Молекулярно генетические методы в диагностике вич

Что такое молекулярно-генетическая диагностика

Итак, молекулярно-генетическая диагностика — сравнительно новый метод обследования организма, позволяющий точно и быстро выявить вирусы и инфекции, мутации генов, вызывающих патологию, оценить риски наследственных и иных заболеваний. И это далеко не полный спектр возможностей исследования ДНК.

Важнейшим достоинством молекулярно-генетической диагностики является минимальная степень медицинского вмешательства, поскольку исследование проводят in vitro. Метод успешно применяют даже для диагностики заболеваний у эмбрионов, а также у ослабленных и тяжелобольных пациентов. Самый распространенный материал для исследования — кровь из вены, однако возможно выделение ДНК/РНК из других жидкостей и тканей: слюны, соскоба слизистой рта, выделений из половых органов, околоплодной жидкости, волос, ногтей и т.д.

Молекулярная диагностика — значительный шаг к персонализированной медицине, она позволяет учитывать все особенности конкретного пациента при обследовании и терапии.

Итак, исследование ДНК/РНК используется во многих разделах медицины. Давайте рассмотрим задачи и области, в которых активно применяют молекулярную диагностику:

• Выявление существующих патологий. Например, к молекулярной диагностике прибегают в тех случаях, когда инфекционное или вирусное заболевание не может быть определено обычными методами. Она позволяет обнаружить болезнь даже на ранней стадии, когда внешних проявлений нет.
• Исследование аллергических реакций. Молекулярная диагностика успешно применяется для определения аллергии: в отличие от традиционных методов, она более точна и при этом безопасна для пациента, так как отсутствует непосредственный контакт с аллергеном.
• Индивидуальная оценка рисков развития наследственных заболеваний. Молекулярная диагностика помогает выявить у взрослых и детей опасность в будущем подвергнуться различным патологиям. Нужно отметить, что есть болезни, которые вызваны исключительно мутацией гена (моногенные) и те, которые обусловлены в том числе генетическими особенностями (мультифакторные). Информация о первых позволяет, к примеру, оценить риски передачи наследственных заболеваний от родителей к ребенку. Знание о предрасположенности к мультифакторной патологии необходимо еще и для профилактики болезней с помощью изменения образа жизни.
• Перинатальная медицина. Как уже было сказано, молекулярная диагностика способна дать информацию о состоянии здоровья и генетических предрасположенностях человека. Это относится и к эмбрионам: анализ ДНК еще не родившегося ребенка позволяет распознать синдромы Дауна, Эдвардса, Патау, Тернера, Клайнфельтера. Также молекулярная диагностика применяется в области вспомогательных репродуктивных технологий: она позволяет установить генетические причины бесплодия и невынашивания беременности.
• Фармакогенетика. Молекулярная диагностика объясняет, почему на некоторых действуют одни препараты, а на других — иные: все дело в генетических особенностях пациентов. Возможность определения эффективности веществ имеет особое значение при лечении тяжелых заболеваний, например, онкологических.
• Спортивная медицина. Настоящие чудеса исследования ДНК и РНК творят и в области оценки спортивных перспектив. Например, родители малышей могут узнать о том, какой вид занятий принесет ребенку наибольшую пользу для здоровья или позволит достичь спортивных результатов.

Итак, обращение к генетическим исследованиям актуально в тех случаях, когда пациент стремится получить сведения о состоянии своего организма. Обычно это необходимо в следующих ситуациях:

Отдельной группой стоит выделить исследования ДНК, которые проводят в связи с планированием или рождением ребенка. Чаще всего родители обращаются в лабораторию, чтобы:

• изучить свою генетическую совместимость, оценить риски наследственных заболеваний потомства;
• исследовать состояние плода, выявить синдромы и опасные патологии;
• диагностировать заболевания (и оценить риски) и аллергические реакции у малыша;
• определить, какие спортивные занятия, какое питание и образ жизни будут наиболее полезны для ребенка, а чего стоит избегать;
• установить отцовство или материнство.

Независимо от выбранного метода молекулярно-генетического исследования, оно будет включать в себя следующие этапы:

• взятие биоматериала. Как уже было сказано, чаще для исследования используют кровь пациента. Полученный материал маркируют и транспортируют в лабораторию;
• выделение ДНК/РНК;
• проведение исследований в соответствии с выбранным методом;
• изучение и интерпретацию результатов;
• выдачу заключения.

Цитогенетический анализ позволяет выявить наследственные заболевания, психические отклонения, врожденные пороки развития. Суть метода — в изучении хромосом с помощью специальных микроматриц, нанесенных на ДНК-чипы. Для этого из образца крови выделяют лимфоциты, которые затем помещают на 48–72 часа в питательную среду и по истечении этого времени исследуют. Назначают такой анализ нечасто, в основном для изучения причин бесплодия и невынашивания беременности, для уточнения диагноза у детей при подозрении на врожденные заболевания. Анализ очень точен, но достаточно трудоемок и длителен (результат можно получить лишь через 20–30 дней после сдачи).

Достоинство и в то же время недостаток метода — в его специфичности: цитогенетика может выявить лишь небольшое количество патологий (например, аутизм), однако делает это практически без погрешностей.

Полимеразная цепная реакция — метод, изобретенный в 1983 году, по сей день самый популярный и фундаментальный в молекулярной диагностике. Характеризуется высочайшей точностью и чувствительностью, а также скоростью проведения исследования. Молекулярная диагностика ДНК/РНК методом ПЦР позволяет выявить такие патологии, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие.

Для анализа выбирают участок ДНК и многократно дублируют его в лаборатории с помощью специальных веществ. Для диагностики подходит большой перечень биоматериалов: кровь, слюна, моча, выделения из половых органов, плевральная и спинномозговая жидкость, ткани плаценты и т.д.

В данном молекулярном методе объектом исследования становятся уникальные нуклеотидные соединения отдельно взятой хромосомы или ее участок. Для этого используются меченые флуоресцентными маркерами короткие ДНК-последовательности (зонды), которые позволяют выявить фрагменты с атипичными генами. Биоматериал для анализа может быть любой: кровь, костный мозг, плацента, ткани эмбриона, биопсия и т.д. Важно, чтобы образец был доставлен в лабораторию сразу после его изъятия.

Метод особенно активно используют в онкологии (например, для наблюдения за остаточными злокачественными клетками после химиотерапии), а также в пренатальной диагностике (для определения риска развития у плода врожденных пороков), гематологии. FISH-метод очень чувствителен и точен для выявления поврежденных фрагментов ДНК (погрешность около 0,5%), при этом достаточно быстр: результат придется ждать не более 72-х часов. Однако у него есть и недостатки: FISH еще более специфичен, чем микроматричный цитогенетический анализ, и может служить лишь для подтверждения или опровержения предполагаемого диагноза.

Этот метод похож на предыдущий — здесь так же используются меченные флуоресцентом последовательности ДНК. Однако эти зонды сначала выделяют из проб, полученных от пациента, и затем сравнивают с образцами, нанесенными на микрочипы. ДНК-микрочип представляет собой основание (стеклянное, пластиковое, гелевое), на которое может быть нанесено до нескольких тысяч микротестов длиной от 25 до 1000 нуклеотидов. Полученные после очистки биоматериала пробы (зонды) совмещают с микротестами на чипе и наблюдают за реакцией маркёров. Результаты исследования готовы через 4–6 дней после забора материала.

Для анализа используется любой биоматериал, из которого можно получить образец ДНК/РНК. Используют такой метод в онкологии и кардиологии (в том числе для изучения генетической предрасположенности), он точен и чувствителен, однако в России его применяют редко — в этом его главный минус.

Итак, молекулярная диагностика — неинвазивный и точный метод обследования организма с широким спектром применения в разных областях медицины. Если на Западе исследования ДНК/РНК уже распространены повсеместно, то в России подобную услугу предлагают далеко не все клиники.

Се­год­ня ме­ди­ци­на по­зво­ля­ет уже во вре­мя пла­ни­ро­ва­ния бе­ре­мен­нос­ти узнать о воз­мож­ных рис­ках для бу­ду­ще­го ма­лы­ша, по­это­му не по­жа­лей­те вре­ме­ни и средств — прой­ди­те ге­не­ти­чес­кое ис­сле­до­ва­ние еще до за­ча­тия ре­бен­ка или, если бе­ре­мен­ность ста­ла для вас сюр­п­ри­зом, во вре­мя вы­на­ши­ва­ния. Так вы смо­же­те из­бе­жать мно­жест­ва про­блем для се­бя и для ма­лы­ша в бу­ду­щем.

ПЦР как эффективный метод в борьбе с распространением ВИЧ-инфекции

Недостатком серологической диагностики являются также ложноположительные результаты, из-за чего для уточнения диагноза требуется подтверждающий тест - ИБ, который отличается большей специфичностью и достаточно высокой стоимостью (около 20-40$). Метод ИБ также может давать сомнительные результаты (в 4-20% случаев). Это приводит к удорожанию диагностики и отсрочке постановки диагноза.

Диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей

Несмотря на то, что дети подвергаются высокому риску заражения ВИЧ внутриутробно, во время родов и при кормлении грудью, далеко не каждый ребенок, рожденный инфицированной женщиной, заражен ВИЧ. При отсутствии профилактических мер риск передачи ВИЧ от матери ребенку, находящемуся на искусственном вскармливании, составляет 15-30%; грудное вскармливание повышает риск до 20-45%. На сегодняшний день разработаны эффективные методы профилактики вертикальной передачи ВИЧ: антиретровирусная терапия, которая проводится матери во время беременности и родов и ребенку в первые недели жизни; акушерские вмешательства, включая плановое кесарево сечение; отказ от грудного вскармливания. Там, где эти методы доступны и применяются, частоту передачи ВИЧ от матери ребенку удается снизить до 1-2%.

Диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, затруднена тем, что до 15-18 месяцев жизни у них обнаруживаются материнские антитела ВИЧ, не позволяющие провести достоверную диагностику серологическими методами. По существующим в России рекомендациям постановка или снятие диагноза ВИЧ-инфекции детям, рожденным от ВИЧ-инфицированных матерей, проводится на основании результатов серологического обследования в возрасте не ранее 18 месяцев.

Проблема более ранней диагностики ВИЧ-инфекции у новорожденных детей была решена с появлением молекулярно-генетических методов, позволяющих выявлять фрагменты генома ВИЧ в периферической крови на ранних сроках инфицирования. Было показано, что у большинства инфицированных детей провирусная ДНК ВИЧ определяется к 1 месяцу жизни и практически у всех - к 6 месяцу. На основании этих данных рекомендуется провести ПЦР на ДНК провируса ВИЧ в течение 48 часов после рождения. Пуповинная кровь для исследования не пригодна из-за возможного содержания в ней материнской крови. Второе исследование на ДНК провируса ВИЧ проводят на 6-8-й неделе жизни ребенка независимо от результата первого исследования. Окончательный вывод о наличии или отсутствии ВИЧ-инфекции делают не позднее 6 месяца жизни ребенка.

Информация для заказа:

Инфекционная безопасность донорской крови

Набор реагентов АмплиСенсÒHCV/HBV/HIV-FL был разработан специально для обеспечения биологической безопасности при переливании крови, трансплантациях и производстве препаратов, содержащих компоненты крови. Рекомендуемым материалом для исследования являются образцы плазмы крови и их пулы. Возможно проведение анализа других видов клинического материала (сыворотка, компоненты крови, биоптаты).

Аналитические характеристики набора АмплиСенс® HCV/HBV/HIV-FL:

Название

Особенности

Тестов

Объём экстракции, мкл	Аналитическая чувствительность
	HCV, ME/мл	HBV, ME/мл	HIV-1, копий/мл	HIV-2, копий/мл
100	100	50	200	600
200	50	25	100	300
1000	10	5	20	60

Информация для заказа:

Вирусная нагрузка ВИЧ — самый ранний показатель успеха или неудачи лечения

Количественное определение РНК ВИЧ в плазме крови (определение вирусной нагрузки) - обязательная процедура, которая проводится при постановке диагноза ВИЧ-инфекции, а также на этапе назначения противовирусной терапии и дальнейшего мониторинга эффективности терапии.

Вирусная нагрузка - самый ранний показатель успеха или неудачи лечения, который почти на месяц опережает изменение числа лимфоцитов CD4. Статистически значимым изменением вирусной нагрузки считают изменение более чем в 3 раза или более чем на 0,5 lg. Первое исследование на вирусную нагрузку после начала терапии необходимо провести через 4-8 недель. Вирусологическими критериями эффективности терапии считают снижение вирусной нагрузки более чем на 0,5 lg через 4 недели и более чем на 1 lg через 8 недель лечения. Если вирусная нагрузка не снизилась до уровня менее 400 копий/мл к 24-й неделе лечения или до уровня менее 50 копий/мл к 48-й неделе лечения, это указывает на неполноценный ответ.

Информация для заказа:

Лекарственная устойчивость ВИЧ

Лекарственная устойчивость ВИЧ к антиретровирусным препаратам

Применение антиретровирусной терапии в лечении ВИЧ-инфекции значительно повысило качество и продолжительность жизни ВИЧ-инфицированных пациентов. Основной принцип действия антиретровирусной терапии - направленное ингибирование основных этапов жизненного цикла ВИЧ. Антиретровирусные препараты группируются по классам в зависимости от того, на каком этапе жизненного цикла вируса они действуют. Для лечения ВИЧ-инфекции наиболее часто используются препараты, относящиеся к классам ингибиторов протеазы и ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ. Третьей ферментативной мишенью антиретровирусной терапии является интеграза ВИЧ. Кроме вышеуказанных классов в России зарегистрированы также ингибиторы интегразы и ингибиторы слияния. При лечении ВИЧ-инфекции антиретровирусные препараты назначаются согласно определенным схемам. В каждую схему входят препараты нескольких классов.

Со временем у значительной части пациентов применяемая схема антиретровирусной терапии становится неэффективной, и одной из основных причин является развитие устойчивости ВИЧ к используемым препаратам.

Для определения лекарственной устойчивости ВИЧ исследуют нуклеотидную последовательность генов обратной транскриптазы (rev), протеазы (pro) и интегразы (int).

Недавно стал доступен класс препаратов, препятствующих присоединению вирусной частицы к клетке-мишени, путем воздействия на CCR5-корецептор. Первым зарегистрированным препаратом данного класса является Маравирок (Maraviroc).

Различные штаммы ВИЧ используют в качестве корецептора рецепторы CCR5 или CXCR4. Штаммы, использующие CCR5, называют RS-тропными, CXCR4 - Х4-тропными, варианты вируса использующие оба типа - R5/ Х4-тропными. Являясь CCR5-aнтaгoнистом, Маравирок действует эффективно только на CCR5-тропные вирусы.

Соответственно, перед включением Маравирока в состав антиретровирусной терапии необходимо определить тропизм вируса у пациента. За тропизм отвечает небольшой участок гена оболочки ВИЧ (env), который называется V3-петлей.

Информация для заказа:

Название	Особенности	Исследуемые гены	Тестов	Кат.№
АмплиСенс® HIV-Resist-Seq	содержит реагенты для экстракции РНК и ДНК; содержит реагенты для проведения реакции секвенирования, адаптирован к секвенаторам Applied Biosystems (ABI)	pro, rev	50	TM-V0-50-F-1-S
		pro, rev, int	50	TM-V0-50-F-2-S
		env	50	TM-V0-50-F-3-S
		pro, rev, int, env	50	TM-V0-50-F-4-S
	содержит реагенты для экстракции РНК и ДНК; не содержит реагенты для проведения реакции секвенирования; адаптирован к секвенаторам Applied Biosystems (ABI) и Beckman Coulter	pro, rev	50	TM-V0-50-F-5
		pro, rev, int	50	TM-V0-50-F-6
		env	50	TM-V0-50-F-7
		pro, rev, int, env	50	TM-V0-50-F-8

Гиперчувствительность к абакавиру (выявление аллеля HLA B*5701)

Выявление аллеля HLA B*5701 - единственное на сегодняшний день фармакогенетическое исследование, рекомендованное ВИЧ-инфицированным лицам; используется для прогноза развития реакции гиперчувствительности к абакавиру.

Абакавир – нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы, применяемый с другими антиретровирусными препаратами для лечения ВИЧ-инфекции. Наибольшим недостатком абакавира, который ограничивает его использование, является возникновение реакции гиперчувствительности, которое возникает у 5–8% пациентов в течение первых 6 недель лечения. Симптомы гиперчувствительности к абакавиру неспецифичны и трудноотличимы от сопутствующей терапии, реакции на другие лекарственные средства или воспаления. В настоящий момент доказана связь между возникновением гиперчувствительности к абакавиру и наличием у пациента аллеля В*5701 главного комплекса гистосовместимости I-го класса. В настоящее время рекомендуется проведение тестирования пациента на наличие у него аллеля В*5701 при начале терапии вне зависимости от ее схемы. Набор реагентов АмплиСенс® Геноскрин HLA B*5701-FL позволяет выявлять аллель HLA B*5701 в образцах ДНК, выделенной из крови или буккального эпителия - соскоба эпителиальных клеток с внутренней стороны щеки.

Информация для заказа:

Нормативные документы и публикации о ВИЧ>>

Руководитель учреждения – главный врач Петрунин Михаил Юрьевич

Заместитель главного врача по медицинской части - Дякина Кира Владимировна

Главный бухгалтер – Смирнова Анна Владимировна

Заведующая отделением – Макарова Лидия Николаевна

1. диспансерное наблюдение и лечение ВИЧ-инфицированных пациентов Костромской области. Назначение антиретровирусных препаратов осуществляется на основании решения Врачебной комиссии Центра. Специфическая терапия назначается пожизненно, сопровождается клинико-лабораторным мониторингом эффективности и безопасности лечения.
2. диагностика и оказание высококвалифицированной, специализированной, консультативно-диагностической, профилактической и лечебной помощи больным инфекционными заболеваниями, ВИЧ-инфекцией и сочетанных с ВИЧ-инфекцией заболеваний, с применением высокоэффективных медицинских технологий.
3. наблюдение детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, диспансерное наблюдение и лечение ВИЧ-инфицированных детей. Проводятся мероприятия по профилактике передачи ВИЧ-инфекции от матери ребенку (как организационные, так и химиопрофилактика), консультирование по планированию беременности.
4. организован прием врачей акушера-гинеколога, врача-педиатра, врача- невролога, врача-дерматолога, врача-фтизиатра.

Заведующий отделением – Егоров Андрей Николаевич

оказание специализированной лечебно-диагностической помощи в условиях дневного стационара больным вирусными гепатитами;

ведение Регистра больных с хроническими вирусными гепатитами;

Заведующая лабораторией – Вдовина Ирина Евгеньевна

Клинико-диагностическая лаборатория оснащена современным оборудованием и полностью автоматизированными анализаторами. Подобное оснащение позволяет проводить лабораторную диагностику пациентов в объемах, регламентированных стандартами оказания медицинской помощи ВИЧ-инфицированным.

Основные направления лабораторной диагностики ВИЧ-инфицированных пациентов Костромской области:

1. Молекулярно-генетические методы исследований:
   • определение вирусной нагрузки ВИЧ в плазме крови;
   • определение вирусной нагрузки гепатита С в плазме крови с определением генотипа вируса;
   • определение вирусной нагрузки гепатита В;
   • количественное определение цитомегаловируса в плазме крови;
   • определение вируса папилломы человека с установлением генотипов высокого канцерогенного риска;
   • определение панели герпес-вирусных инфекций;
   • фармакогенетические исследования – определение генетической предрасположенности к развитию возможных осложнений от проводимой антиретровирусной терапии.
   Указанные исследования проводятся методом ПЦР в режиме реального времени и позволяют осуществлять мониторинг течения ВИЧ-инфекции, оценивать эффективность АРВТ и своевременно диагностировать и назначать терапию сопутствующих и оппортунистических инфекций, характерных для ВИЧ-инфицированных пациентов.
2. Иммунофенотипические исследования проводятся на проточных цитофлюориметрах последнего поколения. Эти исследования позволяют оценивать иммунный статус пациентов, в частности, мониторировать количество CD45/CD4/CD3 Т-хелперных клеток. Полученные результаты помогают судить о состоянии Т-клеточного звена иммунитета, обычно страдающего при ВИЧ-инфекции.
3. Генотипические исследования проводятся методом секвенирования по Сэнглеру. Они позволяют определить наличие резистентных к проводимой антиретровирусной терапии штаммов в организме ВИЧ-инфицированного, что, в свою очередь, дает возможность своевременно скорректировать схемы терапии, приведшие к вирусологической неудаче.
4. Иммунохимические, биохимические, гематологические и другие общеклинические исследования позволяют получить дополнительную важную информацию о состоянии здоровья ВИЧ-инфицированного пациента и, с учетом этих многочисленных данных, подобрать адекватную схему терапии и своевременно начать лечение.

Заведующий отделением – Халезов Владимир Николаевич

1. - сбор оперативной и статистической информации, анализ и оценка эпидемической ситуации, мероприятий по профилактике ВИЧ-инфекции в Костромской области;
2. - проведение мероприятий по профилактике ВИЧ-инфекции среди наиболее уязвимых групп населения;
3. - проведение анализа эпидемиологической ситуации и эффективности противоэпидемических мероприятий;
4. - оказание помощи в решении правовых, социальных и реабилитационных вопросов в отношении ВИЧ-инфицированных;
5. - подготовка и издание информационных и аналитических материалов по вопросам эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики ВИЧ- инфекции, хронических вирусных гепатитов;
6. - организация и проведение мероприятий по информированию населения о доступных мерах профилактики инфекционных заболеваний, вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции в Костромской области;
7. - организация и проведение мероприятий по подготовке специалистов учреждений здравоохранения по вопросам эпидемиологии, диагностики и профилактики инфекционных заболеваний, вирусных гепатитов, ВИЧ- инфекции;
8. - проведение совещаний, семинаров, научно-практических конференций по актуальным вопросам эпидемиологии, профилактики и диагностики инфекционных заболеваний, вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции.

В настоящее время новые диагностические технологии позволяют выявить этиологические и патогенетические причины многих заболеваний и коренным образом повлиять на результаты лечения. Пожалуй, наиболее впечатляющие результаты внедрения этих технологий в клиническую практику достигнуты в области иммунологии и диагностики инфекционных заболеваний.

Для исследования может быть использован различный биологический материал: сыворотка, плазма крови, соскоб, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость (СМЖ). В первую очередь, методы лабораторной диагностики инфекций направлены на выявление таких заболеваний, как вирусный гепатит В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекции, передающиеся половым путем (гонорейная, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная), туберкулез, ВИЧ-инфекция и др.

ВИЧ-инфекция – заболевание, вызываемое вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), длительное время персистирующего в лимфоцитах, макрофагах, клетках нервной ткани, в результате чего развивается медленно прогрессирующее поражение иммунной и нервной систем организма, проявляющееся вторичными инфекциями, опухолями, подострым энцефалитом и другими патологическими изменениями.

Возбудители инфекции – вирусы иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов (ВИЧ-1, ВИЧ-2) – относятся к семейству ретровирусов, подсемейству медленных вирусов. Вирионы являются сферическими частицами диаметром 100–140 нм. Вирусная частица имеет наружную фосфолипидную оболочку, включающую гликопротеиды (структурные белки) с определенной молекулярной массой, измеряемой в килодальтонах. У ВИЧ-1 – это gpl60, gpl20, gp41. Внутренняя оболочка вируса, покрывающая ядро, также представлена белками с известной молекулярной массой – р17, р24, р55 (ВИЧ-2 содержит gpl40, gpl05, gp36, р16, р25, р55).

В состав генома ВИЧ входит РНК и фермент обратная транскриптаза (ревертаза). Для того чтобы геном ретровируса соединился с геномом клетки хозяина, вначале с помощью ревертазы происходит синтез ДНК на матрице вирусной РНК. Затем ДНК провируса встраивается в геном клетки-хозяина. ВИЧ обладает выраженной антигенной изменчивостью, значительно превышающей таковую у вируса гриппа.

В организме человека основной мишенью ВИЧ являются Т-лимфоциты, несущие на поверхности наибольшее количество СD4-рецепторов. После проникновения ВИЧ в клетку с помощью ревертазы по образцу своей РНК вирус синтезирует ДНК, которая встраивается в генетический аппарат клетки-хозяина (СD4-лимфоциты) и остается там пожизненно в состоянии провируса. Помимо Т-лимфоцитовхелперов поражаются макрофаги, В-лимфоциты, клетки нейроглии, слизистой оболочки кишечника и некоторые другие клетки. Причиной снижения количества Т-лимфоцитов (клетки CD4) является не только прямое цитопатическое действие вируса, но и их слияние с неинфицированными клетками. Наряду с поражением Т-лимфоцитов у больных с ВИЧ-инфекцией отмечается поликлональная активация B-лимфоцитов с увеличением синтеза иммуноглобулинов всех классов, особенно IgG и IgA, и последующим истощением этого отдела иммунной системы. Нарушение регуляции иммунных процессов проявляется также повышением уровня α-интерферона, β2-микроглобулина, снижением уровня IL-2. В результате нарушения функции иммунной системы, особенно при снижении числа Т- лимфоцитов (CD4) до 400 клеток в 1 мкл крови и менее, возникают условия для неконтролируемой репликации ВИЧ со значительным увеличением количества вирионов в различных средах организма. В результате поражения многих звеньев иммунной системы человек, зараженный ВИЧ, становится беззащитным перед возбудителями различных инфекций.

На фоне нарастающей иммунодепрессии развиваются тяжелые прогрессирующие заболевания, которые не встречаются у человека с нормально функционирующей иммунной системой. Это заболевания, которые Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определила как СПИД-маркерные или СПИД-индикаторные заболевания.

СПИД-индикаторные заболевания

Первая группа – заболевания, присущие только тяжелому иммунодефициту (уровень СD4 74 100 копий/мл почти у всех пациентов развивается клиническая картина СПИДа (Senior D., Holden Е., 1996).

Вероятность развития СПИДа в 10,8 раз выше у лиц с содержанием ВИЧ-1 в крови >10 000 копий/мл, чем у лиц с содержанием ВИЧ-1 в крови 20 000 копий/мл (ПЦР). Оценка результатов антиретровирусной терапии у лиц, инфицированных ВИЧ, проводится по снижению уровня сывороточной РНК ВИЧ.

При эффективном лечении уровень виремии должен снижаться в 10 раз в течение первых 8 недель и быть ниже предела чувствительности метода (ПЦР) (

С целью разработки комплекса диагностических тест-систем для быстрого выявления микобактерий туберкулеза и определения их устойчивых к антибиотикам форм создан международный консорциум, в котором Россию представляют компания "Центр перспективных технологий", МГУ им. М.В.Ломоносова и ЦНИИ туберкулеза. Планируется разработать несколько тест-систем для комплексной диагностики с применением молекулярно-генетических и иммунологических методов мультианализа микобактерий на биочипах.

Последние десятилетия во многих странах мира, независимо от их экономического статуса и уровня жизни населения, отмечает­ся неуклонный рост заболеваемости туберкулезом (ТБ). Поэтому разработка новых методов диагностики и лечения ТБ продолжает оставаться актуальной. По данным ВОЗ [1, 2] совершенствование этих методов позволило добиться снижения смертности на 45% за период с 1990 по 2013 годы, что в абсолютных значениях составляет десятки миллионов спасенных человеческих жизней. Однако показатели по-прежнему угрожающие: по оценкам ВОЗ в 2013 году 9 млн. человек заболели туберкулезом, причем около 64% случаев заболевания были выявлены впервые. Смертность в 2013 году составила 1,5 млн. человек. Особую опасность представляют сочетание ТБ- и ВИЧ-инфекций, которые сложнее диагностировать и лечить. Около 1,1 млн. (13%) всех ТБ-больных инфицированы ВИЧ.

Существенной проблемой является устойчивость микобактерий ТБ (M.tuberculosis) к действию антибиотиков – основного средства лечения этого заболевания [3, 4]. В настоящее время выделяют следующие виды устойчивости: •множественную лекарственную устойчивость (МЛУ, англ. – multiple drug resistance, MDR) – устойчивость возбудителя ТБ к основным антибиотикам первого ряда (изониазид, рифампицин);
•широкую лекарственную устойчивость (ШЛУ, англ. – extensively drug resistance, XDR) – сочетанную устойчивость к антибиотикам первого и второго ряда (изониазид, рифампицин, фторхинолоны, аминогликозиды и др.).
Устойчивость связана с мутациями в определенных генах микобактерий, причем каждый конкретный тип устойчивости обусловлен наличием нескольких мутаций.

Исследование в разных регионах мира обнаружило более половины устойчивых возбудителей ТБ в трех странах: Индии, Китае и России. Неадекватное лечение может вызвать селективный отбор резистентных штаммов. С клинической точки зрения причинами возникновения резистентных штаммов являются поздняя диагностика первичной лекарственной устойчивости возбудителя, неадекватное или незавершенное предыдущее лечение. ШЛУ ТБ – наиболее сложный для лечения вид резистентности. Факторами риска развития ШЛУ являются первичная МЛУ, распространенный двухсторонний процесс в легких, более трех курсов химиотерапии туберкулеза в анамнезе и применение противотуберкулезных препаратов резервного ряда в предыдущих курсах химиотерапии.

Россия относится к странам с высокой заболеваемостью ТБ. Существенной и наиболее важной проблемой в развитии туберкулезной эпидемии являются распространяющиеся среди населения штаммы, устойчивые к большинству препаратов, применяемых в противотуберкулезной терапии. Особую опасность представляет рост доли ШЛУ ТБ с 4,9 до 20% [1]. Эти пациенты представляют собой опасный "резервуар" устойчивых инфекций, на которые не действуют известные антибиотики. Возникает серьезная угроза неконтролируемого распространения штаммов микобактерий, обладающих ШЛУ. Заболевание передается воздушно-капельным путем, что создает угрозу его распространения в крупных городах с высокой плотностью населения и большими потоками мигрантов, значительная часть которых не обследована. Поэтому так важно воспрепятствовать увеличению случаев заболевания тяжелыми формами ТБ, которые характеризуются высокой смертностью.

Поскольку лекарственная резистентность обусловлена мутациями в генах микобактерий ТБ, перспективным является применение методов молекулярно-генетического анализа. В последние годы активно развиваются технологии секвенирования и мультиплексного молекулярно-генетического анализа: мультиплексная ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, ПЦР с дальнейшей гибридизацией на биочипах различного типа [5–7]. Секвенирование в основном используется в научных исследованиях, так как для практического применения в клинических лабораториях эта технология сложна, характеризуется высокой стоимостью оборудования и имеет ограничения, связанные с вероятностью ложных результатов.

Разнообразие форм устойчивости и наличие штаммов, резистентных одновременно к нескольким препаратам, требуют развития технологий мультианализа микобактерий туберкулеза на биочипах для ускоренного обнаружения возбудителя и определения его устойчивости к антибиотикам как первого, так и второго ряда в одном анализе. Мультиплексный анализ на биочипах позволяет выявить десятки, сотни и даже тысячи видоспецифичных генетических последовательностей, а также генетических вариаций, определяющих резистентность микобактерий к антибактериальной терапии.

Компания "Центр перспективных технологий", МГУ им. М.В. Ломоносова и ЦНИИ туберкулеза участвуют в международном проекте "Мульти-ТБ" по созданию биочипа, позво­ляющего идентифицировать множество генов и наличие мутаций в них в одном анализе. Иностранные партнеры проекта представлены немецкой научной группой биоаналитики и биопроцессов Института клеточной терапии и иммунологии общества Фраунхофера (Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, Branch Bioanalytics and Bioprocesses) и немецкой компанией LIONEX Diagnostics & Therapeutics. Задачей международного консорциума является разработка комплекса диагностических тест-систем для быстрого выявления микобактерий ТБ и определения их устойчивых к антибиотикам форм на основе молекулярно-генетической и иммунологической диагностики. В рамках проекта предполагается создать несколько типов диагностических систем.

Все разработанные к настоящему времени и зарегистрированные для практического применения методы имеют ограничения, связанные с недостаточной мультиплексностью или сложностью и высокой стоимостью анализа. Ни один из методов не позволяет одновременно выявлять микобактерии ТБ и определять их устойчивость к препаратам как первого, так и второго ряда. Как правило, технологии, обеспечивающие высокую мультиплексность, являются трудоемкими, длительными по времени и требуют дорогостоящих компонентов и оборудования, что ограничивает их применение в реальной практике.

В проекте "Мульти-ТБ" планируется разработать несколько диагностических тест-систем, которые позволят проводить комплексную диагностику в три этапа. Первый этап предполагает быстрый анализ мокроты, который позволит обнаружить микобактерии в течение нескольких минут с использованием специфических антител, меченных наночастицами золота. Для подтверждения положительных результатов будет разработана тест-система на основе биочип-картриджа, сочетающего мультианализ на биочипе и флюидные технологии. В качестве специфических реагентов для определения специфического паттерна антител пациента будут использованы белковые маркеры-антигены. На этот же биочип будут добавляться антигены ВИЧ для одновременного обнаружения ко-инфекции ТБ и ВИЧ. Для третьего этапа диагностики будут разработаны молекулярно-генетические методы обнаружения генетических маркеров лекарственной устойчивости микобактерий на основе мультианализа на биочипах.

В связи с необходимостью проведения масштабных скрининговых исследований распространения возбудителей ТБ и его антибиотикоустойчивых форм при выработке стратегии основное внимание будет уделяться производительности технологий, времени проведения анализа и возможности внедрения в диагностические лаборатории различного уровня.

Российскими партнерами будет разработана диагностическая тест-система молекулярно-генетического мультианализа для ускоренного обнаружения микобактерий ТБ и определения их устойчивости к препаратам как первого, так и второго ряда в одном анализе. Технологическое решение будет основано на колориметрической детекции, преимущества которой были показаны при идентификации устойчивости бактерий к бета-лактамным антибиотикам [8]. Качественное изменение по сравнению с существующими в настоящее время молекулярно-генетическими методами будет заключаться в принципиальном расширении набора генетических маркеров для идентификации типа устойчивости одновременно к антибиотикам первого и второго ряда. Качественное изменение технологии биочипов будет состоять в выборе способов их изготовления, проведения гибридизационного анализа и детекции. Для упрощения методики, сокращения времени анализа и его адаптации к возможностям клинических лабораторий биочипы будут нанесены методом контактной печати в лунки 96-луночных планшетов (рис.1), разделенных на 8-луночные стрипы. Это позволит упростить стадии гибридизации, детекции и отмывки, которые могут быть выполнены с использованием стандартного оборудования для иммуноферментного анализа, доступного для лабораторий различного уровня. Будет проведена оптимизация условий гибридизационного анализа с целью сокращения времени при сохранении необходимых чувствительности и специфичности. Возможность автоматизации различных стадий анализа способствует сокращению общего времени анализа.

Колориметрическая система детекции будет основана на использовании биотина в качестве метки ДНК и выявлении его конъюгатом стрептавидина с ферментом пероксидазой. О положительном результате комплементарной гибридизации будет свидетельствовать окрашивание зоны биочипа (рис.2), регистрируемое оптическим методом. Это позволит разработать более дешевую систему детекции по сравнению с часто исполь­зуемой в настоящее время флуоресцентной.

Для оптимизации технологии молекулярно-генетической идентификации туберкулеза эффективным инструментом является сканирующая зондовая микроскопия, которая позволяет прямым образом наблюдать состояние поверхности биочипа как при его производстве, так и в процессе его использования для диагностики (рис.3, 4). В работах [9, 10] представлен краткий обзор применения атомно-силовой микроскопии (АСМ) для изучения поверхности микрочипов с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами и анализа результатов гибридизации ДНК-мишени; развиты подходы для основанного на АСМ количественного анализа ДНК на микрочипах с использованием таких параметров как высота, площадь и объем объектов на АСМ-изображениях; рассмотрены результаты АСМ-исследований поверхности ДНК-микрочипов до и после гибридизации, а также по детектированию ДНК с использованием золотых наночастиц в качестве метки.