Образцы сыворотки крови для исследования на вич можно хранить в холодильнике при

Приложение N 6
к приказу
от 27 января 2006 г. N 16/9

Правила забора, хранения и транспортировки
крови для исследования на ВИЧ

1. Для исключения ложных результатов при исследовании на антитела к ВИЧ рекомендуется неукоснительно выполнять следующие правила забора и транспортировки сывороток крови:

1.1. Кровь для первичной серодиагностики в ИФА берется из локтевой вены в количестве 3-5 мл, желательно натощак, в чистую сухую пробирку.

Допускается пальцевая проба у детей. При невозможности взятия крови из вены, кровь может быть взята из пальца в количестве до 1 мл.

1.2. Пробирки герметично закрывают резиновыми или ватно-марлевыми, обернутыми полиэтиленовой пленкой, пробками и помещают в штатив, который доставляется в лабораторию в специальном контейнере или биксе с маркировкой "Осторожно, AIDS". Не допускается перевозка материала в сумках, портфелях и других предметах личного пользования, а также запрещается доставка биоматериала на исследование больными или родственниками пациентов. При перевозке на транспорте требуется доставлять исследуемый материал для проведения скрининговых исследований в сумках-холодильниках (термоконтейнерах) при температуре +4 +8. При необходимости возможно использование уплотнителей (вата, поролон), которые в последующем в лаборатории подлежат обеззараживанию и утилизации. Запрещается перевозка на общественном транспорте.

1.3. Срок хранения крови, забранной для анализа на ВИЧ, - не более 12 часов при комнатной температуре и не более 1 суток в холодильнике при +4 +8 град. Наступающий гемолиз может повлиять на результат анализа. По этой причине цельная кровь должна быть доставлена в диагностическую лабораторию в день забора.

1.4. Предпочтительнее сразу после взятия крови и наступления ретракции кровяного сгустка после ценрифугирования (или отстаивания) отобрать сыворотку. Отдельная сыворотка переносится в чистую (лучше стерильную) пробирку, пластиковый контейнер. Если сыворотка не может быть сразу же доставлена в СПИД - лабораторию, то в таком виде она может храниться до 3 дней при температуре +4 +8 С.

Категорически запрещается переливание сыворотки через край пробирки, пипетирование сыворотки ртом. Отсасывание сыворотки производит лаборант с помощью груши, лучше автоматическими пипетками с одноразовыми наконечниками, при этом необходимо обеспечить, чтобы каждый образец сыворотки отбирался индивидуальным наконечником. Стеклянные палочки и пипетки должны быть индивидуальными для каждой сыворотки. Ни в коем случае нельзя использовать повторно палочки и пипетки в процессе отделения сыворотки из разных образцов, т.к. это может привести к перекрестной контаминации отрицательных сывороток.

1.5. Пробирки маркируют карандашом по стеклу. Не рекомендуется использовать для этой цели этикетки из лейкопластыря. Номера пробирок в штативе должны соответствовать номерам в направлениях и в общем списке. Зачеркивать, вносить изменения, поправки категорически запрещается.

1.6. Сопроводительная документация составляется в 2-х экземплярах. Лечебно-профилактические учреждения при первичном (скрининговом) лабораторном исследовании пациентов на антитела к ВИЧ заполняют направление по форме N 264/у-88. Зачеркивания, внесение изменений, поправки категорически запрещены. Направления помещают в полиэтиленовые пакеты и доставляют в лабораторию вне контейнера.

1.7. В случае поступления в лабораторию биоматериалов на исследование с направлением в виде свободной таблицы-списка, необходимо одновременно предоставить заполненный бланк направления отдельно на каждого обследуемого по форме N 264/у-88 (см. Приложение N 7).

1.8. С целью обеспечения полноты обследования на ВИЧ, особенно в условиях работы стационаров, необходимо осуществлять забор крови на ВИЧ ежедневно, включая выходные и праздничные дни. После отстаивания или получения сыворотки путем центрифугирования рекомендуется отделить сыворотку от кровяного сгустка (лучше в стерильную пробирку) и доставить в СПИД-лабораторию в день транспортировки, сохраняя сыворотку в холодильнике при температуре +4 +8 С.

1.9. Лаборатории диагностики ВИЧ-инфекции/СПИД перекладывают присланный материал в штативы или другие емкости диагностической лаборатории, помещенные на эмалированные или металлические подносы, и переносят в комнату разборки и подготовки материала для серологических исследований. Контейнеры, в которых доставлен материал, после разгрузки обрабатывают дезраствором.

1.10. Лаборатория в обмен выдает пробирки, обработанные согласно МУ 3.5.1/3.5.4.001-98, в полиэтиленовые мешки учреждений. Штативы и биксы возвращают только после дезинфекции.

1.11. Термоконтейнеры или биксы с биоматериалом доставляет в лабораторию персонал, прошедший инструктаж. Выполнение этими лицами данных функциональных обязанностей должно быть предусмотрено приказом по ЛПУ.

2. В случае положительного скринингового теста на антитела к ВИЧ проводится дальнейшая серологическая диагностика с целью подтверждения специфичности полученного результата в референс-лаборатории.

2.1. С целью окончательного лабораторного подтверждения ВИЧ-инфекции забор крови осуществлять лучше в стерильную пробирку, желательно натощак, свежеприготовленная сыворотка доставляется в референс-лабораторию в день забора крови.

2.2. При повторном взятии крови необходимо предупредить все возможные ошибки обусловленные неточностью маркировки пробирок и заполнения бланков направлений, которые могут привести к подмене сывороток от разных пациентов.

2.3. При отправке в референс-лабораторию второй порции сыворотки для проведения подтверждающей серологической диагностики ВИЧ-инфекции заполняется сопроводительная документация, составленная по форме N 265/у-88 (Приложение N 8), заверенная подписью врача, направившего материал на референс-исследование.

2.4. Сыворотка упаковывается в соответствии с правилами транспортировки инфекционного материала и доставляется в штативе, отдельном от других образцов, с собой маркировкой пробирок красным карандашом по стеклу.

2.5. Прием контейнера с сывороткой, предназначенной для проведения подтверждающих тестов, регистрируется в отдельном журнале с указанием должности, фамилии лица, ответственного за транспортировку сыворотки, направленной на перепроверку или постановку иммуноблота.

3. При проведении повторных исследований на антитела к ВИЧ, при сомнительных результатах первичного исследования сыворотки крови, (через 3 месяца и при сохранении неопределенных результатов - через 6 месяцев) - забор крови и транспортировка проводится в соответствии с п.п. 2.1.-2.5. с обязательной отметкой в ф. N 265/у-88 (Приложение N 8).

>
N 8. Направление N_____ на исследование крови на СПИД в референс-лабораторию

Содержание
Приказ Министерства здравоохранения Самарской области от 27 января 2006 г. N 16/9 "Об улучшении работы по выявлению ВИЧ-инфицированных.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Приложение 1
к приказу МЗ РТ
от 22 декабря 1992 г. N 1035

Рекомендации
для лечебно-профилактических учреждений по сбору образцов сыворотки крови для исследования на ВИЧ и HBs-Ag, доставки их в лаборатории диагностики СПИД и оформлению сопроводительного документа

1. Сбор образцов сыворотки крови

Лаборатории по диагностике СПИД при постановке иммуноферментных анализов (ИФА) и иммунолота (ИБ) работают только сывортками# крови.

Кровь от подлежащего контингента отбирается в процедурном кабинета ЛПУ в количестве 3-5 мл в чистую стерильную посуду отбор сыворотки проводится после предварительного отстаивания забранных образцов крови в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре или в течение 1 часа при 37° в термостате. Снятие сыворотки со сгустка позже 3 часов после взятия крови недопустимо. Особенно тщательно нужно подходить к исследованию донорской крови. Длительное хранение образцов крови вне холодильника практикуемое при выездах бригад для забора крови, является абсолютно недопустимо. Необходимо организовать отбор сыворотки со сгустка на пункте сбора крови.

Отбор сыворотки проводится в отдельной комнате или на специально отведенном столе отдельным для каждой порции крови наконечником с помощью груши. Недопустимым является отбор разных образцов сыворотки со сгустка крови одной пипеткой. Для лучшего отделения сыворотки рекомендуется обведение сформировавшегося сгустка крови индивидуальной стеклянной палочкой или пипеткой. Необходимо избегать попадания эритроцитов в сыворотку. Нельзя отбирать сыворотку переливая ее из пузырька в пузырек. Это приводит к бактериальному загрязнению исследуемого материала, увеличивает риск аварии. Недопустима доставка в лабораторию СПИД гемолизированных и хилезных сывороток. Это увеличивает риск ложноположительных или же ложноотрицательных результатов.

Сыворотка должна быть доставлена в лабораторию в течение 5 (пяти) дней от даты забора крови при условии хранения сыворотки при температуре 4-8°С. Пробирки и флаконы с кровью или сывороткой должны быть герметично закрыты резиновыми пробками.

Медицинские работники работают в полном наборе спецодежды: хирургические халаты, шапочки, кожаная обувь, резиновые перчатки, одевается маска и очки, так как при заборе крови, отсасывании сыворотки или открывании пробки с флакона возможно разливание или разбрызгивание крови или сыворотки в виде невидимых глазу капель или аэрозоля.

Обработка оставшихся сгустков крови после отсасывания сыворотки предусматривает их обеззараживание сухой хлорной известью в соотношении 1:5. Для того, чтобы это выполнить, необходимо вытряхнуть сгустки из пробирок, а это влечет к разбрызгиванию потенциально инфицированного материала, поэтому при выполнении этой процедуры необходимо одевать маски или респираторы, защитные очки, резиновые фартучки и перчатки.

Лучше пробирки со сгустком крови замочить в 5% растворе хлорамина в течение 2 (двух) часов. Можно использовать 10% раствор хлорной извести.

Пробирки или пенициллиновые пузырьки, резиновые пробки, предназначенные для повторного использования после дезинфекции (6% перекись водорода, 3% раствор хлорамина, 70 градусный спирт) промываются проточной водой, затем дистиллированной и стерилизуются в суховоздушном стерилизаторе согласно ОСТу 42-21-2-85.

Ведется журнал учета работы суховоздушного стерилизатора (дата; режим стерилизации; наименование и количество стерилизуемого материала; упаковка материала; время стерилизации: начало, окончание, выемка; контроль стерилизации; подпись ответственного лица). В каждую партию посуды вкладываются тесты, подтверждающие наличие нужной температуры.

Если при дезинфекции посуды применяются хлоросодержащие препараты, то она должна подвергаться дополнительному кипячению для разрушения дезинфектанта.

На случай аварии должен храниться запас дезинфицирующего средства в достаточном объеме.

Необходима медицинская аптечка, в которую входят 70 градусный спирт, йод, навески марганцевокислого калия и соответствующее количество дистиллированной воды для разведения 1:10000, перевязочный материал.

2. Доставка материала в лабораторию

Образцы сыворотки крови должны быть доставлены в лабораторию диагностики СПИД в пробирках или пенициллиновых флаконах, герметично закрытых резиновыми или ватно-марлевыми, обернутыми полиэтиленовой пленкой, пробками. Пробирки или флаконы устанавливаются в штативы, которые помещают для транспортировки в плотно закрывающуюся крышками металлическую тару (контейнер, стерилизационная коробка и др.), которая не портится при дезинфекции. Оптимальной считается доставка тары с исследуемым материалом в сумках-холодильниках.

3. Сопроводительный документ

Ответственное лицо лечпрофучреждения составляет общее "Направление на исследование крови на наличие антител к ВИЧ" в 3-х экземплярах под копирку. Направление должно иметь все необходимые данные на каждого обследуемого лица по следующим графам:

- порядковый номер образцов сыворотки крови (заполняется лечпрофучреждением);

- номер регистрации (заполняется лабораторией диагностики СПИД);

- фамилия, имя, отчество (полностью);

- возраст (для детей до одного года проставляется дата рождения);

- место работы, учебы, детское дошкольное учреждение; если иностранец, то указывать гражданство (страна);

- диагноз (обязательно) и код;

- дата взятия крови;

- результат исследования (заполняется лабораторией диагностики СПИД индивидуально на каждое обследуемое лицо).

В обязательном порядке на бланке направления должны быть проставлены: печать ЛПУ, его адрес, телефон; а также должность, фамилия (разборчиво), подпись лица, направившего материал и дата отправки материала на исследование.

Все 3 (три) экземпляра направления вместе с образцами сывороток крови направляются в лабораторию диагностики СПИД. После завершения анализов один экземпляр направления оставляется в лаборатории и два - возвращаются в лечпрофучреждение. В лечпрофучреждении - один экземпляр списка лиц, обследованных на ВИЧ и HBs-Ag хранится в общей папке у ответственного лица за эту работу, а второй экземпляр - разрезается и подшивается в медицинский документ обследуемого лица индивидуально.

При невыполнении данных требований, лаборатория должна отказать в приеме сывороток на исследование.

При получении из лаборатории результата: "Повторить забор крови на ВИЧ", лечпрофучреждением проводится повторный забор крови у пациента в кратчайшие сроки и сыворотка в количестве не менее 3 мл отправляется в лабораторию диагностики СПИД. На пробирке с сывороткой должна быть указана фамилия, имя, отчество пациента и пометка "Повтор". Соответствующее направление оформляется на отдельном бланке в 3-х экземплярах под копирку с пометкой "Повтор" и должно иметь все необходимые данные согласно вышеизложенным требованиям по его заполнению.

Недопустимым является включение сведений о повторно обследуемом лице в общий список очередной партии материала. Если получение повторной сыворотки является невозможным (по объективным причинам: выезд, категорический отказ и т.д.), информация об этом должна быть доставлена в лабораторию диагностики СПИД в кратчайшие сроки на бланке с пометкой "Повтор".

>
Рекомендации по соблюдению противоэпидемического режима в лабораториях диагностики ВИЧ-инфекции для врачей-лаборантов и эпидемиологов.

Содержание
Приказ Министерства здравоохранения РТ от 22 декабря 1992 г. N 1035 "Об улучшении организации и качества проведения скрининговых.

Взятие, доставку и оформление материалов для проведения лабораторных исследований методом ИФА на ВИЧ-инфекцию и СПИД - индикаторные заболевания, для проведения лабораторных исследований методом ПЦР на ВИЧ - инфекцию, вирусные гепатиты В и С, а также для иммунологических исследований в КДЛ ГБУЗ РЦПБ СПИД и ИЗ производить строго в соответствии с правилами (приложение 1, 2, 3).

Наиболее частыми нарушениями указанных правил являются следующие:

1) при оформлении сопроводительной документации не указывается наименование диагностической тест-системы, ее серия, срок годности

2) не полностью указываются паспортные данные обследуемых, а также дата и место взятия материала

3) зачастую в лабораторию ГБУЗ РЦПБ СПИД и ИЗ доставляется материал, уже непригодный для исследования: сыворотки, хранившиеся дольше установленного срока хранения (для разных методов исследования сроки хранения составляют от 3 до 48 часов); проросшие, гемолизированные сыворотки, в недостаточном для исследования количестве (в зависимости от метода минимально необходимый объем материала составляет от 2 до 5 мл);

4) номера, проставленные на флаконах, не соответствуют указанным в направлении; количество проб крови не соответствует количеству, указанному в направлении;

5) неправильно производится взятие материала, в пробах крови, доставляемых для исследований методом ПЦР и для иммунологические исследований, обнаруживаются сгустки,

6) при заборе материала не всегда медицинский персонал ЛПУ обращает внимание на сроки годности пробирок.

Правила взятия и доставки крови для проведения лабораторных исследований методом ИФА на ВИЧ-инфекцию и СПИД-индикаторные заболевания.

Взятие крови производится из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. У новорожденных можно брать пуповинную кровь с указанием об этом в направлении. Полученный материал не рекомендуется хранить более 12 часов при комнатной температуре и более 1 суток в холодильнике при +4-8 0С. Наступающий гемолиз может повлиять на результаты анализа. В случае невозможности доставки материала в течение суток следует сразу после взятия крови отобрать из нее сыворотку. Сыворотка отделяется центрифугированием. Отделенная сыворотка переносится в чистую (лучше стерильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер, и в таком виде она может храниться до 7 дней при температуре +4-8 0С. На пробирке следует указать порядковый номер, фамилию и инициалы пациента, в строгом соответствии с направлением. Для транспортировки в КДЛ диагностики ВИЧ штативы с пробирками помещают в термоконтейнер, легко подвергающийся дезинфекции. Полученный материал в КДЛ диагностики ВИЧ доставляет медицинский персонал, прошедший специальный инструктаж в установленном порядке.

Утв. МЗ СССР от 05.09.1988 г. №690

Направление №__________________

на исследование образца крови в ИФА на ВИЧ-инфекцию

В_________________________________________________________
(наименование учреждения)

Должность лица, направляющего материал___________________________________

Взятие материала для исследования производить только при предъявлении пациентами паспорта или иного документа, удостоверяющего его личность (кроме анонимного обследования).

Коды контингентов

Наименование кода

код

Доноры (крови, биологических жидкостей, органов и тканей)

Медицинский персонал, работающий с ВИЧ - инфицированными лицами и инфицированным материалом

Гомо- и бисексуалисты

Больные заболеваниями, передающимися половым путем

Лица, находящиеся в местах лишения свободы

Обследованные по клиническим показаниям

Беременные (доноры плацентарной и абортной крови)

Обследованные при эпидемиологическом расследовании

Для лабораторий диагностики ВИЧ-инфекции в обменном журнале и направлении обязательно дополнительно указываются результаты исследования (ОП сыворотки, ОП критическое), а также дата постановки, название, серия, срок годности используемой тест-системы.

Правила взятия, хранения и доставки материала для проведения исследований методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В направлении должны быть четко указаны: учреждение, направившее материал, Ф.И.О. (полностью), год рождения, код контингента, домашний адрес, дата, точное время и место взятия материала, фамилия и подпись ответственного лица с указанием номера контактного телефона.

Правила взятия и доставки материала для проведения иммунологических исследований.

Материал должен быть доставлен в лабораторию сразу после взятия. Недопустимо замораживание биологического материала. Флаконы должны быть четко промаркированы с указанием фамилии пациента, даты и времени взятия. Маркировка флаконов должна строго соответствовать данным, указанным в направлении.

В направлении должны быть четко указаны: учреждение, направившее материал, Ф.И.О. (полностью), год рождения, код контингента, домашний адрес, дата, время и место взятия материала, фамилия и подпись ответственного лица с указанием номера контактного телефона.

ТЕХНИКА ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ

2.1. Условия взятия и хранения биологического материала

Подготовка к проведению лабораторных исследований содержит два основных момента: необходимость соблюдения стандартных условий взятия биологического материала и предотвращение деградации биологически активного вещества в образцах.

Перед получением образца крови медицинскому работнику необходимо знать следующее:
1) некоторые биологические вещества, например гормоны, после приема пищи могут иметь повышенную концентрацию; ,
2) содержание ряда веществ подвержено влиянию циркадных (суточных) колебаний;

3) множество лекарственных веществ способны влиять на определяемые вещества, повышая или понижая их уровень в крови;

4) взятие исследуемого образца у пациентов в горизонтальном, в вертикальном положении или после физической нагрузки изменяет уровень биологически активных веществ иногда более чем на 10 %.

Желательно, чтобы кровь, предназначенная для исследования, забиралась в однотипные центрифужные пробирки. Такие пробирки должен готовить (мыть, высушивать, добавлять коагулянт или ингибитор ферментов) один сотрудник. Кровь без добавок отстаивают, а с добавками центрифугируют, полученную сыворотку или плазму разливают в такое количество мелких пластмассовых или стеклянных пробирок (стекло не всегда выдерживает низкую температуру), которое равно или превышает число разных типов тестирования.

В биохимической деятельности организма большую роль играют биологические ритмы. Пульсирующий характер секреции многих веществ от нескольких минут до суток - все это должно быть учтено при взятии биологического материала. Вне связи с временным фактором и конкретным физиологическим состоянием не существует абсолютных нормативных показателей вещества. Если не преследуется специальная цель исследовать циркадный ритм биологической активности, периферическую венозную или капиллярную кровь у пациентов желательно брать утром натощак в одно и то же время, в условиях физиологического покоя, что особенно важно при исследовании веществ, секреция и метаболизм которых протекает в течение суток неодинаково.

Во время процедуры взятия крови следует избегать гемолиза, который некоторым возможен при длительном венозном застое, энергичной аспирации крови шприцем, попадании в просвет иглы воды и детергентов, действии на кровь высокой и низкой температур.

2.1.1. Получение сыворотки или плазмы крови

Цельная кровь (капиллярная и венозная) используется в основном в биохимических исследованиях (определение глюкозы, показателей КЩР, определение концентрации электролитов в эритроцитах) и гематологии (исследование LE-клеток, гематокрита, на малярию, проведение стандартного клинического анализа крови). Для радиоиммуиных и иммуноферментных методов получают сыворотку или плазму.

Вопрос о том, что лучше брать для анализа - плазму или сыворотку - не имеет однозначного ответа. Некоторые исследователи предпочитают сыворотку, так как стероиды, например, из нее экстрагируются легче и полнее, чем из плазмы. Кроме того, плазма нередко образует эмульсию с органическими растворителями во время экстракции, а после замораживания и оттаивания в ней появляются хлопья фибрина, мешающие определению. Для биохимических исследований чаще используется сыворотка венозной крови, полученной у пациента при определенных условиях.

При выборе вида материала следует учитывать следующее:

1) При получении сыворотки крови возникает опасность того, что при отстаивании крови из эритроцитов интенсивно освобождаются протеолитические ферменты, которые могут разрушить определяемое вещество и повредить его меченый аналог во время инкубирования. Поэтому для определения содержания белковых соединений предпочтительно готовить плазму крови.

2) При получении плазмы часто используют гепарин или цитрат. Первый блокирует связывание антитела с антигеном, второй существенно изменяет кислотность среды, к которой чрезвычайно чувствительны некоторые вещества. Поэтому в сухую центрифужную пробирку желательно насыпать 50 мг ЭДТА на 5 мл крови (1:100). Сразу же после забора кровь перемешать с ЭДТА и отцентрифугировать. ЭДТА является слабым антикоагулянтом, блокатором протеолитических ферментов и составной частью многих буферных смесей.

2.1.2. Обработка крови для лабораторных исследований

Полученная и доставленная в лабораторию кровь должна быть быстро обработана, или подвергнута исследованию. Длительное стояние сыворотки над эритроцитами может привести к сдвигам концентраций составляющих, поэтому время стояния сыворотки над сгустком должно быть ограничено. Кроме того, биологический полураспад некоторых исследуемых веществ настолько мал, что стояние сыворотки при высокой комнатной температуре может полностью исказить полученные результаты исследования.

В начале обработки чистой сухой стеклянной палочкой сгусток крови осторожно отделяется от стенок пробирки, пробирка взвешивается и подготавливается к центрифугированию.
Подавляющее количество лабораторных образцов для исследований рекомендуется центрифугировать при +4 °С, со скоростью вращения 500 - 1000 g (1500 - 3000 об/мин) не более 15 - 20 минут. Высокая скорость вращения, как правило, приводит к гемолизу сыворотки или плазмы.

Полученную сыворотку (плазму) необходимо быстро отделить от форменных элементов крови и плотно закрыть пробирки крышкой. Если получена липемическая или гемолизированная сыворотка, образец, как правило, выбрасывается.

2.1.3. Хранение крови (плазмы, сыворотки)

Для определения большинства биологического материала считается возможным хранение его при комнатной температуре не более 6-8 часов.

Некоторые образцы разрешается хранить в течение недели при + 4°С. При необходимости хранения сыворотки (плазмы) более суток, образец рекомендуется замораживать при -20°С, что позволяет проводить исследования, например, спустя несколько месяцев - раковые маркеры, мочевину, холестерин, большинство гормонов и т.д.

При работе с кровью общим правилом должно являться немедленное отделение плазмы или сыворотки от форменных элементов, так как некоторые вещества могут поглощаться и инактивироваться эритроцитами и лейкоцитами. Но даже в простых водных растворах они спонтанно окисляются (например, кортизол превращается в 21-дезоксикортизол).

Большинство веществ биологического происхождения при низкой температуре более стабильны, чем при комнатной, поэтому их обычно хранят в замороженном состоянии. В пробах крови после ее взятия происходит огромное количество процессов. Быстро размножающиеся бактерии и ферментативный гидролиз могут кардинально изменять состояние и содержание всех компонентов. Наиболее эффективным средством замедления и предотвращения таких изменений являются замораживание и быстрое центрифугирование. Однако, даже при –20 °С биологическая система не стабильна, поскольку активность многих ферментов при этом не изменяется. Естественным следствием этого является снижение концентрации веществ при длительном хранении при - 40, -70°С. На примере АКТГ видно, что температурный режим и физико-химические параметры среды имеют решающее значение для сохранности вещества. При хранении АКТГ в течение 18 месяцев при –17 °С его активность, измеряемая биологическим методом, не изменяется. При 37 °С через 45 минут гормон инактивируется на 64 %, через один день при комнатной температуре - на 85%, при 3°С - на 58%. Но кортикотропная активность кислого экстракта аденогипофиза, полученного гомогенизацией ткани в 0,1 % соляной кислоте, сохраняется при 2°С не менее 39 дней.

Плазму или сыворотку непосредственно после получения запаивают в стеклянные ампулы или помещают во флакончики с плотно закрывающимися крышками, замораживают и хранят при температуре не выше -20°С. При таких условиях образцы пригодны для анализа в течение нескольких месяцев, иногда до года. При повторном замораживании и оттаивании происходит частичная деградация белковых веществ (соединений), в то время как для веществ с малым молекулярным весом (например, стероидные гормоны) эти процедуры не столь опасны.

Образцы крови необходимо хранить в хорошо закрытых пробирках, так как потеря в образце влаги в замороженном состоянии может привести к концентрированию исследуемого вещества и получению в итоге ошибочного результата.

По экономическим соображениям важно до госпитализации и до любых терапевтических вмешательств взять образцы плазмы или сыворотки и поместить их в банк сывороток. После установления диагноза, если нет нужды в исследовании биологического материала, и образец не нужен для исследований, он может быть изъят из банка сывороток или плазм, однако, в наличия патологического процесса (особенно опухоли) возможно повторное определение уровня исследуемых веществ или их комбинаций. Кроме того, исследуемый образец рекомендуется оставлять в банке сывороток с тем, чтобы при модификации наборов фирмой-поставщиком, можно было корректно продолжить мониторинг больного. Этот подход также может оказаться полезным, если появится новый маркер, отличающийся более высокой чувствительностью и специфичностью.

При медленном замораживании образуются кристаллы льда, которые разрывают молекулы, особенно белковые, поэтому для оптимальной стабильности вещества необходимо быстрое замораживание. Лучше всего замораживание проводить с самого начала в жидком азоте - в этой среде процесс замораживания идет намного быстрее и не сопровождается разрушением охлаждаемых веществ. Нет общих правил относительно размораживания, однако эксперименты показывают, что следует избегать теплового шока образцов. Размораживание следует производить медленно и постепенно. Некорректно переносить образец сразу же из –20 °С в комнатную температуру, особенно учитывая сезонные различия температур помещения. Важно избегать повторного замораживания образца, лучше предварительно разделить его на несколько пробирок, чтобы не было проблем в случае повтора анализа.

Размораживание и повторное замораживание повреждает практически все биологические пробы. Существует ошибочное мнение о том, что такое воздействие не влияет на тиреоидные и стероидные гормоны. Действительно, структура молекул этих гормонов лучше сохраняется в таких ситуациях. Однако следует помнить, что основной пул стероидных и тиреоидных гормонов циркулирует под “защитой” транспортных белков, которые, как и все другие белки, не выдерживают температурных перепадов и, разрушаясь, перестают “защищать” гормоны. Последние, освобождаясь, немедленно включаются в метаболическую цепь, что, в конечном итоге, ведет к искажению истинной картины.

Химическое окружение, в котором находится препарат, также является важным фактором. При хранении белков в растворах концентрация этих белков всегда должна быть больше 1 мг/мл. Известно, например, что разбавленная антисыворотка теряет активность намного быстрее, чем неразбавленная. Молекулы некоторых веществ биологического происхождения особенно легко разрушаются при окислении, поэтому их надо хранить в присутствии какого-нибудь восстановителя или в атмосфере, не содержащей кислорода.

Учитывая высокую скорость разрушения биологически активных веществ в органах и тканях, извлечение их и приготовление навесок анализа необходимо проводить в условиях постоянного охлаждения, хранить образцы только в замороженном состоянии. Предварительная обработка материала позволяет значительно увеличить его срок хранения. Например, после обработки гипофиза ацетоном первоначальный уровень гонадотропной активности сохраняется в нем при хранении в холодильнике без замораживания не менее года. Экстракты гормонов и чистые препараты сохраняются гораздо дольше, чем нативные образцы.

Известно, например, что в тканях гипоталамуса рилизинг-фактор к лютеинизирующему гормону подвергается сравнительно быстрому метаболическому разрушению. В то же время при хранении в стерильных условиях растворов синтетического ЛГ-рилизинг-гормонов в течение 18 месяцев при 40 °С он полностью сохранял свою биологическую активность и иммунореактивные свойства.

2.1.4. Получение, обработка и хранение мочи

Сбор мочи для определения биологически активных веществ проводят в течении заданных интервалов времени, чаще всего за сутки. На протяжении суток скорость образования и экскреции вещества с мочой колеблется весьма значительно, но эти колебания нивелируются при исследовании суточной порции мочи. В последнее время появляется возможность определять не в суммарной суточной моче и не суммарные вещества, а конкретные вещества и в любое время суток. Например, определение андрогена надпочечникового происхождения дегидроэпиандростерона-сульфата, или 17-окси-прегненолона, предназначенного для выявления адреногенитального синдрома.

Из рациона человека, по меньшей мере, за трое суток до сбора мочи
необходимо исключить продукты и лекарственные препараты, влияющие на
секрецию и метаболизм ряда веществ. Присутствие в моче некоторых
веществ эндогенного и экзогенного происхождения может искажать
результаты определения веществ. Сбор мочи производят в сосуды из дифферентного материала (стекла, пластмассы) во избежание разрушения вещества.

При сборе мочи также соблюдают определенные предосторожности, ли моча не содержит стабилизаторов, как, например, при определении стероидов и их метаболитов, она должна храниться до анализа в замороженном виде (как правило, не более 10 дней). Замороженную мочу со стабилизатором, предназначенную для определения катехоламинов, допускается хранить не более трех дней.

2.1.5. Получение экссудатов и транссудатов

Перед сбором экссудатов и транссудатов в посуду для сбора рекомендуется добавить 2 капли гепарина или на кончике ножа сухого цитрата натрия для предотвращения свертывания. Жидкость собирается в чистую сухую посуду и немедленно доставляется в лабораторию.

2.1.6. Сбор и хранение кала

Для исключения возможных погрешностей в диагностике запрещено доставлять кал после использования клизм, введения свечей, приема внутрь касторового и вазелинового масел и красящих веществ. Кал, взятый для исследования на дисбактериоз, должен быть срочно доставлен в лабораторию, или поставлен в холодильник при 4°С. При исследовании на простейшие запрещено сохранять кал в термостате или теплой воде, поскольку при этом происходит гибель и регенеративные изменения простейших.

2.1.7. Сбор и хранение мокроты

Мокроту рекомендуется собирать при кашле в сухую чистую посуду не более суток, так как при длительном хранении происходит разложение флоры и аутолиз элементов мокроты. Кратковременное хранение ее рекомендуется проводить в холодильнике при 4°С. Для бактериологических исследований мокрота не должна стоять более 4 часов с момента получения.

2.1.8. Сбор и хранение ликвора

Спинномозговая жидкость (ликвор), полученная при люмбальной пункции или пункции желудочков мозга, собирается в сухую чистую посуду и доставляется в лабораторию немедленно, так как при хранении в связи с разрушением клеточных элементов результат исследования может быть недостоверным.

2.2. Обработка лабораторной посуды

В специальных пособиях приводится много советов по тех лабораторных работ, поэтому мы ограничимся лишь некоторыми рекомендациями, имеющими существенное значение для постановки реакции и получения высококачественного результата в радиоиммунных и иммуноферментных методах диагностики. При работе с буферными системами, органическими растворителями и другими веществами, применяемыми для постановки реакции, особое внимание нужно обращать на чистоту реактивов. Вода для буферного раствора должна быть бидистиллированной и деионизированной. Органические растворители, как правило, подлежат очистке (например, эфир пропускается через колонку с оксидом алюминия) и двойной перегонке с дефлегматором (напр., при получении абсолютного этанола).

Лабораторная посуда должна быть тщательно обрабатывается механическими и химическими способами.

Приготовление моющего раствора:

на 1 л дистиллированной воды 20 г порошка типа "Лотос".

Приготовление хромовой смеси:

в фарфоровом стакане растворяют 50 г бихромата калия (K 2 Cr 2 O 7 ) в 100 мл воды. Раствор сливают в сосуд большего размера и добавляют (очень осторожно) 1 л серной кислоты (концентрированной).

Внимание! Добавлять серную кислоту в раствор, но не наоборот!

2.2.1. Обработка посуды с низкой радиоактивностью

Флаконы - снять надписи с крышек ватой, смоченной в спирте, снять крышки в коробку с надписью “грязные крышки”, слить из флаконов сцинтилляционную жидкость в сосуд для жидких радиоактивных отходов, под струей горячей воды прополоскать флаконы от толуола (до исчезновения запаха), загрузить в бак с моющим раствором, оставить на ночь. На следующий день промыть флаконы сначала под струей холодной воды (налить-вылить 10-15 раз), затем также под струей горячей воды и окончательно под струей дистиллированной воды. Сушить в сушильном шкафу при температуре 150-200 °С вниз горлышком.

Пробирки - снять надписи ватой, смоченной спиртом, промыть под струей горячей воды (налить-вылить 10-15 раз), высушить в термостате или сушильном шкафу при температуре до 150 °С, дать остыть и загрузить в (хромовую смесь на 2-3 часа, (БУДЬТЕ ПРЕДЕЛЬНО ОСТОРОЖНЫ!) , вынуть их из хромовой смеси и промыть как флаконы (см. выше).

Крышки - тщательно протираются ватой, смоченной спиртом (два тампона на крышку), высушиваются при комнатной температуре и хранятся в коробке с надписью “чистые крышки”.

2.2.2. Обработка посуды с высокой радиоактивностью

Флаконы - обрабатывать 96° спиртом: заполнить флакон спиртом, перелить спирт во второй флакон, затем в третий, . в десятый, слить в сосуд для жидких радиоактивных отходов. Процедуру повторить. Последующая обработка флаконов аналогична обработке флаконов с низкой активностью. Крышки загрузить в сосуд, залить ацетоном или 96° спиртом с полным погружением крышек, перемешать 3-5 мин, стеклянной палочкой, жидкость слить в емкость для радиоактивных отходов. Процедуру повторить. Разложить на фильтровальной бумаге в один слой и сушить в вытяжном шкафу. Хранить в коробке с надписью “чистые пробирки”.

Все вышеописанные работы проводить только в вытяжном шкафу при полном отсутствии открытого огня.

Для выполнения биохимических исследований в лаборатории посуда проходит определенный цикл обработки в соответствии с требованиями санитарно-гигиенических и противоэпидемических служб. При выполнении в лабораториях коагулологических исследований или проведения исследований определения ряда пептидных гормонов биологическими методами помимо обычной чистой стеклянной посуды используют силиконированную посуду для взятия и хранения крови и плазмы.

2.2.3. Силиконирование посуды

Силиконирование посуды осуществляют для предотвращения контаминации исследуемого образца со стеклом, в котором проводят химическую реакцию. Силиконирование тормозит активацию свертывания крови, предохраняя распад некоторых веществ (например, пептидных гормонов) при инкубации их со встряхиванием.

Стекло покрывается мономолекулярной пленкой силикона:

5% раствор дихлордиметилсилана в толуоле. Чистая сухая посуда заполняется раствором и сразу же выливается. Силиконирование проводят в вытяжном шкафу, затем проводят сушку посуды в сушильном шкафу 180°С в течение часа.

Раствор для силиконирования хранят в посуде с притертой пробкой
в вытяжном шкафу.

Использовать силиконированную посуду не более 5 раз, затем силиконирование необходимо повторить.

Читайте также: