Дизентерийный эритроцитарный диагностикум состав

Диагностикум эритроцитарный шигеллезный Флекснера 1-5 получен путем сенсибилизации эритроцитов смесью антигенов шигелл Флекснера - одтипов 1а, 1в, 2а, 3а, 4в и 5 или Диагностикум эритроцитарный шигеллезный Зонне получен путем сенсибилизации эритроцитов моноантигенами из шигелл Зоне.

Представляют собой 1 % взвесь формалинизированных эритроцитов барана сенсибилизированных липополисахаридными антигенами из шигелл в фосфатном буферном растворе (рН- 7,2 ± 0,2; концентрация – 0,06 моль/л).

Консервант – формалин.
Гомогенная суспензия коричневого цвета без хлопьев; при отстаивании образуется 2 слоя: плотный коричневый осадок эритроцитов и прозрачная желтоватая надосадочная жидкость. 1 флакон– 3 мл.

Сыворотки диагностические шигеллезные (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбированные сухие - гомогенная масса от белого с коричневатым оттенком до бежевого цвета. 1 флакон- из 0,1 мл.

1 % взвесь формалинизированных, несенсибилизированных эритроцитов барана - гомогенная суспензия коричневого цвета без хлопьев; при отстаивании образуется 2 слоя: плотный коричневый осадок эритроцитов и прозрачная желтоватая надосадочная жидкость. 1 флакон – 1 мл.

Поддерживающий раствор - 0,9 % раствор натрия хлорида – прозрачная бесцветная жидкость, рН от 6,5 до 7,5. 2 флакона – по 8 мл.

Планшет круглодонный для иммунологических реакций однократного применения - состоит из 8 рядов, каждый из которых включает в себя 12 лунок с прозрачным, бесцветным, круглым дном. 1 шт.

В качестве анализируемых образцов используют образцы сыворотки крови человека.
Анализируемый образец хранят в условиях, предотвращающих бактериальный пророст при температуре от 2 до 8 0С не более 72 часов. Допускается замораживание, замороженные анализируемые образцы перед исследованием разморозить при комнатной температуре.
Анализ образцов с выраженным гемолизом, бактериальным проростом, а также длительно хранившихся без замораживания или повторно замораживаемых не допускается.
Приготовление растворов для РПГА.
Флакон с сывороткой диагностической шигеллезной (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбированной сухой вскрыть и добавить 1 мл прилагаемого 0,9 % раствора натрия хлорида, получив, таким образом, разведение 1:10. Разведение 1:100 готовить в первой лунке прилагаемого планшета: к 0,09 мл 0,9 % раствора натрия хлорида добавить 0,01 мл сыворотки диагностической шигеллезной, разведенной 1:10.
Вскрытый флакон с сывороткой диагностической шигеллезной (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбированной сухой при разведении 1:10 в закрытом виде можно хранить при температуре от 2 до 8 ºС в течение одного месяца.
Диагностикум готов к применению. Перед вскрытием флакон с диагностикумом необходимо осторожно встряхнуть до получения гомогенной суспензии. В ходе работы встряхивание рекомендуется повторять.
Вскрытый флакон с диагностикумом в закрытом виде можно хранить при температуре от 2 до 8 ºС в течение одного месяца.
0,9 % раствор натрия хлорида. Готов к применению.

Проведение РПГА.
При контроле любого количества анализируемых сывороток обязательна постановка 1 ряда агглютинации с сывороткой диагностической шигеллезной (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбированной сухой.
Для постановки РПГА используют планшет для иммунологических реакций однократного применения. Готовят двукратные серийные разведения анализируемых сывороток в 0,05 мл прилагаемого 0,9 % раствора натрия хлорида начиная с 1:10 до 1:2560 и 1 ряд двукратного серийного разведения сыворотки диагностической шигеллезной (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбированной сухой, начиная с разведения 1:100, до удвоенного титра, указанного на этикетке флакона.
В каждую из лунок с разведениями сывороток прибавляют по 0,025 мл диагностикума.
Обязательными контролями являются:
1. Контроль сыворотки диагностической шигеллезной (Флекснера 1-5 или Зонне) неадсорбированной сухой в разведении 1:100; контроль анализируемой сыворотки в разведении 1:10, для чего в 2 лунки вносят по 0,05 мл каждой из сывороток.
2. Проверка отсутствия спонтанной агглютинации диагностикума, для чего в 2 лунки, содержащие 0,05 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, добавляют по 0,025 мл диагностикума;
3. Контроль на отсутствие в анализируемых сыворотках агглютининов к эритроцитам барана, для чего в 2 лунки вносят по 0,05 мл анализируемой сыворотки в разведении 1:10 добавляют по 0,025 мл 1 % взвеси несенсибилизированных формалинизированных эритроцитов барана (контрольные эритроциты).
Планшет встряхивают и помещают на 2-2,5 ч в термостат при температуре (37 + 1) оС, после чего проводят учет результатов.

Сайт СТУДОПЕДИЯ проводит ОПРОС! Прими участие :) - нам важно ваше мнение.

Задание 1

Цель. Провести бактериологический и серологический методы диагностики дизентерии. Оценить их диагностическую ценность. Ознакомиться с ИБМП для лабораторной диагностики дизентерии.

Бактериологический метод диагностики: выделение и идентификация чистой культуры.

1-й этап. Посев нативного материала. Или взятого с помощью петли из прямой кишки. Материал засевают на среду Плокирева или Левина или висмут-сульфит агар и помещается в термостат при температуре 37°С и инкубируется в течение 24-48 часов, петлю заливаем средой накопления ( селенитовый или желчный бульоны).

2-й этап. Выделение чистой культуры. Через 24 часа инкубации в термостате с помощью петли отвить типичную для дизентерийных бактерий бесцветную колонию на скошенный МПА или среду Олькеницкого для выделения чистой культуры и поместить в термостат на сутки. Из сред накопления произвести высев на среды Плоскирева, Левина или висмут-сульфит агар.

3-й этап. Идентификация выделенной культуры: а) морфология; б) биохимические свойства; в) антигенная структура;

4-й этап: учесть чувствительность выделенной культуры к антибиотикам и бактериофагу.

Серологический метод диагностики.

Для серологического исследования при постановке РПГА берется: а) сыворотка больного; б) эритроцитарный диагностикум; в) физиологический раствор.

Исследуемый материал	Среда для посева	Характеристика колоний по цвету	Идентификация цистой культуры
Морфология	Биохимические свойства	агглютинации	Чувствительность к антибиотикам и бактериофагу
лактоза	глюкоза	маннит	С сывороткой Флекснера	С сывороткой зонне и ньюкастл

Срок исследования	Разведение сыворотки больного
1/100	1/200	1/400	Контроль
3-й день 6-й день

Задание 3

Цель. Изучить специфические препараты для диагностики дизентерии.

Название препарата

Состав

К какой группе диагностических препаратов относится

Практическое использование (метод диагностики)

Бактериофаг дизентерийный поливалентный жидкий или в таблетках – стерильный фильтрат фаголизатов возбудителей бактериальной дизентерии: шигелл Флекснера 1,2,3,4,6- типов и шигелл Зонне

Интести-бактериофаг жидки – смесь стерильных фильтратов фаголизатов шигелл Флекснера 1,2,3,4,6-го серовариантов, шигелл Зоне; сальмонелл паратифа А, паратифа В, тифимуриум, инфантис, холерасуис, ораниенбург, энтеритидис; наиболее распространенных серовариантов кишечной палочки, протеус вульгарис и мирабилис, энтерококков, стафилококков, псевдомонас аеругиноза. Применяется для лечения кишечных инфекций.

Адсорбированные агглютинирующие сыворотки для идентификации шигелл. Получены из крови животных, иммунизированных определенными видами шигелл. Используются в бактериологическом методе для идентификации чистых культур.

Дизентерийный диагностикум. Состоит из взвеси убитых бактерий Флекснера и Зоне. Используется в серологическом методе.

Дизентерийный эритроцитарный диагностикум состоит из взвеси эритроцитов, нагруженных антигенами Флекснера, Зоне и др. используются для постановки РПГА в серологическом методе.

Лабораторное занятие №6

Цель. Изучить этиологию, эпидемиологию и патогенез брюшного тифа, паратифов и ПТИ. Овладеть основными методами лабораторной диагностики брюшного тифа, паратифов, и оценки результатов исследований. Научиться практически решать вопросы по специфической профилактике брюшного тифа.

По последней классификации отмечают два вида сальмонелл: 1)Salmonella bogori содержит 10 очень редких сероваров; 2)Salmonella choleraesuis включает 2500 сероваров. Диагностическим лабораториям рекомендовано внутри рода Salmonella использовать названия сероваров, например: Salmonella typhi или Salmonella typhimurium. Природный резервуар сальмонелл – человек, животные и птицы. Основной путь передачи – водный и пищевой. Сальмонеллы высокоустойчивы в окружающей среде: в питьевой воде – до 120 суток, в комнатной пыли – до 560 суток, в замороженном мясе – до 13 месяцев. Сальмонеллы имеют сложную антигеннюую структуру: в соответствии с содержанием тех или иных О-АГ сальмонеллы разделяют на серологические группы, обозначаемые арабскими цифрами. По Н-АГ микроорганизмы делят на серовары, Vi-АГ – фактор вирулентности. При идентификации сальмонелл принимают во внимание 3 антигена: О, Н и Vi. Этот принцип положен в основу диагностической антигенной схемы Кауфмана-Уайта. Типичную клиническую картину брюшного тифа и характерные патологоанатомические изменения вызывают как брюшнотифозные бактерии, так и бактерии паратифа А и В. Остальные сальмонеллы вызывают заболевания с синдромом гастроэнтероколита.

Для лабораторной диагностики сальмонеллезов используют оба принципа:

1) обнаружение возбудителя – метод бактериологический;

2) обнаружение специфических изменений – метод серологический;

Самостоятельная практическая работа

Цель. Провести бактериологический и серологический методы диагностики брюшного тифа, паратифов.

Задача. В инфекционную больницу поступила женщина на 6-й день болезни. для подтверждения диагноза был сделан посев крови, мочи, испражнений больной для выделения чистой культуры. Поставлена серологическая реакция с сывороткой больной. Учтите результаты исследований, оформите протокол.

Бактериологический метод диагностики

Выделение и идентификация чистой культуры.

1-й этап. Посев материала. Материал для исследования в зависимости от условий задачи может быть различным: кровь, испражнения, моча. Кровь больного берется на первой неделе болезни в количестве 5-10 мл стерильно из локтевой вены и засевается у постели больного во флаконы с 50-100 мл 10-20% желчного бульона. Испражнения и мочу засевают на среду Плоскирева, висмут-сульфит агар и залить средами обогащения: магниевую среду и селенитовый бульон.

2-й этап. Выделение чистой культуры. Через сутки делается посев петлей с желчного бульона на среды Плоскирева и висмут-сульфит агар для выделения чистой культуры. Из чашки со средой Плоскирева петлей откалывают типичную для сальмонеллезных палочек бесцветную колонию на трехсахарный (Олькеницкого, Клиглера) агар. Посевы помещают в термостат при температуре 37°С на сутки.

3-й этап идентификация чистой культуры:

а) морфологические свойства;

в) биохимические свойства;

г) антигенная структура;

Положительная реакция агглютинации с одной из О-сывороток позволит определить групповую принадлежность выделенной культуры сальмонелл по таблице Кауфмана, после чего с соответствующими данной группе Н-монорецепторными сыворотками определяется серовар культуры.

Исследование выделенной культуры заканчивается определением фаготипа микроорганизмов. С этой целью выделенную культуру сеют на питательную среду и наносят петлей на засеянную поверхность брюшнотифозные фаги различных типов. Лизис культуры вызывается определенным фагом, что соответствует фаготипу культуры.

Серологический метод диагностики брюшного тифа. РНГА.

Ставиться по стандартной схеме в плашках или пробирках.

Выделение чистой культуры и её идентификация

Исследуемый материал	Среда для посева	Характеристика колоний по цвету	Идентификация чистой культуры
Морфология	Подвижность	Биохимические свойства	Антигенные свойства	Вид культуры и фаготип
Лактоза	Глюкоза	Сероводород	О-сыворотки	Н-сыворотки

Диагностикум	Разведение сыворотки
1/100	1/200	1/400	1/800	К
Брюшнотифозный Паратифозный А S.typhimirium

Цель. Провести исследования для диагностики брюшнотифозного бактерионосительства.

Задача. Больной перенес брюшной тиф. Перед выпиской из стационара он был обследован для выявления бактерионосительства: возбудитель обнаружен в испражнениях, из мочи и желчи микроорганизмы не выделены. Проведен серологический метод диагностики: поставлена реакция Vi-гемагглютинации. Учтите результат. Оформите протокол.

Для серологического метода использованы ингредиенты: сыворотка больного, эритроцитарный Vi-диагностикум, физиологический раствор.

Диагностикум	Разведение сыворотки
1/20	1/40	1/80	К
Vi-эритроци тарный

Цель. Изучить специфические препараты для диагностики сальмонеллезных инфекций.

Название препарата

Состав

К какой группе диагностических препаратов относится

Практическое использование

Максимальное и минимальное разведение сывороток

Вакцина брюшнотифозная спиртовая, обогащенная Vi-антигеном.

Вакцина брюшнотифозная Vi-полисахаридная.

Интести бактериофаг жидкий.

Люминисцирующаю брюшнотифозная сыворотка.

Адсорбированные агглютинирующие сыворотки.

Эритроцитарный сальмонеллезный диагностикум

Лабораторное занятие №6

Тема:Микробиологическая диагностика пищевых токсикоинфекций.

Цель. Изучить этиологию, эпидемиологию и патогенез пищевых токсикоинфекций (далее ПТИ). Овладеть основными методами лабораторной диагностики ПТИ и оценки результатов исследований.

Теоретическая справка. К пищевым отравлениям микробной природы относятся острые системные заболевания, возникающие в результате употребления пищевых продуктов, массивно обсемененных некоторыми микроорганизмами или зараженных микробными экзотоксинами. Это определение позволило подразделить все пищевые отравления, связанные с микроорганизмами, на пищевые токсикоинфекции и интоксикации. Первые вызывают преимущественно грамотрицательные бактерии, среди которых энтеробактерии занимают первое место. При этом название токсикоинфекции определяется поступлением в кровь бактериального эндотоксина (ЛПС), освобождающегося в большом количестве после массивного разрушения бактерий. Пищевые продукты, содержащие экзотоксины бактерий, вызывают пищевые интоксикации, а токсины грибов микотоксикозы.

Наиболее распространенными возбудителями пищевых токсикоинфекций являются сальмонеллы, реже E.coli, P.vulgaris, P.morganii, Bacillus cereus.

Патогенез и клиническая картина ПТИ определяются проникновением в желудочно-кишечный тракт большого количества соответствующих бактерий с зараженными пищевыми продуктами (мясо, рыба), подвергшимися недостаточной термической обработке. При этом сохранившие жизнеспособность бактериальные клетки быстро размножаются в благоприятных условиях. Одновременное проникновение в кишечник человека массивной дозы возбудителя, его последующее размножение и разрушение бактериальных клеток приводит к освобождению большого количества эндотоксина, оказывающего воздействие на интрамуральный нейрорецепторный аппарат тонкой кишки, периферические сосуды брюшной полости. Это сопровождается нейродистрофическими изменениями в стенке тонкой кишки и поражением клеток других органов. При ПТИ освобождение желудочно-кишечного тракта от возбудителей во многих случаях происходит достаточно быстро, иногда через несколько часов после начала заболевания. Бактериемия при этих заболеваниях как правило не наступает..

Лабораторная диагностика проводится бактериологическим методом, Материалом для исследования являются испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка больных людей и остатки пищи и продуктов, из которых лона была приготовлена.

Пищевые интоксикации бактериальной природы возникают также при попадании с пищей в желудочно-кишечный тракт бактериальных токсинов, из которых наибольшую опасность представляют энтеротоксины Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens и особенно ботулонейротоксин C. Botulinum. Для возникновения пищевой интоксикации не обязательно присутствие в продукте живых возбудителей.

Микробиологическая диагностика пищевых отравлений проводится методом выявления токсинов, а также выделения чистых культур возбудителя – продуцентов токсинов в остатках пищи и в материале, взятом от больного.

Бактериологическая диагностика токсикоинфекций, вызванных сальмонеллами, эшерихиями и протеем.

Материалом для исследования являются испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, остатки пищевых продуктов – возможные факторы передачи инфекции.

1этап Производится посев материала на дифференциально-диагностические среды (Эндо, Плоскирева, Левина, висмут-сульфит агар) для выделения чистой культуры сальмонелл или эшерихий, а также в конденсационную воду в пробирке со скошенным агаром.

На условно-патогенную микрофлоруфлору

3 этап Производят пересев на трехсахарный агар (Клиглера, Олькеницкого) и выделяют чистую культуру протея,

4 этап определяют биохимические и другие признаки и устанавливают вид: P. vulgaris, P. mirabilis.

Оценка роли условно-патогенных микроорганизмов в этиологии пищевых токсикоинфекций должна быть строго аргументирована:

а) бактериологическим, серологическим, эпидемиологическим и клиническим исключением сальмонеллезов, дизентерии, холеры;

б) выделением идентичных штаммов условно-патогенных бактерий из рвотных масс, промывных вод желудка, испражнений, продуктов;

в) нарастанием титров реакции агглютинации с аутоштаммами возбудителей в динамике заболевания.

Лабораторная диагностика пищевых интоксикаций бактериальной природы

1. Материалом для определения стафилококкового энтеротоксина являются рвотные массы, промывные воды желудка больных, остатки пищи (чаще кремы, сметана, мороженое, а также мясные продукты, в которых хорошо размножаются стафилококки).

С целью выделения чистой культуры стафилококка исследуемые материалы, которые могут содержать жизнеспособные бактерии, засевают в чашки с ЖСА.

Для эпидемиологического анализа массовых стафилококковых интоксикаций проводят фаготипирование выделенных культур с помощью набора стафилококковых фагов.

2. Материалом для выявления энтеротоксина клостридий С. perfringens являются мясные, рыбные консервы и другие продукты, из которых экстрагируют токсин изотоническим раствором хлорида натрия. Экстракт центрифугируют и надосадочную жидкость вводят внутрибрюшинно белым мышам или внутрикожном морским свинкам. Гибель животных в течение первых 3-4 дней появление некроза на месте внутрикожных инъекций свидетельствует о наличии токсина. Для его идентификации ставят реакцию нейтрализации с антитоксическими сыворотками С. perfringens.

Выделение чистой культуры С. perfringens и С. botulinum производят, используя методы выделения анаэробных бактерий.

3. Материалом для выявления ботулотоксина служат сыворотка крови, моча, испражнения, промывные воды желудка больного, остатки пищи или подозреваемые продукты (колбасы, мясные, рыбные, фруктовые, овощные консервы и др.). Для обнаружения ботулотоксина в сыворотке крови больного ставят реакцию нейтрализации таксина антитоскической сывороткой в биопробе на белых мышах. (с , моновалентными антитоксическими противоботулиническими сыворотками типов А, В, Е. F,C В качестве контроля берут нормальную сыворотку крови. При нейтрализации токсина гомологичной антитоксической сывороткой мыши остаются живыми.

|	следующая лекция ==>
Тема:Микробиологическая диагностика дизентерии	|	Механизм питания

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

6.6.2. Иммунофлюоресцирующие сыворотки

Содержат иммуноглобулины, к которым посредством прочной химической связи присоединен флюорохром. При этом флюоресцирующие антитела сохраняют – способность взаимодействовать со специфическим антигеном, а флюорохром способность к свечению. Образовавшийся комплекс обнаруживается в люминесцентном микроскопе.

– гипериммунизация животных по определенной схеме;

– выделение из нативной сыворотки глобулинов;

– освобождение иммуноглобулинов от солей;

– маркирование специфических антител флюорохромом;

– стандартизация готовых сывороток.

– Антисыворотка для прямого Кунса – содержит флюоресцирующие антитела к антигенам определенного вида бактерий, риккетсий, вирусов, используют для сероидентификации выделенного возбудителя. Сейчас широко используются флюоресцирующие брюшнотифозные, дизентерийная, коли- и сибиреязвенная, чумная, холерная, туляремийная, бруцеллезная, риккетсиозные и некоторые вирусные антисыворотки.

– Антисыворотки для непрямого метода Кунса – АГС

(антиглобулиновые сыворотки), содержащие флюоресцирующие АТ

к диагностическим сывороткам, применяются для изучения и выявления бактериальных и вирусных антигенов, для обнаружения и титрования антител к ним, в диагностике неинфекционной патологии, для выявления соотношения различных классов иммуноглобулинов при аутоиммунных заболеваниях.

– Антикомплементарная ( против глобулинов морской свинки )

меченая сыворотка – содержит флюоресциирующие антитела к комплементу морской свинки.

6.6.3. Меченные ферритином сыворотки для постановки иммунной электронной микроскопии (ИЭМ)

Ферритин – белок, содержащий до 23 % железа, хорошо контрастирующий и поэтому применяющийся в качестве метки. После обработки мечеными АТ изучаемых объектов (вирусов, бактерий, срезов инфицированных клеток) они становятся электронноплотными и могут быть выявлены при электронной микроскопии. Чаще всего эта реакция применяется в вирусологии.

6.6.4. Меченые ферментом сыворотки для постановки иммуноферментного анализа (ИФА)

Метод основан на использовании в качестве метки АТ ферментов, способных разлагать субстрат и приводить к образованию окрашенных продуктов.

Наиболее распространенный вариант ИФА – твердофазный, когда антиген либо антитело фиксированы на твердом носителе, например, в лунках планшеток из полистирола. Например, для выявления антигена в прямом методе ИФА на стенках лунок фиксируют антимикробные антитела. Если искомый антиген присоединяется к антителам, то он также оказывается фиксированным. После инкубации и отмывки связавшийся антиген выявляют с помощью меченых антимикробных антител .

Конъюгированные с ферментом АТ сохраняют способность соединяться с гомологичным АГ. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов АГ-АТ.

Для проведения твердофазной ИФА необходимы полистироловые планшеты, имеющие лунки с плоским дном и автоматические пипетки. Для количественного учета используют спектрофотометр – регистратор экстинции при длине волны 492 нм. ИФА характеризуется весьма высокой чувствительностью и быстротой получения результатов (в течение 4-6 часов). Каждое разведение ставят параллельно в двух лунках.

Наиболее распространенными ферментами-метками являются

пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Препараты из меченых антител называют конъюгатами. После соединения конъюгата с антигеном в смесь добавляют субстрат (Н 2 О 2 или фосфатид) и хромоген . Субстрат расщепляется ферментом (Н 2 О 2 пероксидазой с

образованием активного кислорода, который окисляет хромоген) и изменяет цвет продукта реакции (например, с прозрачного до желтого, если хромоген ортофенилендиамин, или коричневого – если хромоген аминосалициловая кислота) разной степени интенсивности. Эта интенсивность может учитываться с помощью специальных приборов (фотоэлектроколориметры) или визуально. Применяются также автоматические анализаторы (ридеры).

При определении в ИФА антител (например, серодиагностика ВИЧ-инфекции) на носителе фиксируют известные антигены – непрямой метод ИФА . Затем вносится исследуемая сыворотка. Для выявления образовавшихся комплексов антиген + антитело вносится

антиглобулиновая сыворотка, меченая ферментом. Обязательно несвязанный конъюгат трижды отмывают буфером. Затем в лунку вносят 0,1 мл смеси раствора субстрата и хромогена и выдерживают 30 минут. В процессе инкубации пероксидаза разрушает субстрат (Н 2 О 2 ) с образованием активного кислорода, который окисляет хромоген. В результате хромоген меняет цвет.

Конъюгаты. С одержат иммуноглобулины, в которых посредством прочной химической связи присоединен фермент (пероксидаза или фосфатаза). При этом антитела сохраняют свою способность взаимодействовать со специфическим антигеном, а фермент – вступать в реакцию с субстратом и окислять хромоген. Для получения АТ, конъюгированных ферментом, необходимы высокоактивные преципитирующие сыворотки против АГ или против глобулинов животных или человека, из которых выделяют гаммаглобулиновую фракцию. Иммуноглобулины конъюгируют с ферментом при помощи глютаральдегида. Несвязанный фермент удаляют диализом или хроматографией на сефадексе. Для предупреждения микробной деградации в конъюгаты вносят мертиолят до 0,01 % и хранят при 4 ºС в замороженном или лиофильно высушенном состоянии.

В настоящее время выпускают препараты пероксидазных конъюгатов антител для выявления антигенов стафилококков, пневмококков, возбудителей чумы, туберкулеза, легионеллеза, гриппа, парагриппа, аденовирусной инфекции и др .

6.6.5. Сыворотки, меченные радиоизотопами для постановки радиоиммунного анализа (РИА)

Для этого диагностического метода используются антитела, меченные изотопами , и учет интенсивности излучения производится при помощи специальных счетчиков (β- или γ-излучения). Реакции РИА очень чувствительны, позволяют обнаружить 1–2 нг и менее исследуемого вещества

Этапы приготовления диагностических сывороток те же, что и

для других реакций с меткой, но маркируются антитела изотопами

125 I, 51 Cr, 14 С, 3 Н.

6.7. Моноклональные антитела (МКА)

Моноклональные антитела – это особый вид иммунных сывороток, отличающихся высокой специфичностью . Они представляют собой биохимически гомогенные молекулы антител, обладающие паратопом (гипервариабельным участком F(ab) фрагмента антитела) единственной, строго определенной специфичности.

МКА против одного определенного антигенного эпитопа идентичны по физико-химическим свойствам, специфичности, аффинности и относятся к одному классу и типу иммуноглобулинов.

Моноклональные антитела точнее, чем обычные иммунные сыворотки, выявляют мельчайшие антигенные структуры. Их широко применяют в современных иммуноферментных, иммунофлюоресцентных и радиоиммунных методах выявления антигенов и антител.

В условиях макроорганизма получить моноклональные антитела практически невозможно. Сложность в том, что на одну и ту же антигенную детерминанту (эпитоп) одновременно реагируют множество различных клонов В-лимфоцитов, что обусловливает большое разнообразие продуцируемых антител.

способность продуцировать антитела и способность к неограниченному размножению.

Этапы получения гибридомных клеток:

– Иммунизация мышей нужным антигеном.

– Получение культуры В-лимфоцитов из селезенки иммунизированной мыши.

– Слияние иммунных B-лимфоцитов с опухолевыми клетками В-миеломы, способными делиться бесконечно.

– Отбор жизнеспособных гибридов на селективной питательной среде.

Популяция отобранных гибридов способна синтезировать антитела нужной специфичности в неограниченном количестве.

– Гибридомы размножают в искусственных питательных средах или в организме животных в виде асцитных опухолей. При росте опухоли в организме мыши в асцитическую жидкость поступает большое количество антител.

6.8. Иммунотоксины, иммуноадгезины

Искусственно полученные антитела. Практически к любым структурам микробной, животной или человеческой клетки и тканям, обладающим антигенностью, можно получить антитела. Эти специфические антитела (в основном моноклональные) к отдельным структурам клеток нашли применение в исследовательских работах, в частности, для маркировки клеток (например, CD-маркеры В- лимфоцитов), для изучения механизмов взаимодействия клеток в норме и патологии ( иммуноадгезины) , для адресной доставки лекарственных препаратов и подавления тех или иных биологических процессов ( иммунотоксины) .

6.9. Абзимы (антитела-ферменты)

Искусственно полученные иммуноглобулины, обладающие специфичностью антител к какому-либо промежуточному продукту биологической реакции, обладающему антигенными свойствами. Абзимы действуют как ферменты-катализаторы. Могут ускорять течение биохимических реакций в 1 000 раз и более.

Глава 7. Диагностикумы и антигены

Биологические антигенные препараты, применяемые для обнаружения и титрования антител в сыворотке крови больных (с целью серодиагностики), могут представлять собой как взвесь убитых микроорганизмов, так и растворимые антигенные фракции.

Для приготовления антигенных препаратов подбирают специальные штаммы микробов, обладающих высокой специфичностью и сохраняющих свои антигенные свойства после обработки. Антигенные препараты бывают корпускулярные и растворимые. Если корпускулярный антиген представляет собой взвесь убитых микроорганизмов, то растворимый – антигенные фракции. Растворимые антигены отличаются большей чувствительностью и стабильностью. Корпускулярные антигены готовят из взвеси микроорганизмов, инактивированных нагреванием при 100 в течение 15–20 минут, а также – спиртом или формалином.

Растворимые антигены представляют собой антигенные фракции, полученные путем экстракции из чистой культуры микроорганизмов.

Стандартные антигены, которые используются в иммунологических реакциях для выявления соответствующих им (специфических) антител в исследуемых сыворотках, называются диагностикумами.

Тонкие различия АТ в изучаемой сыворотке обнаруживают при помощи монодиагностикумов, то есть препаратов, содержащих один антиген, например: групповой О- или специфический типовой – Н-, или Viантиген. Такие монодиагностикумы готовят, например, для распознавания заболеваний, вызванных микроорганизмами рода сальмонелл.

активированного угля, латекса, холестерина, каолина и других органических и неорганических адсорбентов.

7.1. Бактериальные антигенные препараты

– Бруцеллезный единый диагностикум – взвесь убитых формалином либо нагреванием бруцелл трех видов в физиологическом растворе хлорида натрия с добавлением метиленового синего. Препарат выпускается в жидком виде и представляет собой гомогенную взвесь бруцелл, окрашенную в синий цвет. Применяют для постановки как развернутой реакции агглютинации с сывороткой больного (реакция Райта), так и на стекле (реакция Хеддельсона) с целью серодиагностики бруцеллеза.

– Брюшнотифозный О-диагностикум – взвесь бактерий брюшного тифа, убитых нагреванием при 100 ºС.

– Брюшнотифозный Н-диагностикум – взвесь бактерий,

Оба брюшнотифозных диагностикума используют в реакции Видаля для серодиагностики брюшного тифа.

– Эритроцитарный брюшнотифозный диагностикум

представляет собой взвесь эритроцитов, обработанных формалином и сенсибилизированных антигеном брюшнотифозных микробов. Применяется в РПГА с целью серодиагностики бактерионосительства при брюшном тифе.

– Дизентерийные диагностикумы (Зоне, Флекснера и др.)

состоят из дизентерийных микробов, убитых формалином. Используются в реакции агглютинации для серологической диагностики дизентерии.

– Дизентерийные эритроцитарные диагностикумы сухие и жидкие представляют собой взвесь формализированных эритроцитов барана, сенсибилизированных антигеном шигелл. Дизентерийные эритроцитарные диагностикумы используются в РПГА для серологической диагностики дизентерии.

– Растворимый коклюшный антиген для РСК представляет собой выделенный из микробных клеток при помощи химической экстракции и очищенный специфический растворимый антиген коклюшного микроба, обладающий высокой серологической активностью. Используется с целью серодиагностики, а также оценки эффективности вакцинации.

– Эритроцитарный коклюшный диагностикум представляет собой растворимый антиген коклюшной палочки, сорбированный на формализированных и обработанных таннином эритроцитах барана. Имеет вид прозрачной бесцветной жидкости с плотным коричневым осадком эритроцитов. Применяется для выявления антител при помощи РПГА.

– Туляремийный диагностикум состоит из культуры туляремийных микробов, убитых формалином. Используется при серологической диагностике туляремии в реакции развернутой агглютинации и в кровяно-капельной реакции на стекле.

– Гонококковый антиген представляет собой стандартизованную взвесь культуры гонококка, убитую с помощью температуры или ультразвука. Применяется для постановки РСК при серологической диагностике хронической гонореи.

– Антигены для серодиагностики сифилиса . Для серологической диагностики сифилиса с помощью РСК (р.

Вассермана) используют два

антигена: специфический и

– Специфический антиген готовят из тканевых трепонем, полученных при экспериментальном орхите у кроликов и разрушенных ультразвуком. Антигены из трепонем характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью.

– Неспецифический кардиолипиновый антиген –

высокоочищенный экстракт бычьего сердца, имеющий постоянный химический состав липидов и смешанный в определенной пропорции

с лецитином и холестерином. Кардиолипиновый антиген используют также и в микрореакции преципитации.

– Лептоспирозный антиген представляет собой живую взвесь 7– 10-дневной культуры лептоспир, выращенной на жидкой питательной среде. Применяется для постановки реакции агглютинации и лизиса.

7.2. Риккетсиозные и вирусные антигенные препараты

– Риккетсиозные корпускулярные антигены – взвесь убитых риккетсий соответствующих видов, выращенных в желточном мешке куриного эмбриона и тщательно очищенных от посторонних тканевых элементов.

– Риккетсиозные антигены растворимые представляют собой антигенные фракции, полученные путем экстракции и последующей

обработки эфиром чистой культуры риккетсий. Готовятся производственным путем и выпускаются в виде сухих препаратов в запаянных ампулах. Риккетсиозные антигены используются при серологической диагностике риккетсиозов: эпидемического и эндемического сыпного тифа, марсельской лихорадки, волынской лихорадки и Ку-лихорадки. Эти антигены применяют в РСК и РА.

– Жидкий эритроцитарный сыпнотифозный диагностикум

представляет собой взвесь человеческих или бараньих эритроцитов, сенсибилизированных специфическим гаптеном из риккетсий Провачека. Применяют для постановки РПГА с целью серодиагностики.

– Гриппозные диагностикумы представляют собой очищенную вируссодержащую аллантоисную жидкость куриных эмбрионов, высушенную лиофильным методом. Готовятся диагностикумы раздельно для каждого типа вируса гриппа: А, А1, А2, В, С. Гриппозные диагностикумы применяются для постановки РТГА при серологической диагностике гриппа у больных.

– Аденовирусный антиген представляет собой инактивированную вируссодержащую жидкость, полученную при культивировании аденовируса в культуре перевиваемых клеток. Используется в РСК при серологической диагностике аденовирусной инфекции у людей.

– Парагриппозные гемагглютинирующие диагностикумы – это обработанные эфиром и твином препараты, полученные из тканевых культур, инфицированных парагриппозными вирусами I, II, III типов. Парагриппозные диагностикумы используются в РТГА.

– Диагностикум клещевого энцефалита – это препарат,

приготовленный методом экстрагирования специфического вирусного компонента из мозговой ткани белых мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита и обезвреженный формалином. Препарат применяют в качестве антигена в РСК при серологической диагностике заболевания у людей.

– Гемагглютинирующий инактивированный диагностикум клещевого энцефалита выпускается в виде суспензии мозга мышей, зараженных вирусом. Препарат применяется в качестве антигена в РТГА для выявления антител в сыворотках переболевших людей, а также у людей и животных в природных очагах.

Глава 8. Диагностические бактериофаги

Препараты диагностических бактериофагов готовят из индикаторных монофагов и типовых бактериофагов. Применяют для фагодиагностики, фагоидентификации и фаготипирования.

– Фагодиагностика – осуществляется двумя путями:

• выделение специфических бактериофагов из исследуемого материала больного при подозрении на ту или иную бактериальную инфекцию, что косвенно указывает на наличие соответствующего возбудителя;

• обнаружение в исследуемом материале незначительных количеств бактерий при помощи реакции нарастания титра фага (РНТФ) без выделения чистой культуры возбудителя.

Для фагодиагностики выпускают :

– индикаторные бактериофаги: брюшнотифозный,

дизентерийный Флекснера и Зонне, чумный, холерный – классический и Эль-Тор, бруцеллезный и сибиреязвенный.

Индикаторный бактериофаг – вирулентный фаг,

характеризующийся точно лимитированным спектром действия. Индикаторный фаг обладает высокой адсорбционной способностью, коротким инкубационным периодом и высоким урожаем. Эти свойства обеспечивают значительное увеличение титра фага в исследуемом материале, содержащем соответствующих возбудителей, что выявляется в реакции нарастания титра фага (РНТФ), используемой для обнаружения бактерий в объектах окружающей среды и исследуемом материале больного.

– Фагоидентификация – определение вида бактерий, выделенных в чистой культуре по известному бактериофагу.

Для фагоидентификации бактерий в чистой культуре применяют диагностические препараты вирулентных полифагов и монофагов, в том числе индикаторных. Используются:

– сальмонеллезный бактериофаг АВСДЕ, брюшнотифозный монофаг, монофаги паратифа А и В, дизентерийные поли- и монофаги Зонне, Флекснер и другие, бруцеллезный монофаг, чумной монофаг, холерные монофаги и др.

Фаготипирование – подразделение бактерий внутри вида или серовара с помощью типовых бактериофагов, что необходимо для эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний.

Различают два способа фаготипирования : прямой и непрямой.