Исследование смывов на листериоз

Устанавливают основные принципы организации контроля и методику проведения лабораторных исследований пищевых продуктов по выявлению в них бактерий Listeria monocytogenes.

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

4.2 . МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Организация контроля и методы
выявления бактерий Listeria monocytogenes
в пищевых продуктах

М етодические указания
МУК 4.2.1122-02

Минздрав России
Москва 2002

Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах: Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002.

1 . Разработаны: Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава России (Л.Г. Подунова, Э.Ф. Опочинский, Н.С. Кривопалова), ГУ Научно-исследовательским институтом питания Российской Академии медицинских наук (В.А. Тутельян, С.А. Шевелева, И.Б. Кунаева, Н.Р. Ефимочкина), Департаментом Госсанэпиднадзора Минздрава России (Н.Н. Иванова), Научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (И.С. Тартаковский, С.А. Ермолаева, Т.С. Карпова), Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии МЗ РФ (Б.Л. Черкасский), Центром Госсанэпиднадзора в г. Москве (Н.Я. Салова, В.П. Голованова), Центром Госсанэпиднадзора в Тульской области (Т.А. Попова), Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности (Ю.Г. Костенко), Координационным микробиологическим центром рыбной промышленности ГИПРОРЫБФЛОТа (Л.Б. Мухина, Е.Ю. Дмитриева), Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии (В.М. Котляров).

2 . Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 22.04.02.

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации – Первый

заместитель Министра здравоохранения

Дата введения: 1 июня 2002 г.

4.2 . МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах

1.1 . Настоящие методические указания устанавливают основные принципы организации контроля и методику проведения лабораторных исследований пищевых продуктов по выявлению в них бактерий Listeria monocytogenes .

Проведение контроля на Listeria monocytogenes позволит получить реальную картину ситуации в Российской Федерации, оценить степень загрязненности пищевой продукции и дать оценку эффективности принимаемых мер в целях обеспечения ее безопасности в плане новых и вновь возникающих возбудителей инфекций с пищевым путем передачи для здоровья и жизни человека.

1.2 . Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющих контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно-эпидемиологических заключений, а также бактериологическую диагностику заболеваний с пищевым путем передачи; в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья; в организациях, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль продовольственного сырья и пищевых продуктов в процессе промышленного производства и выпуска продукции.

1.3 . Методические указания являются обязательными при контроле пищевых продуктов в ходе проведения противоэпидемических мероприятий при возникновении вспышек, а также в порядке осуществления санитарно-эпидемиологического надзора.

1.4 . Организация проведения контроля пищевых продуктов на Listeria monocytogenes .

Лабораторный контроль за отсутствием Listeria monocytogenes в пищевых продуктах, где нормируется этот показатель, проводится:

· в порядке надзора за соблюдением установленных требований в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов в ходе проверок изготовления и оборота пищевой продукции, оказания услуг в сфере торговли и общественного питания;

· при экспертизе продукции и подтверждении соответствия требованиям нормативных документов для целей гигиенической оценки и выдачи санитарно-эпидемиологических заключений;

· при контроле за безопасностью продукции изготовителем (производственный контроль);

· в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании заболеваний.

1.5 . При проведении контроля безопасности по показателю Listeria monocytogenes согласно Положению о государственной санитарно-эпидемиологической службе, утвержденному постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. № 554, должен осуществляться периодический отбор образцов пищевой продукции.

1.5.1 . Порядок контроля и кратность исследований должны устанавливаться в соответствии с методическими и инструктивными документами, утвержденными или согласованными в установленном порядке органами государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, при этом необходимо учитывать специфику производства, степень его эпидзначимости, материально-техническое оснащение и т.п.

Особого внимания должны заслуживать предприятия, вырабатывающие продукты детского питания, детские молочные кухни, пищеблоки детских лечебно-профилактических учреждений, стационаров для онкологических, гематологических больных, домов ребенка, родильных домов, домов престарелых и инвалидов и т.п.

При проведении текущего надзора рекомендуемая минимальная периодичность выборочного лабораторного контроля пищевой продукции массового потребления - 1 раз в квартал; для детского и диетического питания - 2 раза.

1.5.2 . При производственном контроле организация и периодичность лабораторных исследований продукции по показателю Listeria monocytogenes должна устанавливаться изготовителем продукции в соответствии с действующими санитарными правилами и согласовываться с учреждениями государственной санитарно-эпидемиологической службы по месту расположения предприятия-изготовителя.

1.5.3 . Контроль пищевых продуктов по показателю Listeria monocytogenes с целью гигиенической оценки для выдачи санитарно-эпидемиологических заключений и подтверждения соответствия установленным требованиям при проведении экспертизы осуществляется в уполномоченных лабораториях центров Госсанэпиднадзора или других организаций, аккредитованных в установленном порядке.

1.6 . В пищевых продуктах, предназначенных для непосредственного употребления в пищу, в отношении которых отсутствуют микробиологические нормативы или данные о возможности выделения Listeria monocytogenes , контроль Listeria monocytogenes не проводится, однако в случае заболеваний людей и/или нарушений в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов образцы таких продуктов должны быть направлены на лабораторное исследование.

1.7 . Организация лабораторных исследований на Listeria monocytogenes .

Допускается организация лабораторных исследований путем их поэтапного выполнения в лабораториях учреждений госсанэпидслужбы различных уровней. При отсутствии возможности идентификации выделенных культур последние могут быть переданы в лаборатории, располагающие соответствующей материально-технической базой и квалифицированным персоналом, для выдачи окончательного результата.

Методические указания содержат описание метода выявления бактерий Listeria monocytogenes , основанного на высеве определенного количества продукта в жидкие селективные среды, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на агаризованных дифференциально-диагностических средах. Принадлежность выделенных культур к Listeria monocytogenes определяется по биохимическим, морфологическим и другим свойствам.

Метод выявления L . monocytogenes в пищевых продуктах основан на применении специальных селективных и дифференциально-диагностических сред. Селективность сред по отношению к сопутствующей микрофлоре обеспечивается включением в их состав хлорида лития, акрифлавина, циклогексимида, налидиксиновой кислоты, полимиксина или других антибиотиков. Внесение эскулина и цитрата аммония железа позволяет подтверждать наличие листерий по почернению среды за счет гидролиза эскулина в присутствии ионов Fe + . Подтверждающие тесты родовой и видовой идентификации включают окраску по Граму, определение подвижности выделенных на агаризованных средах типичных по физиологическим и морфологическим признакам культур, их способности восстанавливать нитраты до нитритов, сбраживать рамнозу, ксилозу и маннит, способности к гидролизу лецитина на ГРМ-среде с активированным углем, а также определение наличия В-гемолиза на кровяном агаре и дифференциацию L . monocytogenes от других гемолизирующих листерий в САМР-тесте с контрольными штаммами Stafphylocjccus aureus и Rhodococcus equi.

При необходимости для выявления L. monocytogenes в пищевых продуктах проводится постановка реакции нарастания титра фага (РНФ).

3.1. Аппаратура и инструментарий

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений рН ±0,01

Профилактика листериоза - это прежде всего проведение ветеринарно-санитарных и санитарно-гигиенических мероприятий в населенных пунктах, в животноводческих хозяйствах и предприятиях по переработке продуктов животного происхождения. Противоэпидемические мероприятия предусматривают раздельное содержание сырых и готовых к употреблению продуктов, обязательную термическую обработку мясных и молочных блюд, бактериологическое обследование работников пищеблоков, агропромышленных комплексов, мясо-молочных комбинатов.

В прошедшем году в США была зарегистрирована вспышка листериоза, связанная с употреблением дыни. Пострадало более 140 человек. Из них более 50 случаев закончились летально.

В Сахалинской области с 1995 года было зарегистрировано 16 случаев листериоза (Анива, Холмск, Южно-Курильск, Южно-Сахалинск). В 2005 году в Южно-Сахалинске зарегистрировано 8 случаев заболевания этой инфекцией: 4 - среди новорожденных, 2 из них имели летальный исход на 1-2 сутки по­сле родов. В 2010 году зарегистрировано 2 случая заболевания листериозом, один из заболевших - новорожденный.

При проведении лабораторных исследований на листериоз культура Listeria monocytogenes была выделена из речной воды в Анивском районе, из серых крыс в Холмском районе и из смывов с капусты в Южно-Сахалинске.

Так, производственный микробиологический контроль готовой продукции предусматривает исследования:

- 1 раз в месяц - мясо- и птицепродуктов, яичных продуктов готовых; готовой рыбной продукции; сыров мягких и рассольных, сыров твердых внарезку;

- 1 раз в квартал - мясо- и птицепродуктов сырых; рыбопродуктов сырых; молочных продуктов и сыров всех видов (кроме рассольных и мягких);

- 1 раз в 6 месяцев - продукции общественного питания, в том числе пищеблоков лечебно-профилактических учреждений, акушерских стационаров, детских дошкольных учреждений (не менее 30% наименований каждого вида блюд);

- 1 раз в год - продуктов, реализуемых в объектах розничной и оптовой торговли, в том числе складах - (по 1-му образцу от каждой группы, нормируемой по листериям (L.monocytogenes), согласно ассортиментному перечню).

Производственный бактериологический контроль санитарного состояния пищевых объектов осуществляется в порядке и с периодичностью не реже предусмотренной при контроле патогенных микроорганизмов действующими нормативными документами, в том числе:

- от 1 раза в неделю до 1 раза в месяц на пищеблоках акушерских, онкологических, гематологических стационаров, отделений для новорожденных и недоношенных детей,

- от 2 до 1 раза в месяц - в цехах и отделах по производству и перефасовке готовых мясо- и птицепродуктов, яичных продуктов, рыбных продуктов; сыров мягких и рассольных, сыров твердых внарезку, салатов из овощей, икры, масла сливочного,

- 1 раз в месяц - на производстве молочных и молокосодержащих продуктов, жировых продуктов, полуфабрикатов из мяса, птицы, рыбы, овощей.

При выпуске несоответствующей установленным требованиям пищевой продукции и по эпидемическим показаниям осуществляется усиленный контроль санитарного состояния объектов в отношении листерий, кратность которого может быть увеличена в 2 и более раз.

Обо всех случаях выделения листерий при производственном контроле информация немедленно передается в территориальные органы, уполномоченные осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический надзор. Ответственность за своевременную передачу информации несет руководитель предприятия, в продукции которого или в смывах с оборудования обнаружены листерии.

В отношении юридических лиц за неисполнение санитарных требований предусмотрена административная ответственность по ст.6.3 КоАП РФ в виде штрафа до 20 тысяч рублей или приостановки деятельности на срок до 90 суток.

Обозначение:	МУК 4.2.1122-02
Название рус.:	Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах
Статус:	действует
Дата актуализации текста:	05.05.2017
Дата добавления в базу:	01.09.2013
Дата введения в действие:	01.06.2002
Утвержден:	22.04.2002 Главный государственный санитарный врач Российской Федерации
Опубликован:	Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России (2002 г. )
Ссылки для скачивания:

Версия для печати

Версия для MS Word

Эпидемиологический надзор

(c) Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Сахалинской области, 2006-2020 г.

Адрес: 693020, г. Южно-Сахалинск, ул. Чехова, 30-А

1. Разработаны: ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора, при участии ООО "Стай-лаб".

2. Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (от 29 сентября 2006 г.).

3. Утверждены и введены в действие Председателем Лабораторного совета, Главным врачом ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора Верещагиным А.И. 08.12.2006.

4. Введены впервые.

Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль, а также в лабораториях иных организаций, аккредитованных на право проведения испытаний, исследований.

Методические рекомендации могут быть использованы для целей определения бактерий рода Listeria при скрининговых исследованиях пищевых продуктов и смывов.

Бактерии рода Listeria относятся к группе грамположительных подвижных бактерий, широко распространенных в окружающей среде и размножающихся в почве, воде, на растениях, в пищевых продуктах.

Известны семь видов листерий: Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria grayi, Listeria murrayi, Listeria seeligeri и Listeria welshimeri. Эпидемиологическое значение имеют Listeria monocytogenes, Listeria innocua и Listeria ivanovii в связи с наиболее частой контаминацией этими представителями рода Listeria пищевых продуктов.

Поэтому чрезвычайно важна организация скрининга с использованием высокоспецифичных и простых методов определения бактерий рода Listeria. Хотя патогенной для человека является только Listeria monocytogenes, присутствие в пробах любых других листерий может свидетельствовать о контаминации патогенными бактериями.

К иммунохимическому определению бактерий рода Listeria в пищевых продуктах, смывах относится твердофазный иммуноферментный анализ на полистироловых планшетах, покрытых моноклональными антителами к антигену бактерий рода Listeria. Результатом проведения ИФА служит образование комплекса антиген-антитело при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями. Использование твердой фазы позволяет надежно разделять компоненты реакции за счет иммобилизации одного из компонентов, не участвующих в реакции.

Для осуществления реакции данного типа используется тест-система LOCATE(R) Listeria с высокоспецифичными моноклональными антителами к антигенам бактерий рода Listeria. Тест-система LOCATE(R) Listeria спроектирована в формате стрипованного 96-луночного ИФА-планшета, что позволяет выполнять исследования от 1 до 94 образцов одновременно как с визуальной, так и с автоматической оценкой результата (с помощью ридера).

¦ Термостат электрический с диапазоном измерения от ¦ ТУ 64-1-1382-83 ¦

¦ 15 до 65 °С с допустимой погрешностью регулирования ¦ ¦

¦ температуры +/- 1 °С ¦ ¦

¦ Стерилизатор паровой медицинский ¦ ГОСТ 19569 ¦

¦ Шкаф сушильно-стерилизационный, обеспечивающий ¦ ¦

¦ поддержание заданного температурного режима в диапазоне ¦ ¦

¦ от 50 до 200 °С с погрешностью +/- 2 °С ¦ ¦

¦ Гомогенизатор бактериологический перистальтического ¦ ¦

¦ типа Masticator (или Stomacher) со стерильными ¦ ¦

¦ Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 ¦ ТУ 16-535-84 ¦

¦ Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания ¦ ГОСТ 24104 ¦

¦ 200 г и допустимой погрешностью +/- 2 мг ¦ ¦

¦ Холодильник бытовой электрический ¦ ГОСТ 16317 ¦

¦ Пипетки градуированные исполнения 1, 2 классов точности ¦ ГОСТ 29227 ¦

¦ вместимостью 1 куб. см, 10 куб. см ¦ ¦

¦ Пробирки бактериологические вместимостью не менее ¦ ГОСТ 25336 ¦

¦ Посуда широкогорлая ¦ ГОСТ 25336 ¦

¦ Половинный бульон Фразера для обогащения листерий ¦

¦ Компоненты набора тест-системы LOCATE(R) Listeria: ¦ ¦

¦ Микротитровальный стрипованный планшет на 96 лунок, ¦ 1 шт. ¦

¦ покрытых моноклональными антителами на листерии ¦ ¦

¦ Конъюгат, в рабочем разведении ¦ 1 шт. ¦

¦ Положительный контроль (термически дезактивированные ¦ 1 шт. ¦

¦ бактерии рода Listeria), 2 мл ¦ ¦

¦ Отрицательный контроль (термически дезактивированные ¦ 1 шт. ¦

¦ Концентрирующий моющий буфер, 25-кратный, 20 мл ¦ 2 шт. ¦

¦ Субстрат, ТМБ, 15 мл ¦ 1 шт. ¦

¦ Стоп-реагент, содержит 2% раствор серной кислоты, 15 мл ¦ 1 шт. ¦

¦ Схема планировки планшета ¦ 1 шт. ¦

5.1. Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов", ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96), ГОСТ Р 51921-02 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes", МУК 4.2.1122-02 "Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах", а также в соответствии с действующими ГОСТ и НД на конкретные виды продуктов.

5.2. Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и превышать аналитический образец не менее чем в два раза.

5.3. От продукции в мелкой фасовке пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары так, чтобы количество было достаточным для проведения анализа.

5.4. От продукции в транспортной и потребительской таре больших размеров или без упаковки пробы отбирают из разных точек: с поверхности и с различной глубины.

5.5. Пробы для микробиологических анализов отбирают стерильным инструментом в стерильную посуду до взятия проб на физико-химические и органолептические исследования.

5.6. Замороженные продукты предварительно размораживают до температуры внутри продукта 0 - (-1) °С (не менее 1 ч в термостате при температуре 37 °С); продукты, содержащие жиры (сливочное масло, мороженое), нагревают до температуры 40 - 45 °С и перемешивают.

5.7. Отобранные образцы перемешивают и измельчают или доводят до однородной консистенции по ГОСТ 26669-85, из измельченной суспензии составляют навеску массой 25 +/- 0,1 г (50 - 100 г или 50 - 100 куб. см - для продуктов детского, лечебного и специализированного питания).

5.8. Смывы отбирают с помощью стерильных увлажненных тампонов, сделанных из марли или ваты, с поверхности оборудования и инвентаря площадью 100 кв. см, используя трафарет. Трафарет фламбируют перед каждым употреблением.

6.1. Предобогащение: внести 25 г подготовленной пробы в 225 мл бульона предобогащения. Перемешать образец в стомахере, блендере или с помощью другой техники, обеспечивающей достаточно хорошее перемешивание. Инкубировать в течение 24 ч при 30 °С.

6.2. После инкубации перенести по 0,1 мл предобогащенной пробы в 10 мл бульона Фразера. Инкубировать бульоны в течение 24 ч при 30 °С.

6.3. После инкубации перенести по 1 мл в две стеклянные пробирки, одну пробирку проавтоклавировать при 100 °С (допускается использовать водяную баню 80 °С в течение 20 мин. для инактивации живых бактерий). Другую пробирку с бульоном (не термообработанную) поместить в холодильник до конца исследования.

6.4. Охладить пробу до комнатной температуры. Тщательно перемешать бульон после охлаждения и использовать для ИФА.

7.1. Для анализа используется тест-система иммуноферментная LOCATE(R) Listeria производства R-Biopharm Rhone Ltd.

7.2. Приготовление рабочих разведений растворов, входящих в комплект тест-системы:

7.2.1. Подготовить моющий буфер в рабочем разведении: разбавить концентрат моющего буфера в 25 раз дистиллированной водой (смешать 40 мл буфера и 960 мл дистиллированной воды). Отметить дату приготовления на флаконе с буфером. Хранить буфер в холодильнике.

7.2.2. Рабочий раствор конъюгата: конъюгат поставляется в рабочем разведении.

7.2.3. Субстрат (ТМБ) поставляется в рабочем разведении.

7.2.4. Стоп-реагент поставляется в рабочем разведении.

7.2.5. Положительные и отрицательные контроли поставляются в рабочем разведении.

8.1. Извлечь из пакета необходимое количество стрипов, разделить на необходимое количество лунок (по одной лунке на каждую пробу) и 2 лунки для контрольных растворов. Поместить лунки в планшетную рамку и зафиксировать. Немедленно упаковать оставшиеся лунки в пакет вместе с силикагелем.

8.2. Внести по 100 мкл растворов положительного и отрицательного контроля в соответствующие лунки. Внести по 100 мкл исследуемых термообработанных бульонов в соответствующие лунки. Обозначить положение каждой лунки на прилагаемой диаграмме. Инкубировать планшет в темноте при температуре 37 °С 30 мин.

8.3. После инкубации с помощью автоматического вошера или многоканальной автоматической пипетки с переменным объемом внести в каждую лунку по 250 мкл моющего буфера. Повторить процедуру промывания еще 3 раза, после чего промыть лунки 1 раз дистиллированной водой. Перевернуть рамку и тщательно выбить капли дистиллированной воды путем постукивания рамки по столу, накрытой фильтровальной бумагой.

8.4. Внести по 100 мкл конъюгата в каждую лунку (при необходимости использования большого количества лунок использовать 8-канальную автоматическую пипетку). Инкубировать планшет при температуре 37 °С 30 мин.

8.5. По окончании инкубации промыть лунки планшета, как описано в п. 8.3.

8.6. Внести по 100 мкл субстрата в каждую лунку (при необходимости исследования большого количества образцов использовать ванночку для реагентов и 8-канальную пипетку). Чтобы снять излишки субстрата с верхнего края лунок, необходимо промокнуть лунки фильтровальной бумагой. Немедленно поставить планшет в темноту, инкубировать его при комнатной температуре 30 мин.

8.7. Учет результатов:

- При визуальной интерпретации результатов: считывание результатов проводится сразу после инкубации. Стоп-реагент не добавляется.

- При автоматизированном учете результатов: по окончании инкубации добавить в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента. В течение 5-ти минут (не более) после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке, используя фотометр планшетный (ридер) с длиной волны 450 им.

9.1. Интерпретации результатов, полученных с помощью ридера:

9.1.1. При значении оптической плотности 0,3 и менее результат расценивается как отрицательный - в исследуемой пробе пищевого продукта бактерии рода Listeria не обнаружены.

9.1.2. При значении оптической плотности более 0,3 проба пищевого продукта расценивается как положительная, и требуется подтверждение наличия в пробе жизнеспособных бактерий рода Listeria.

9.2. Интерпретация результатов при визуальном учете:

9.2.1. При окраске содержимого лунки в синий цвет результат расценивается как положительный, и требуется подтверждение наличия в пробе жизнеспособных бактерий рода Listeria.

9.2.2. При окраске содержимого лунки в прозрачный или бледно-голубой цвет результат расценивается как отрицательный, то есть проба пищевого продукта не содержит бактерий рода Listeria.

10.1. Из бульона Фразера, не подвергавшегося термообработке, провести высев на плотные питательные среды (не менее 2). Инкубировать при температуре 30 °С в течение 24 - 48 часов. При наличии подозрительных колоний провести биохимическое и серологическое типирование.

10.2. При положительном результате биохимического и серологического типирования проба пищевого продукта считается положительной и расценивается как содержащая жизнеспособные бактерии рода Listeria.

11.1. В ходе производственного контроля пищевых предприятий, вырабатывающих и реализующих пищевые продукты, широко используется метод смывов с целью контроля эффективности санитарной обработки инвентаря, оборудования, посуды, санитарной одежды и рук персонала. Метод смывов дает возможность оценить санитарно-эпидемиологическое состояние обследуемых объектов.

11.2. Отбор смывов производится с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов. Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробки для пробирок, заготавливают заранее в лаборатории. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливается (в асептических условиях) по 5 мл бульона предобогащения (половинный бульон Фразера) таким образом, чтобы тампон не касался жидкости.

11.3. Непосредственно перед отбором смыва с поверхности тампон опускают в жидкость.

11.4. При проведении отбора смывов необходимо использовать трафарет в соответствии с установленным порядком контроля объектов. После отбора смывов пробирки со средой обогащения вместе с тампоном необходимо поместить в термостат на 24 ч, инкубировать при 30 °С.

11.5. Далее исследование проводится в соответствии с п. п. 6.2 - 6.4.

Работа по определению бактерий рода Listeria методом твердофазного иммуноферментного анализа должна осуществляться в соответствии с требованиями СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами", ГОСТ Р 51446 "Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований".

13.1. Чувствительность метода составляет: 1 КОЕ бактерий рода Listeria на 25 г пробы пищевого продукта до этапа предобогащения (по данным инструкции производителя тест-системы).

13.2. Чувствительность метода перед детекцией в ИФА - от 100 до 10 -

10 жизнеспособных бактерий рода Listeria в 1 мл культуральной жидкости.

Ассоциация содействует в оказании услуги в продаже лесоматериалов: доска половая шпунтованая по выгодным ценам на постоянной основе. Лесопродукция отличного качества.

В настоящее время рядом авторов доказана и широко освещена ведущая роль в распространении листериозной инфекции таких пищевых продуктов как молоко, сыры, сливочное масло, колбасы, мясные полуфабрикаты [3, 5]. Но, в литературе представлены, в основном, эпидемиологические данные, которые не дают представлений о ключевых факторах, оказывающих влияние на изменение биологических свойств патогенных бактерий. Рассматривая пищевые продукты, как экологическую нишу, занимаемую листериями, как правило, основное внимание исследователей уделяется изучению динамики численности патогенных бактерий под влиянием абиотических факторов [1, 6]. Но, помимо абиотических, на свойства возбудителей могут оказывать влияние и биотические факторы среды, так как листерии входят в состав биоценозов с сапрофитными микроорганизмами, контаминирующими продукты питания. Кроме того, известно, важнейшим механизмом адаптации L. monocytogenes является их способность к существованию и размножению в составе биопленок. На формирование биопленок листериями также могут оказывать влияние сапрофитные микроорганизмы, обсеменяющие пищевые продукты, что необходимо учитывать при эколого-эпидемиологических исследованиях [4, 7]. Вероятно, что биотические взаимодействия наравне с абиотическими факторами играют определенную роль в реализации адаптационных механизмов L. monocytogenes, однако, характер этих взаимодействий мало изучен.

Цель работы – изучить способность L. monocytogenes формировать биопленки в консорциуме с сапрофитными бактериями, выделенными с продуктов питания, при действии различных температур.

Материал и методы исследования

Для изучения способности Listeria monocytogenes образовывать биоплёнки при взаимодействии с сапрофитными микроорганизмами использовали штаммы L. monocytogenes 5642/6 и 9156/2 из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова СО РАМН. В качестве тест-культур сапрофитных бактерий были выбраны 8 штаммов, выделенных из различных продуктов питания.

Опыт проводили на плоскодонных иммунологических планшетах при культивировании микроорганизмов на бульоне КД с добавлением 1% глюкозы при температурах 5 ОС, 22 ОС и 37ОС в течение 3 суток. Для каждой изучаемой комбинации в лунки вносили по 1 мл суспензий листерий и 1 мл суспензий сапрофитных бактерий в концентрации 107 КОЕ/мл. Интенсивность биопленкообразования определяли на третьи сутки эксперимента по модифицированному методу, основанному на спектрофотометрической оценке количества связанного с биопленкой 1%-ого раствора кристаллического фиолетового [2]. В качестве контроля служили значения оптической плотности элюатов, полученные для биопленок листерий без сапрофитов. Каждый опыт повторяли трижды.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе работы было установлено, что при температуре 37ºС оптическая плотность элюатов с поверхности лунок, содержащих только клетки листерий составила для штамма 5642/6 - 0,223, для штамма 9156/2 - 0,088 (табл.1). Для дальнейшего изучения способности листерий образовывать биопленки совместно с сапрофитными микроорганизмами были поставлены опыты с использованием 8 штаммов бактерий, выделенных с продуктов питания. Полученные данные представлены в таблице 1.

Как видно из приведенных материалов, при температуре 37ºС присутствие в среде с листериями тест-культур под номерами 4-1, 1-4 и 7-3488/3/1 положительно влияло на образование биопленок обоих штаммов листерий. Указанные сапрофитные бактерии усиливали процесс биопленкообазования на 18 – 150% по сравнению с контролем. При этом наибольший стимулирующий эффект оказывал штамм 4-1, выделенный с рубленой колбасы.

Ингибирующее влияние на образование биопленок оказали штаммы 9-2, 7с, 3-3492/3/3 и 5557/1, при этом интенсивность процесса снижалась на 22-78%. Интересно отметить, что штамм 2-3 по-разному влиял на биопленки штаммов L. monocytogenes. Для штамма 5642/6 наблюдалось усиление процесса на 16%, для 9156/2 – наоборот, отмечалось ухудшение формирования биопленки на 69%.

При понижении температуры эксперимента до 22ºС обнаружена потеря способности исследуемых штаммов листерий образовывать биопленки в монокультуре. Однако, при добавлении в среду сапрофитов наблюдалось их стимулирующее действие на этот процесс. Все тест-культуры сапрофитов в разной степени стимулировали биопленкообразование: оптическая плотность смывов возрастала до 0,026 - 0,579. Наибольший положительный эффект для обоих штаммов листерий оказал штамм 7-3488/3/1, выделенный с мясных полуфабрикатов.

Стоит отметить, что при более низкой температуре 5ºC листерии также не образовывали биопленок, но в присутствии сапрофитных бактерий эта способность вновь появлялась. Как и в случае культивирования при температуре 22ºC, все исследуемые тест-культуры оказывали положительное влияние на формирование листериями биопленок. Оптическая плотность смывов возрастала до 0,040 – 0,286. Наибольший стимулирующий эффект оказали штаммы 7-3488/3/1 и 7с, выделенные с мясных полуфабрикатов и сыра соответственно.

Таким образом, установлено, что самое эффективное образование биопленок листерий и сапрофитов наблюдалось при 22ºС, что, вероятно, связано с тем, что такая температура является наиболее оптимальной для интенсивного развития сапрофитной микрофлоры, с которой листерии вступают в симбиотические отношения. Утрата листериями способности образовывать биопленки в монокультуре при температурах ниже 37ºС компенсируется способностью образовывать биопленки во взаимодействии с сапрофитами, что является важным адаптационным механизмом выживания и размножения листерий вне теплокровных организмов.

Количественная оценка интенсивности образования биопленок L. monocytogenes и сапрофитных бактерий

Сочетание штаммов (источник выделения сапрофита)