмотр препаратов при микроскопии. Компоненты, входящие в состав жидкости, не кристаллизуются. Усиливается эффект четкости объекта при микроскопировании. В состав жидкости входит бензоат натрия, что препятствует развитию бактериальной микрофлоры, поэтому приготовленную жидкость можно хранить более 14 дней.

Флотация кала – копрологический метод, используемый чаще всего. С помощью этого метода проводят полное паразитологическое исследование кала на паразитозы протозойного и гельминтозного характера. Он основан на принципе использования флотационных растворов, у которых более высокая удельная плотность, чем у паразитов. Таким образом, при исследовании образца кала разные стадии биологического цикла паразита всплывают на поверхность содержимого пробирки и концентрируются в поверхностном слое.

Запас флотационного раствора готовится в лаборатории. Для плотоядных рекомендуется использовать в качестве флотационной среды раствор Шеатера – раствор сахара с удельной плотностью 1,15 г/см 3 . Его использование особенно подходит для протозойных возбудителей (ооцисты кокцидий, цисты лямблий и т. п.), потому что он более доступен и в нём не происходит деформации поверхностных структур паразита. В поверхностном слое находят как яйца гельминтов, так и фрагменты ленточных гельминтов, а также можно использовать этот раствор для общего паразитологического исследования.

Раствор Шеатера готовится нагреванием 500 мл воды и 750 г свекольного сахара. Таким образом, получают насыщенный раствор сахара. Приготовленный таким образом раствор можно хранить в холодильнике длительное время. Нужное количество разбавляют водой, хорошо перемешивают и одновременно используют ареометр для достижения необходимой удельной плотности, то есть 1,15 г/см 3 . К приготовленному подобным образом раствору добавляют 0,7 мл фенола на 100 мл раствора для предотвращения роста плесени. Раствор переливают в бутылку и хранят при комнатной температуре или в холодильнике.

Ещё один часто используемый флотационный раствор – раствор Бреза, удельная плотность которого 1,25 – 1,30 г/см 3 . Его использование может способствовать деформации тонких оболочек, особенно у простейших. Поэтому приготовленные образцы исследуют, как можно, быстрее, потому что со временем деформация оболочек увеличивается и делает невозможной правильную постановку диагноза.

Для приготовления раствора Бреза готовят насыщенный раствор сульфата магния, который получают растворением 1 кг MgSO₄ в 1 литре горячей воды и небольшой избыток оставляют выкристаллизовываться на ночь. Насыщенный раствор тиосульфата натрия (Na₂S₂O₃) получают при разведении 2 кг соли в 1 литре горячей воды. Для приготовления собственно флотационного раствора смешивают 3 части насыщенного раствора сульфата магния с тремя частями раствора тиосульфата натрия и 1 частью воды. Можно также использовать другой метод: в 1 литре воды растворяют 725 г MgSO₄, а в 1 литре воды – 1425 г Na₂S₂O₃. Растворы нагревают до кипения и оставляют охладиться. На следующий день растворы фильтруют. После смешивания растворов в соотношении 1:1 разбавляют водой для получения необходимой удельной плотности 1,25 – 1,30 г/см 3 .

Для исследования кала флотационным методом отбирают образец размером с грецкий орех, заливают водой в ступке и растирают до кашицеобразной консистенции. Процеживают через марлю в химический стакан, стараясь максимально отфильтровать примеси. Наливают в центрифужные пробирки, и центрифугируют 2 – 3 минуты при 1500 – 2000 об/мин. Потом сливают надосадочную жидкость и к осадку добавляют выбранный флотационный раствор. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и встряхивают. Центрифугируют ещё раз 2 – 3 минуты при 1500 – 2000 об/мин. Пробирку ставят в штатив на 10 – 15 минут, после чего поверхностный слой аккуратно переносят петлёй на предметное стекло и микроскопируют. При исследовании образец не должен засыхать.

Начинают просматривать под малым увеличением (объектив, увеличивающий в 4 – 10 раз), а потом переводят на среднее увеличение (х 16 – 20). Использование большего увеличения (х 40 – 45) нужно, прежде всего, для диагностики простейших, стадии которых при малом увеличении не заметны. Для точного определения отдельных паразитов необходимо использовать окуляр с линейкой. Можно, правда, составить сравнительную таблицу и ориентироваться по ней, однако всегда есть риск неточной идентификации. Если взять за основу обычное и относительно часто встречающееся яйцо рода Toxocara размером 90 мкм, потом вывести приблизительный размер (например, половину или треть). Однако необходимо также помнить меняющуюся величину объектов при различных увеличениях. Сравнивают только ориентировочно, а при малых увеличениях высока опасность ложной идентификации (например, у кошек надо быть осторожным при диагностике Isosporarivolta и Toxoplasma gondii!).

Гельминтокопроскопия (от греческого слова helmins – червь, kopros – кал, навоз, skopeo – смотрю) – совокупность методов взятия, обработки и исследования проб фекалий животных и человека с целью обнаружения в них яиц, личинок гельминтов или же самих паразитов, их фрагментов (членики, отрезки) и постановки диагноза.

Методы исследования направленные на отыскание самих паразитов и их отдельных фрагментов называется гельминтоскопией. Яйца гельминтов обнаруживают гельминтоовоскопическими, а личинок гельминтоларвосколическими методами

1. Порядок взятия и доставки материала для исследований

Фекалии у животных берут либо из прямой кишки, либо с земли (или пола) в зависимости от вида гельминта в количестве 4-10 г. При взятии их из прямой кишки на руки надевают тонкие резиновые перчатки или напальчники. При исследовании на кишечные стронгилятозы и легочные гельминты (особенно при диктиокаулезе) фекалии нужно брать только из прямой кишки во избежание загрязнения исследуемого материала личинками свободно живущих гельминтов. Допустимо отбирать пробы с пола, когда исследования проводят на заболевания, при которых го яиц не выходят личинки (фасциолез, дикроцелиоз, мониезиозы, аскаридиозы и т.д.).

У крупного рогатого скота, лошадей, собак фекалии берут индивидуально, указывая кличку и номер животного. У свиней, овец, оленей, кроликов и пушных зверей не всегда удается индивидуальное взятие проб, у этих животных фекалии чаще берут групповым методом, при этом указывают группу, отару, № станка и клетки.

Исследуют не менее 10% животных отары, фермы, хозяйства. Доставляют пробы фекалии в стеклянной, пластмассовой таре, целлофановых мешочках или пергаментной бумаге с обязательной описью проб в сопроводительном документе. При этом указывают, хозяйство, отделение, бригаду, участок, ферму, вид животного, их возраст, на какие гельминты исследовать, дату взятия и направления материала. Клички, номера животных, станка, клетки должны соответствовать номеру пробы фекалий на упаковке.

2. Методы гельминтоскопии

Гельминтоскопию применяют для обнаружения в исследуемом материале половозрелых и юных гельминтов или их фрагментов. Гельминты нередко отходят сами. А у цестод некоторых групп систематически отторгаются членики и фрагменты (отрезки) стробилы с яйцами и выделяются наружу. Исследуя фекалии животных невооруженным глазом можно заметить гельминтов или их фрагменты и членики, а иногда приходится использовать специальные методы исследования.

Особое значение гельминтоскопия имеет при цестодозах, а также при диагностической дегельминтизации.

С целью обнаружения члеников имагинальных цестод осматривают свежие фекалии. У овец, северных оленей, телят, лошадей члеников цестод нетрудно заметить при обычном осмотре. В фекалиях ягнят и овец рано утром или после дневного отдыха находят членики мониезий, тизакиезий, аветеллин и стилезий. У плотоядных животных членики цестод из отряда тениата способны активно передвигаться во внешней среде. Поэтому необходимо осматривать свежие фекалии.

Весьма характерны по форме членики огуречного цепня ( Dipylidium caninum ) паразитирующий у собак, лисиц, песцов, енотовидных собак, кошек и других плотоядных, а также у человека. Членики этого паразита внешне напоминают огуречные семена, их легко заметить в фекалиях, выделенных инвазированными животными.

Из специальных методов гельминтоскопии практически прост и приемлем метод последовательного промывания.

2.1. Метод последовательного промывания

При проведения этого метода собирают свежие порции фекалий от животных, их кладут в сосуд, заливают водой в соотношении 1:5 и 1:10, тщательно перемешивают. Взвесь оставляют на 5 мин. для осаждения. Затем верхний слой сливают до осадка, после чего снова заливают водой и повторяют эти операции до тех пор, пока жидкость над осадком не будет прозрачной. После надосадочную жидкость сливают последний раз, а осадок помещают в кювет или чашку Петри для исследования под лупой. Так как одни гельминты хорошо видны на белом фоне, а другие на черном, то для более полной выборки гельминтов чашку Петри ставят то на белую, то на черную бумагу. Гельминты выбирают препаровальной иглой или кисточкой, а затем микроскопируют для установления вида, при этом пользуются ручной, а также штативной лупой или стереоскопическим микроскопом.

2.2. Метод отсеивания

При этом методе используют набор из 2 – 4 металлических сит с отверстиями убывающего диаметра. Струей воды промывают фекалии, при этом частицы фекалий уносятся водой, а гельминты в зависимости 6 v величины задерживаются на разных ситах. Затем гельминтов выбирают и исследуют. Этим методом можно собрать гельминтов разной величины

3. Методы гельминтоовоскопии

Гельминтоовоскопия (от латинского ovum – яйцо, греческого skopeo – смотрю) объединяет группу методов исследования, с помощью которых выявляют яйца возбудителей гельминтозов.

Предложено много методов овоскопии. Но не все они заслуживают практического внимания: одни сложны по технике выполнения, при исследовании другими требуется значительное время, третьи малоэффективны. В данной работе мы приведем только те методы, которые заслуживают практического внимания.

Удельный вес яиц тяжелее обычной воды, вследствие этого яйца гельминтов, как более тяжелые частички вымываются из фекалий водой и оседают на дно сосуда с различной скоростью, в зависимости от удельного веса, Быстрее всего оседают яйца более крупного размера.

В растворах же солей высокого удельного веса яйца гельминтов наоборот всплывают (явление флотации) в верхний слой и концентрируются в нем.

На использовании этих физических закономерностей основала технология всех современных методов гельминтоовоскопии, которые подразделяются на три группы:

а) Методы осаждения (седиментации) яиц гельминтов;

б) Методы флотации яиц гельминтов;

в) Комбинированные методы (осаждения и флотации) яиц гельминтов.

3.1. Методы осаждения (седиментации)

Основаны на принципе осаждения взвешенных в жидкости яиц гельминтов, промывки осадка и исследования его. Эти методы применяются в основном для диагностики тех гельминтозов, возбудители которых выделяют яйца с высоким удельным весом (фасциолез, дикроцелиоз, парамфистоматоз, описторхоз и др.). Методики осаждения менее эффективны и более трудоемки, чем флотации. Это связано со сложностью отыскания яиц гельминтов в осадке взвеси.

3.1.1 . Метод последовательных смывов

Пробу фекалий весом 3-5 г кладут в стакан, вливают небольшое количество воды и размешивают палочкой или пинцетом до получения жидкой кашицеобразной массы, затем добавляют воду порциями до объема 50 мл при постоянном размешивании; После взвесь процеживают через металлическое сито или марлю в другой стакан, в нем отстаивают в течение 5-10 мин. Затем верхний слой жидкости над осадком сливают, а к осадку добавляют новую порцию воды и вновь отстаивают в течение 5 – 10 мин. Описанная процедура повторяется до тех-пор, пока вода не станет прозрачной. Ее в последний раз сливают, а осадок (около 5 мл) разливают на предметные стекла или стекла большего размера (12×19) и микроскопирутот.

Эта методика широко применяется в ветеринарных лабораториях для диагностики фасциолеза, дикроцелиоза, парамфистоматоза, эуриггрематоза и других гельминтозов жвачных. Вместе с тем, она трудоемка и по диагностической эффективности значительно уступает специальным флотационным и комбинированным методам гельминтоовоскопии.

3.1.2. Метод Горшкова.

Этот метод предложен ял я диагностики драйшеоза и габромематоза лошадей. Основан на принципе осаждения и концентрации яиц 150-30° г фекалий помещают на металлическом сите или марле в большую воронку с верхним диаметром 15-20 см. Предварительно на нижний конец воронки надевают резиновую трубку длиной 10-15 см с зажимом на конце. Воронку укрепляют в штативе. Фекалии разрыхляют, заливают доверху теплой водой (38 – 39°С) и выдерживают 4-24 часа. Затем зажим осторожно открывают, и жидкость выпускают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 1500 об/мин, в течение 3-х мин. Верхний слой жидкости сливают, а осадок наносят на предметное стекло и микроскопируют.

3.1.3. Метод соскоба с перианальных складок

Эту методику применяют для диагностики оксиуроза лошадей и пассалуроза кроликов. Из деревянной палочки или щепочки делают лопаточки (можно и спички), смачивают смесью глицерина с водой (1:1) и делают соскоб с перианальных складок с внутренней стороны хвоста в области промежности. Соскоб переносят на предметное стекло с указанной смесью, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом.

3.2. Флотационные методы

Все методы флотации (от англ. Flotation — всплывание) основаны на единой физической закономерности, обеспечивающей всплытие яиц гельминтов в насыщенных, растворах солей. Для этого рекомендуются растворы различных солей, но предпочтительнее дешевых и повсеместно доступных.

Отдельные методы флотации называются по именам авторов, впервые предложивших ту или иную соль для приготовления флотационной жидкости.

3.2.1. Метод Фюллёборна

Для этой методики нужен насыщенный раствор поваренной соли, который готовят путем кипячения 400-420 г соли на 1 л воды.

Пробу фекалий весом 3 – 5 г помещают в стакан, заливают небольшим количеством флотационной жидкости, тщательно размешивают, затем добавляют 50-100 мл этого раствора и процеживают через металлическое сито или марлю в один спой в сухой, чистый стакан. Взвесь отстаивают 40-60 мин., затем прикосновением петли снимают поверхностную пленку, переносят ее на предметное стекло для микроскопирования.

Этот метод в отечественной лабораторной практике может применяться для диагностики аскаридоза, стронгилятозов и стронгилоидоза свиней, неоаскаридоза, стронгилятозов стронгилоидозов, мониезиоза,. тизанизиоза, жвачных, параскаридоза, стронгилятозов кишечника лошадей

Плотность насыщенного раствора поваренной соли невысокая — 1,18-1,20. Тогда как удельный вес яиц аскариса равен 1,10-1,14 : а у неоплодотворенных яиц — 1,26, а трихоцефалюса — 1,16-1,22. Поэтому насыщенный раствор поваренной соли способен флотировать только масть яиц аскарид и трихоцефалюсов, по этой причине диагностическая эффективность данной методики невысокая. Кроме того, раствор на предметном стекле быстро кристаллизуется.

3.2.2. Метод Котельникона-Хренова с аммиачной селитрой

Технология этого метода такая же, как и метода Фюллёборна, но в качестве флотационной жидкости применяется нитрат аммония (техническая гранулированная аммиачная селитра) используемый для удобрений. При приготовлении флотационной жидкости на 1 л кипящей воды растворяют 1,5 кг селитры. Плотность раствора — 1,32. Поверхностную пленку можно микроскопировать через 10 мин.

Данная методика обладает высокой диагностической эффективностью. Кроме того, гранулированная аммиачная селитра, применяемая для флотационного раствора — общедоступная дешевая соль и производится в огромном количестве как минеральное удобрение.

В лабораторной практике эта методика широко применяется для выявления яиц аскаридоза, трихоцефалеза, эзофагостомоза и метастронгилеза свиней, неоаскарндоза, стронгилятозов пищеварительного тракта, трихоцефалеза, авителлиноза жвачных, параскаридоза и стронгилятозов лошадей, токсокароза и токсаскаридоза собак, кошек, песцов, лисиц и других плотоядных, стронгилоидоза животных разных видов, аскаридиоза и гетеракидоза кур.

Недостатком этого метода является то, что флотационная жидкость из аммиачной селитры не способна поднять тяжелые яйца трематод (фасциол, парамфистом, описторхисов и др.), т.к. удельный вес этих яиц больше чем 1,3 и раствор быстро кристаллизуется.

3.2.3. Метод Котельникова-Хренова с нитратом свинца

Техника проведения этого метода аналогична методу Фюллёборна. В качестве флотационной жидкости при этом используется насыщенный раствор нитрата свинца из расчета 0,65 кг на 1 л воды. Плотность этой жидкости достигает 1,5. Применение такого флотационного раствора дает возможность диагностировать широкий круг возбудителей гельминтозов и

с его помощью легко выявляются и тяжелые яйла фасциол (удельный вес 1,31-1,35), парамфистоматат (1,33-1,38), дикроцелиумов (1,3) и еще быстрее яйца с меньшим удельным весом, аскаридат, стронгилят, метастронгилюсов, трихоцефалят, стронгилоидесов, аноплоцефаяят (мониезий), тениат, скребней (макраканторинхусов), а также капсулы тизаниезий.

Недостатком данной методики является дороговизна нитрата свинца. Вместе с тем, при работе данным препаратом петли покрываются белым налетом, (нитрат свинца входит в химическую реакцию с металлами), яйца трематод сильно деформируются, что создает определенные трудности при исследовании. Кроме того, используемый препарат соль тяжелого металла — свинца, который является высокоядовитым веществом, что создает опасность для здоровья исследователей и окружающих, отработанные растворы данного препарата запрещено сливать в канализационные стоки. По совокупности этих причин, указанная методика не нашла широкого применения в практике.

Кроме того, в качестве флотационных жидкостей авторами были предложены насыщенные растворы из следующих солей: нитрата натрия — 1 кг препарата на 1 л воды, р — 1,38 (метод Калантаряна), тиосульфата натрия — 1,75 кг препарата на 1 л воды, р — 1,40 (метод Болховитинова), карбоната калия — 0,6 кг на 1 л воды, р — 1,41 (метод Вольфа). Однако все эти методы по тем или иным причинам также не нашли широкого применения в практике.