Тинидазол или метронидазол что лучше при трихомонаде

В.М. Kрасовский
Институт урологии АМН Украины (Kиев)

Изучена сравнительная эффективность использования препаратов Метронидазола, Тинидазола, Ниморазола, Тенонитрозола, Орнидазола в лечении 126 больных урогенитальным трихомониазом. Эффективность Метронидазола составила 40,4%, Тинидазола – 44,1%, Ниморазола – 85,7%, Тенонитрозола – 89,7%, Орнидазола – 93,3%, Орнидазола + Тенонитрозола – 97,7%. Препараты отличаются различной переносимостью и количеством побочных эффектов: Метронидазол – 23,3%, Тинидазол – 25%, Нимора-зол – 12,5%, Тенонитрозол – 12%, Орнидазол – 9,1%, Орнидазол + Тенонитрозол – 9,1%. Лучшие результаты получены в группах пациентов, которые получали: Орнидазол (93,3%), Тенонитрозол (89,7%), а также комбинация их последовательного применения Орнидазол + Тенонитрозол (97,7%). Результаты исследования можно использовать в клинической практике.

Kлючевые слова: хронический урогенитальный трихомониаз, лечение, Метронидазол, Тинидазол, Ниморазол, Тенонитрозол, Орнидазол.

The comparative is studied efficiency of the use of preparations of Metronidazolum, Tinidazolum, Nimorazolum, Tenonitrazolum, Ornidazolum in treatment of patients with chronic urogenital trichmoniasis for 126 patients. Efficiency of Metronidazolum was 40,4%, Tinidazolum – 44,1%, Nimorazolum - 85,7%, Tenonitrazolum - 89,7%, Ornidazolum - 93,3%, Ornidazolum + Tenonitrazolum - 97,7%. Preparations differ different bearableness and amount of side effects: Metronidazolum - 23,3%, Tinidazolum - 25%, Nimorazolum - 12,5%, Tenonitrazolum - 12%, Ornidazolum - 9,1%, Ornidazolum + Tenonitrazolum - 9,1%. The best results are got in groups which got: Ornidazolum (93,3%), Tenonitrazolum (89,7%), and also combi nation of their successive application of Ornidazolum + Tenonitrazolum (97,7%). Research results can be recommended for the use in clinical practice.

Keywords: chronic urogenital trichmoniasis, treatment, Metronidazolum, Tinidazolum, Nimorazolum, Tenonitrazolum, Ornidazolum.

В последние десятилетия трихомониаз получил широкое распространение. Чаще всего это заболевание диагностируют у мужчин и женщин молодого возраста – от 16 до 35 лет, из которых большой процент больных составляют лица с другими венерическими заболеваниями и те, кто часто меняют половых партнеров [1, 34].

Заражение трихомониазом происходит в основном половым путем, бытовым путем (плавая в бассейне или реке, в душе, в сауне) заразиться практически невозможно. Однако в сперме, моче и воде возбудитель остается жизнеспособным в течение 24 ч. У больных или у тех, кто перенес эту инфекцию, вырабатываются сывороточные и секреторные антитела, которые указывают на возбудителя, но иммунитет в отношении трихомонадной инфекции не развивается [1–5, 8, 11].

К главным особенностям заболевания следует отнести то, что возбудитель очень легко передается человеку, имевшему половую связь с инфицированным; наличие на поверхности микроорганизмов гиалуронидазы, каталазы, амилазы; способность повторять рельеф эпителиальной клетки и проникать в клетку хозяина; способность защититься от разрушительного действия организма с помощью фиксации на своей поверхности антитрипсина; наличие прямой зависимости вирулентности урогенитальных трихомонад от их гемолитической активности; способность прикрепляться к лейкоцитам, эритроцитам, эпителиальным клеткам за счет гликопротеида.

Выделяют несколько форм трихомониаза: свежая острая, подострая, торпидная; хроническая; трихомонадоносительство. Хроническая форма заболевания характеризуется малосимптомным течением, когда с момента заражения прошло более 2 мес. Периодические обострения могут быть спровоцированы снижением сопротивляемости организма, чрезмерным употреблением алкоголя, изменением рН содержимого мочеиспускательного канала. Трихомонадоносительство – форма заболевания, при которой отсутствуют какие-либо симптомы [2, 4, 5–10, 13].

Трихомониаз – многоочаговое заболевание. По данным Всемирной организации здравоохранения (1995), только у 10,5% больных трихомониаз протекает как моноинфекция, в 89,5% случаев выявляются смешанные трихомонадные инфекции в различных комбинациях: с микоплазмами – 47,3%; с гонококками – 29,1%; с гарднереллой – 31,4%; с уреаплазмой – 20,9%; с хламидиями – 20%; с грибами – 15%.

Диагностика трихомониаза осуществляется на основании клинических признаков и результатов лабораторных исследований. Для получения более точного результата используют сразу несколько методов, а материал для изучения берут из различных очагов воспаления. Применяют следующие лабораторные методы: латекс-агглютинация (используют для выявления трихомонадоносительства); культуральные (используют для диагностики атипичных форм); иммунологические; микроскопия нативного препарата (позволяет по грушевидной или овальной форме, а также характерным движениям микроорганизма определить наличие трихомонады); микроскопия окрашенного препарата (дает возможность проводить исследования, когда материал взят достаточно давно); люминесцентная микроскопия (основан на свечении микроорганизма в ультрафиолетовых лучах). Самый точный и современный метод – ДНK (ПЦР)-диагностика. Для ее проведения из биологического материала извлекают генетически уникальный кусочек ДНK микроорганизма. Все возможные ошибки данного метода составляют 5%. Этот метод отличается не только точностью, но и скоростью выполнения (1–2 дня) [2, 3, 5, 8–10, 12].

Лечение трихомониаза назначают обязательно после осмотра и лабораторного обследования с учетом количества очагов инфекции, тяжести заболевания и индивидуальных особенностей пациента. Кроме того, лечение трихомониаза по требованиям ВОЗ проводят всем половым партнерам, если у одного из них обнаружена инфекция (трихомонада). Особенностью заболевания является наличие множества очагов инфекции. Учитывая этот факт, больным назначают комплексную терапию, включающую: прротивопротозойные препараты; антибактериальные препараты; местное лечение; этиотропные методы; витамины; биостимуляторы; иммунокоррегирующие методы; симптоматическое лечение; гепатопротекторы; противогрибковые препараты. На фоне лечения половая жизнь и прием алкоголя не рекомендуются [2, 6–10,12, 13]. Выбор тактики лечения следует осуществлять индивидуально, с учетом клинико-анамнестических данных.

Лечение острой формы: этиотропная терапия; антибактериальные препараты по индивидуальным показаниям; ферменты, улучшающие пищеварение; витаминотерапия; противотрихомонадные препараты для местного применения в очагах воспаления. По окончании этиотропной терапии рекомендуется провести курс антиоксидантной терапии (перорально и местно) в сочетании с гепатопротекторными средствами.

Лечение хронической формы:

• Подготовительный этап: лекарственные средства, повышающие общий и/или местный иммунитет (по показаниям); витаминотерапия; антиоксиданты; местное лечение очагов поражения.
• Базисная терапия: противотрихомонадные препараты; антибактериальные препараты по показаниям; иммуномодулирующие препараты по показаниям; ферменты, улучшающие пищеварение; протеолитические ферменты; гормонзаместительные препараты (внутрь или местно) по показаниям; антиоксиданты.
• Восстановительная терапия: гепатопротекторы; антиоксиданты — местно; физиотерапевтические процедуры; витаминотерапия.

Первое контрольное обследование у мужчин проводят на 7–10-й день после окончания лечения трихомониаза: пальпаторное обследование предстательной железы и семенных пузырьков, микроскопическое исследование их секрета. Через 1 нед назначают провокацию. Если после провокации трихомонадная инфекция не обнаружена, то на последнее контрольное обследование пациент приходит через 1 мес.

Kритерии излеченности

Различают этиологическое и клиническое выздоровление от трихомониаза. Этиологическое выздоровление: при контрольных обследованиях после курса лечения трихомонады не обнаружены в течение 1–2 мес. у мужчин. Для контрольных обследований применяют культуральные и бактериоскопические лабораторные методы. Kлиническое выздоровление: исчезновение симптомов болезни. Нередко у мужчин после наступления этиологического выздоровления симптомы трихомониаза сохраняются. Посттрихомонадные воспалительные процессы бывают у пациентов с осложненными или хроническими формами болезни [9–13].

Этиотропную терапию трихомониаза проводят несколькими препаратами: это метронидазол, тинидазол, ниморазол, тенонитрозол, орнидазол, секнидазол, флюнидазол, карнидазол. Первых пять препаратов зарегистрированы и их применяют в Украине.

Лекарственная резистентность, ее механизмы и клиническое значение

В последние годы у микроорганизмов все чаще вырабатывается лекарственная резистентность к различными препаратам в связи с неконтролируемым, недостаточно интенсивным или длительным лечением, самолечением. Частота развития резистентности и уровень устойчивости существенно различаются в зависимости от вида микроорганизма, химического состава препарата, эффективности применяемых доз и схем лечения.

Развитие устойчивости связано в первую очередь со снижением активности нитроредуктаз микробной клетки и соответственно со снижением внутриклеточной биотрансформации препаратов. В результате уменьшается образование комплексов с ДНK, снижаются процессы образования свободных радикалов и концентрация цитотоксических продуктов метаболизма. Развитие устойчивости может быть обусловлено также нарушением транспортных систем клетки (снижение проницаемости клеточной стенки у анаэробов и микроаэрофилов и клеточной оболочки у простейших), включая феномен выброса.

Kроме того, главной проблемой в лечении трихомониаза сегодня выступает всевозрастающая резистентность трихомонады к антипротозойным препаратам. Так, согласно исследованиям, проведенным авторами в 1999 г., всего 35% штаммов трихомонад чувствительны к метронидазолу [4]. Согласно другим исследованиям, всего 55% трихомонад чувствительны к тинидазолу [5]. Соответственно изучение изменяющейся чувствительности трихомонад к современным антипротозойным препаратам является актуальной проблемой лечения трихомониаза и микст-инфекций половых путей.

В связи с этим была сделана попытка провести исследование сравнительной эффективности различных противотрихомонадных препаратов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В отделении сексопатологии и андрологии Института урологии АМН Украины изучали клиническую эффективность различных противотрихомонадных препаратов: Метронидазола, Тинидазола, Ниморазола, Тенонитрозола, Орнидазола у больных хроническим урогенитальным трихомониазом. Кроме того, проводили ретроспективный анализ чувствительности влагалищной трихомонады к различным противопротозойным препаратам и оценивали их эффективность и безопасность.

Под наблюдением находились 370 пациентов с хроническим урогенитальным трихомониазом в возрасте от 21 до 48 лет и длительностью заболевания от 3 мес. до 8 лет. Диагноз урогенитального трихомониаза устанавливали на основании общепринятых принципов с выявлением трихомонад, что подтверждено микроскопией окрашенных мазков, исследованием нативного препарата, культуральным методом, а также методом ПЦР.

Все больные были разделены на группы:

1-я группа (52 пациента) получала в качестве противотрихомонадного препарата Метронидазол в стандартной дозе на протяжении 10 дней.
2-я группа (43 пациента) – Тинидазол по 0,5 г 4 раза в день с интервалом 15 мин 2 дня.
3-я группа (49 мужчин) – Орнидазол по 0,5 г 2 раза в день на протяжении 10 дней.
4-я группа (56 мужчин) – Ниморазол по 0,5 г 2 раза в день на протяжении 6 дней.
5-я группа (126 мужчин) – Тенонитрозол по 0,25 г 2 раза в день на протяжении 8 дней.
6-я группа (44 мужчин) – Орнидазол по 0,5 г 2 раза в день на протяжении 10 дней и Тенонитрозол по 0,25 г 2 раза в день на протяжении 8 дней.

С целью коррекции иммунного статуса назначали индуктор интерферона растительного происхождения кагоцел; как гепатопротектор использовали препарат легалон – 140 мг в день стандартных доз на курс лечения. Для получения антибактериального эффекта (ввиду наличия TANK-функции у трихомонады) назначали препарат группы макролидов кларитромицин в дозе по 500 мг 2 раза в сутки на протяжении 10 дней; пациенты также получали симптоматическое и физиотерапевтическое лечение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Таблица 1. Эффективность этиотропной терапии урогенитального трихомониаза различными препаратами

Клиническая группа	Препарат	Количество больных	Клиническое выздоровление (абс. число)	Клиническое выздоровление, %
1-я	Метронидазол	52	21	40,4
2-я	Тинидазол	43	19	44,1
3-я	Орнидазол	49	45	93,3
4-я	Ниморазол	56	48	85,7
5-я	Тенонитрозол	126	113	89,7
6-я	Орнидазол + Тенонитрозол	44	43	97,7

Результаты микроскопии секрета предстательной железы и молекулярно-генетического исследования соскоба слизистой оболочки мочеиспускательного канала мужчин в динамике приведено в табл. 3.

Таблица 3. Результаты микроскопии секрета предстательной железы при этиотропной терапии урогенитального трихомониаза различными препаратами

Клиническая группа	Препарат	Количество больных	Микроскопия секрета ПЖ	ПЦР
1-я	Метронидазол	52	18 (34,6%)	21 (40,4%)
2-я	Тинидазол	43	16 (37,2%)	19 (44,1%)
3-я	Орнидазол	49	44 (89,8)	45 (93,3%)
4-я	Ниморазол	56	44 (78,5%)	48 (85,7%)
5-я	Тенонитрозол	126	121 (88,0%)	113 (89,7%)
6-я	Орнидазол + Тенонитрозол	44	43 (97,7%)	43 (97,7%)

Kак видно из приведенных данных, лучшие результаты получены при использовании метода ПЦР в группах пациентов, которые получали: Орнидазол (93,3%), Тенонитрозол (89,7%), а также их комбинацию последовательного применения Орнидазол + Тенонитрозол (97,7%). Метод микроскопии показал несколько худшие результаты по всем группам пациентов, что обусловлено субъективностью самого метода и свойством мимикрии трихомонады. Но эффективность лечения в тех же группах была выше.

При проведении ретроспективного анализа чувствительности влагалищной трихомонады к различным противопротозойным препаратам оценивали их эффективность. Был проведен анализ культуральных посевов трихомонад с подбором чувствительности к антипротозойным средствам у 243 пациентов, которую определяли по проценту выявления высокой чувствительности к препарату (чистая зона 20 мм и более вокруг диска или отсутствие возбудителя в чашке с препаратом). Высокой чувствительностью обладал препарат в случае наличия этих показателей в более чем 75% культуральных посевах, средний - от 50 до 75%, низкий - менее 50%. Результаты представлены на рис. 1.

Рис 1. Процент высокой чувствительности трихомонады к различным препаратам

Кроме того, нами была оценена эффективность лечения различными препаратами больных, основываясь на полной эрадикации возбудителя, на что указывает молекулярно-генетический метод. Данные приведены на рис. 2.

Рис. 2. Эффективность терапии трихомониаза различными препаратами

При определении количества побочных явлений при использовании различных противопротозойных препаратов выявлены результаты, которые приведены на рис. 3.

Рис. 3. Количество побочных явлений при использовании различных противопротозойных препаратов

ВЫВОДЫ

1. При изучении клинической эффективности различных противотрихомонадных препаратов у больных хроническим урогенитальным трихомониазом выявлено, что эффективность (по критерию эрадикации трихомонады) Метронидазола составила 40,4%, Тинидазола - 44,1%, Ниморазола -85,7%, Тенонитрозола - 89,7%, Орнидазола - 93,3%, Орнидазола + Тенонитрозола - 97,7%.
2. Препараты отличаются различной переносимостью количеством побочных эффектов: Метронидазол - 23,3%, Тинидазол - 25%, Ниморазол - 12,5%, Тенонитрозол - 12%, Орнидазол - 9,1%, Орнидазол + Тенонитрозол - 9,1%.
3. Наиболее высокую чувствительность трихомонады выявили к препаратам Орнидазол (73,6%) и Атрикан (84,4%).
4. Лучшие результаты получены в группах пациентов, которые получали: Орнидазол (93,3%), Тенонитрозол (89,7%), а также комбинация их последовательного применения Орнидазол + Тенонитрозол (97,7%). Результаты исследования можно использовать в клинической практике.

Махлай Н.С., Березина Л.А., Вербов В.Н., Закревская А.В., Жебрун А.Б.

• ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, Санкт-Петербург.

Цель. Разработка тест-системы для определения чувствительности Trichomonas vaginalis к препаратам групп 5-нитроимидазола и 5-нитрофурана.

Материалы и методы. Определение минимальных цидных концентраций (МЦК) противопротозойных препаратов проводили при культивировании лабораторных штаммов Т.vaginalis в лунках планшетов с питательной средой, содержащей различные концентрации этих препаратов. Оценку жизнеспособности возбудителя определяли с помощью витальной окраски трипановым синим и по способности к последующему росту на питательной среде без добавления противопротозойных препаратов. Конструирование тест-системы проводили путем подбора условий для фиксации препаратов в лунках планшетов и контроля сохранения активности после фиксации. Для апробации тест-системы использовали 109 изолятов, выделенных от больных с подтвержденным диагнозом трихомониаз.

Результаты. При культивировании десяти лабораторных штаммов было показано, что МЦК исследуемых препаратов имели следующие значение мкг/мл: метронидазол 5, тинидазол 1,25 мкг/мл, секнидазол 2,5 мкг/мл, ниморазол 1,25 мкг/мл, орнидазол 2,5 мкг/мл, клотримазол 15 мкг/мл, нифуратель 1,25 мкг/мл. При исследовании клинического материала была выявлена однотипная чувствительность штаммов, выделенных при остром трихомониазе, и различная - при хроническом, при этом один штамм обладал множественной устойчивостью.

Заключение. Разработана простая и доступная для рутинной лабораторной работы тест-система для определения чувствительности T.vaginalis к препаратам групп 5-нитроимидазола и 5-нитрофурана. Эффективность теста обеспечивает высокую чувствительность, воспроизводимость и меньшую длительность процедуры по сравнению с классическим методом, что позволяет с наибольшей вероятностью подобрать препарат для терапии. Изучено применение этой тест-системы для определения чувствительности изолятов, выделенных при остром и при хроническом трихомониазе.

Ключевые слова: Trichomonas vaginalis, тест, 5-нитроимидазолы, 5-нитрофураны, чувствительность.

Development and application of a test for sensitivity evaluation of trichomonas vaginalis to nitroimidazoles and nitrofurans

N.S. Makhlay, L.A. Berezina, V.N. Verbov, A.V. Zakrevskaya, A.B. Zhebrun.

• Pasteur Institute of Epidemiology and Microbiology, St.Petersburg, Russia.

Aim. To develop a test for determining the Trichomonas vaginalis sensitivity to 5-nitroimidazole and 5-nitrofuran derivatives.

Materials and methods. Determination of minimal lethal concentrations (MLC) of anti-protozoa drugs was carried out by culturing T.vaginalis strains in wells with medium containing various concentrations of these drugs. The viability evaluation of the pathogen was determined by vital staining with trypan blue and by the ability to subsequent growth in medium without adding drugs. Designing the test was performed by adjusting conditions for drugs fixation in plates wells and control the activity preservation after it. 109 isolates from patients who had been confirmed of having trichomoniasis were used for approbation of the test.

Results. During the cultivation of ten strains T.vaginalis it was shown that MLC of studied drugs were as follows µg/ml: metronidazole 5 µg/ml, tinidazole 1,25 µg/ml, seknidazol 2,5 µg/ml, nimorazol 1,25 µg/ml, ornidazole 2,5 µg/ml, clotrimazole 15 µg/ml and nifuratel 1,25 µg/ml. In the study with clinical samples it was shown similar sensitivity of strains isolated from patients with acute infection and variable sensitivity of strains isolated from patients with chronicle infection. One strain possessed a multiple resistance.

Conclusion. A simple and practical test for routine laboratory work was designed for screening T.vaginalis sensitivity to 5-nitroimidazole and 5-nitrofuran derivatives. The performance of the test provides high sensitivity and reproducibility, less time consuming compared with classic method, making it more suitable for selection therapy. The application of this test for determining the sensitivity of isolates in acute and chronic trichomoniasis was studied.

Key words: Trichomonas vaginalis, test, 5-nitroimidazole, 5-nitrofuran, sensitivity.

Введение

Традиционная специфическая терапия трихомониаза заключается в применении препаратов группы 5-нитроимидазола (5-НИМЗ), обладающих высокой активностью в отношении Protozoa. Все эти препараты имеют нитрогруппу в положении 5-го имидазольного цикла и практически не различаются между собой по степени и спектру антипротозойной активности [1]. Механизм действия этих препаратов основан на их проникновении в клетку путем диффузии, восстановлении нитрогруппы в гидрогеносомах с участием пируват-ферредоксин оксидоредуктазы и образовании свободных нитрит радикалов, которые повреждают цепи ДНК, вызывая гибель простейшего в течение 8 часов. Хотя однотипный механизм действия обуславливает возможность развития перекрестной резистентности трихомонад к 5-НИMЗ, она, тем не менее, является неполной и выявляется относительно редко [6].

Первый представитель этого ряда - метронидазол был синтезирован в 50-х годах прошлого века и уже в 60-х его стали использовать для лечения трихомонадной инфекции [2]. Также широкое применение в медицинской практике получили тинидазол и орнидазол. В значительной степени интерес к этим препаратам связан с их достаточно хорошей переносимостью и хорошими фармакокинетическими свойствами. Например, тинидазол имеет более длительный период полувыведения, чем метронидазол и его концентрация в вагинальных выделениях близка к концентрации в сыворотке, что говорит о лучшей биодоступности тинидазола в этой области. Перекрестная устойчивость тинидазола с метронидазолом является неполной, при этом его минимальная цидная концентрация (МЦК) ниже чем у метронидазола [4].

Орнидазол и секнидазол также имеют по сравнению с метронидазолом более длительный период полувыведения. Ниморазол, напротив, элиминируется быстрее. Тем не менее препарат обладает выраженной антипротозойной активностью, поскольку два его основных метаболита более активны, чем метаболиты метронидазола [3].

Все эти препарата зарегистрированы и разрешены для медицинского применения в России.

Неэффективность терапии урогенитального трихомониаза может быть обусловлена целым рядом факторов, связанных с особенностями как макро, так и микроорганизмов. К числу наиболее частых причин неэффективности лечения большинство авторов относят недостаточно высокую комплаентность пациентов и реинфекцию, хотя в отдельных статьях ведущее место отводится резистентности Т.vaginalis к метронидазолу. Среди других возможных причин неудачного лечения указывают недостаточную абсорбцию препарата в желудочно-кишечном тракте, низкую степень его доставки в урогенитальные органы, инактивацию микрофлорой влагалища, а также низкую концентрацию цинка в плазме крови [1].

Первые случаи резистентности Т.vaginalis к метронидазолу были зарегистрированы в 1962 г [6]. По нашим данным, полученным при тестировании 865 клинических штаммов Т. vaginalis, выделенных в 2006-2009 гг., резистентность к метронидазолу была выявлена у 8,1 % изолятов.

В последние годы актуальна также другая группа этиотропных средств - препараты 5-нитрофурана (5-НИТФ), в частности нифуратель. Нитрофураны в качестве монотерапии обычно используют в тех случаях, когда лечение 5-нитроимидазолами невозможно, например, в случаях имеющейся гиперчувствительности.

В настоящее время назначение лечения производят в соответствии с протоколом ведения больных урогенитальным трихомониазом (утв. МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РФ 14.01.2005). Этот документ не регламентирует проведение предварительного подбора препарата in vitro для каждого штамма. Вероятно, следствием такого подхода является высокая частота случаев неэффективного лечения и хронизации заболевания.

Несмотря на существование проблемы, связанной с подбором наиболее подходящего для каждого пациента препарата, в настоящее время не существует доступной для широкой практики тест-системы, позволяющей определять чувствительность Т.vaginalis к антипротозойным препаратам in vitro.

Для определения чувствительности Т.vaginalis к различным лекарственным средствам используют метод серийных разведений. Суть метода заключается в приготовлении серийных разведений лекарственного средства в жидкой питательной среде (контроль - среда без лекарственного средства). Затем в каждую пробирку со средой вносят одинаковую концентрацию культуры исследуемого штамма Т.vaginalis и после инкубации в течение 48-72 часов микроскопически определяют наличие живых форм возбудителя в каждой пробирке. Этот метод трудоемок и имеет высокую стоимость.

В данной работе представлены результаты разработки и применения тест-системы для определения чувствительности Т.vaginalis к противопротозойным препаратам.

Штаммы Т.vaginalis Pr001, Pr002, Pr004, Pr005, Pr006, Pr007, Pr011, Pr027 были получены из Городского кожно-венерологического диспансера (г. Санкт-Петербург). Перед проведением исследования культуры выращивали на питательной среде для выявления трихомонад - СВТ (№ ФСР 2009/05982) и использовали при достижении логарифмической фазы роста. Микроскопию нативных препаратов проводили при помощи устройства для микробиологических исследований - гребенка (номер заявки 2010124024 от 11.06.2010 г.). Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Было исследовано 109 штаммов Т.vaginalis, выделенных от больных с установленным диагнозом трихомониаз. Диагноз был установлен на основе культурального исследования на питательной среде СВТ, а также ПЦР-РТ с использованием набора фирмы ИнтерЛабСервис (№ ФС 01262006/5190-06) на приборе АНК-32. При этом 10 штаммов (группа А), было выделено от больных с острой формой инфекции и 99 штаммов (группа Б) - от пациентов с хронической формой урогенитального трихомониаза.

Использовали субстанции следующих противопротозойных препаратов: метронидазол, тинидазол, орнидазол, клотримазол производства Sigma-Aldrich (USA) и секнидазол, ниморазол, нифуратель производства Zxchem (China). Для приготовления исходных растворов препаратов с концентрацией 1 мг/мл в качестве растворителя использовали демитилсульфоксид (ДМСО). Рабочие растворы готовили последовательным разведением исходных растворов в питательной среде СВТ.

Разработка тест-системы для определения чувствительности T.vaginalis. С целью создания тест-системы был решен ряд практических задач: при использовании лабораторных штаммов было определено оптимальное время культивирования в лунках планшетов и выбрана посевная доза заражающего материала, что позволило стандартизировать при последующих опытах основные условия проведения анализа. Было установлено, что максимальный прирост биомассы происходит через 48 часов культивирования при посевной дозе заражающего материала 5 х 10 4 кл/мл (рис. 1).

Рисунок 1

Для определения МЦК противопротозойных препаратов проводили культивирование штаммов Т.vaginalis в питательной среде, содержащей различные концентрации этих препаратов. При определении МЦК, под которой понимали наименьшую концентрацию препарата, вызывающую гибель 100% клеток трихомонад, использовали два критерия: оценку жизнеспособности возбудителя по методу витальной окраски трипановым синим и способность штаммов к последующему росту в питательной среде СВТ без добавления противопротозойных препаратов. Одновременно проводили определение МЦК традиционным методом последовательных разведений препаратов в пробирке [5] и были получены идентичные результаты.

Определение МЦК описанных выше препаратов позволило выбрать их рабочие концентрации. МЦК для исследованных препаратов имеют следующие значения: КТЗ - 15 мкг/мл, МТЗ - 5 мкг/мл, СКЗ - 2,5 мкг/мл, ОРЗ - 2,5 мкг/мл, НМЗ - 1,25 мкг/мл, ТНЗ - 1,25 мкг/мл и НФТ - 1,25 мкг/мл.

Для исследования сохранения активности препаратов в выбранных МЦК проводили их фиксацию в лунках полистироловых планшетов в течение 24 часов при температуре 50 °С в вакуумном сушильном шкафу. Сохранение активность высушенных препаратов оценивали при сравнении их способности оказывать цидное действие на штаммы Т.vaginalis до и после фиксации.

На следующем этапе было проведено определение срока хранения стрипов с фиксированными противопротозойными препаратами методом "ускоренного старения". При этом было показано, что срок хранения таких стрипов без потери активности зафиксированных в лунках препаратов составляет 13 месяцев.

Таким образом, в состав разработанной тест-системы для определения чувствительности T.vaginalis к противопротозойным препаратам входят следующие компоненты:

• питательная среда для выявления T.vaginalis;
• стрипы с сорбированными противопротозойными препаратами;
• пленки для заклеивания стрипов;
• гребенки для микроскопии.

Рисунок 2

Схема расположения противопротозойных препаратов и контроля в лунках стрипа и помещения гребенки в лунки стрипа: а - устройство для микроскопии, б - стрип с фиксированными препаратами (К - контроль, НФТ - нифуратель, КТЗ - клотримазол, СКЗ - секнидазол, ОРЗ - орнидазол, НМЗ - ниморазол, ТНЗ - тинидазол. МТЗ - метронидазол).

Апробация тест-системы. Проводили в лаборатории иммунология ФГУН НИИЭМ имени Пастера, где для проведения исследования чувствительности к противопротозойным препаратам первоначально осуществляли накопление выделенных изолятов на питательной среде СВТ до концентрации 10 5 кл/мл. После этого готовили инокулят путем суспензирования осадка в 0,5 мл свежей питательной среды СВТ. Для проведения исследования из набора брали стрипы с фиксированными противопроозойными препаратами и устанавливали их в рамку-держатель. Во все лунки (рис. 2б) вносили прогретую до 37 °С питательную среду СВТ и приготовленный инокулят, который перед внесением перемешивали пипетированием. Стрип заклеивали пленкой и помещали в термостат при температуре 37 °С.

Учет результатов проводили через 48 часов. Для этого содержимое лунок перемешивали при помощи многоканальной пипетки, а затем в лунки стрипа погружали зубцы гребенки (рис. 2а). Первоначально просматривали зубец-контроль на наличие клеток T.vaginalis, затем все остальные зубцы. При отсутствии живых форм T.vaginalis в лунке с препаратом штамм оценивали как чувствительный. При наличии живых форм T.vaginalis в лунке с препаратом штамм оценивали как резистентный.

Таблица 1.

Обозначения: R - резистентный, S - устойчивый.

Полученные результаты представлены в таблице 1. Из всех изолятов группы А только один обладал резистентностью к клотримазолу и ниморазолу. Напротив, значительная часть штаммов группы Б была устойчива к метронидазолу и другим лекарственным средствам, при этом один изолят обладал резистентностью сразу к четырем препаратам.

Разработана тест-система для определения чувствительности T.vaginalis к широкому спектру противопротозойных препаратов. Тест-система основана на простом и доступном для рутинной лабораторной работы методе. Эффективность метода обеспечивает 95 % чувствительности и 99 % воспроизводимости, что позволяет с наибольшей вероятностью подобрать препарат для терапии.

Разработанная тест-система принципиально отличается от существующего способа определения чувствительности тем, что отсутствуют стадии приготовления и разведения препаратов ex tempore, а стадия учета результатов упрощена и ускорена за счет использования витальной окраски и устройства для микроскопических исследований, разработанного нами. Все это позволяет стандартизовать процедуру проведения исследования на всех ее этапах.

Предлагается также использовать эту тест-систему для одновременного выявления T.vaginalis и определения чувствительности к препаратам, т.е. тест-система позволит еще на стадии выявления заболевания проводить подбор препарата лечения без повторного забора материала, поскольку входящая в состав набора среда СВТ позволяет накапливать и сохранять культуру T.vaginalis в течение недели.

Тестирование 109 штаммов показало, что штаммы, изолированные у пациентов с острой формой трихомонадной инфекции, как правило, чувствительны к действию метронидазола и других антипротозойных препаратов, в то время как культуры, выделенные от пациентов с хроническим трихомониазом, обладали резистентностью в 23,1 % (метронидазол) - 71,7 % (ниморазол) случаев. Такое различие свойств может объяснять довольно высокую распространенность трихомониаза среди населения нашей страны и свидетельствует о целесообразности определения чувствительности T.vaginalis к противопротозойным препаратам in vitro.

Работа поддержана грантом молодых ученых ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора.

Контактная информация: Махлай Наталья Сергеевна, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, ФГУН НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадозора, р.т. (812) 232-80-35.