Тест-система для выявления возбудителя чумы

На правах рукописи

КУКЛЕВ Василий Евгеньевич

КОНСТРУИРОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧУМЫ, ТУЛЯРЕМИИ И СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОЙ ПЦР

03 00 07 - микробиология 03 00 15 - генетика

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Кутырев Владимир Викторович Куличенко Александр Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна

доктор медицинских наук, старший Саяпина Лидия Васильевна

ГУ "НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи" РАМН

часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы В настоящее время эпидемиологическая обстановка по чуме, туляремии и сибирской язве во всем мире остается достаточно сложной Это обусловлено активностью природных очагов чумы и туляремии, возможностью заноса возбудителей с эндемичных территорий на эпидемически благополучные в связи с хозяйственной деятельностью человека [Онищенко Г Г с соавт, 2003] Кроме того, Yersinia pest is, Francisella tularensis и Bacillus anthracis отнесены к наиболее опасным из возможных агентов биотерроризма, благодаря их высокой контагиозности, а для сибиреязвенного микроба - вследствие возможности образования спор [Воробьев А А, 2002] Поэтому остается актуальным разработка и совершенствование методов специфической индикации и ускоренной идентификации чумного, туляремийного и сибиреязвенного микробов в биологическом материале и объектах окружающей среды

В последние годы все большее распространение получают генамплификационные технологии, особенно полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая обладает высокой чувствительностью - 1x102 - 1x103 КОЕ/мл, специфичностью и позволяете течение 3-6 ч выявить ДНК патогенного биологического агента (ПБА) в нативном материале без этапа культивирования микроорганизмов и охарактеризовать его по интересующим признакам таксономия, вирулентность и эпидемическая значимость, устойчивость к антибактериальным препаратам [Rolfs A eta/, 1993]

Во-первых, увеличение продолжительности и трудоемкости анализа при исследовании проб, подозрительных на зараженность неизвестным ПБА, а также материала, собранного на территории сочетанных природных очагов чумы и туляремии Связано это с тем, что разработанные диагностические препараты с одной стороны направлены на детекцию лишь одного возбудителя, а с другой - имеют многоэтапную технологию подготовки реакционной смеси для ПЦР и длительное время реакции амплификации (от 2 до 4,5 ч)

Во-вторых, трудности организации исследований методом ПЦР в полевых условиях и мобильных лабораториях специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ), учитывая противоконтаминационный режим работы, поскольку в существующих ПЦР-тест-системах учет результатов проводится с помощью электрофореза в агарозном геле и для его постановки требуется оборудование изолированного рабочего места

В-третьих, сложность ускоренной идентификации Y pestis, так как имеющийся препарат для генной диагностики чумы основан на амплификации генов, расположенных на видоспецифичных плазмидах pFra и pPst, и, следовательно, направлен только на детекцию возбудителя без определения его свойств В тоже время такие системы созданы для характеристики штаммов сибиреязвенного и туляремийного микробов [Тучков И В с соавт, 1994, Leal N С et al, 1999, Versage J L et al, 2003, Levi К et al, 2003, Шевченко О В с соавт, 2004, Тучков И В , 2005, Осина Н А с соавт, 2006]

Решением обозначенных проблем может быть разработка качественно новых препаратов для генной диагностики чумы, туляремии и сибирской язвы на основе технологий мультилокусной ПЦР (МПЦР) и гибридизационно-флуоресцентного учета результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) Принципиальной особенностью мультилокусной ПЦР (МПЦР) является введение в состав системы двух и более пар праймеров, которые обеспечивают одновременную амплификацию сразу нескольких ДНК-мишеней разных возбудителей или одного патогена В тоже время ПЦР-РВ позволяет детектировать реакцию амплификации автоматически по накоплению флуоресцентного сигнала в пробирках, не открывая их и не используя для этих целей метод электрофореза в агарозном геле

Цель работы — создание тест-систем для выявления и генетической характеристики штаммов возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов

Основные задачи исследования

1 Провести анализ геномов возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии на наличие специфичных регионов, выбрать оптимальные ДНК-мишени для мультилокусной ПЦР

2 Подготовить и охарактеризовать обширную выборку штаммов Y pestis, F tularensis, В anthracis, и гетерологичных микроорганизмов для оценки специфической активности (чувствительности) и специфичности мультилокусной ПЦР

3 Подобрать к выбранным фрагментам ДНК олигонуклеотидные праймеры и зонды TaqMan, оптимизировать условия проведения мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов

4 Разработать схему подготовки биологического материала и объектов окружающей среды для одновременной детекции У ре5Ш, Р Ыагепня и В апЛгаси с помощью мультилокусной ПЦР

5 Сконструировать и апробировать при исследовании полевого материала тест-системы для одновременного выявления ДНК У рги/;. Р иЛагетхя и В ашИгаск методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, охарактеризовать их диагностическую ценность

6 Разработать методический подход для характеристики штаммов возбудителя чумы по вирулентности с помощью мультилокусной ПЦР

Научная новизна работы

Впервые на основе анализа структуры геномов возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии определены оптимальные ДНК-мишени для создания МПЦР, направленной на одновременное выявление указанных возбудителей хромосомный локус За У реяШ, гены С F 1и1агет1$, ген ра%К В амИгаси

Впервые на основе подобранных праймеров и зондов TaqMan сконструированы тест-системы для одновременного вьивления в одной реакции ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов

Установлена возможность эффективной детекции с помощью усовершенствованной методики выделения ДНК и разработанных тест-систем возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы в пробах биологического материала и объектах окружающей среды

Продемонстрирована эффективность методического подхода для одновременной детекции и характеристики возбудителя чумы с помощью мультилокусной ПЦР, основанной на выявлении видоспецифичного локуса За и ассоциированных с вирулентностью генов хромосомного ОВП и плазмиды рСа 'Ь/-региопе ОВП и отвечающего за синтез высокомолекулярного белка 2 (190 кДа) [Carmel Е et al, 1999] Это послужило основанием для его выбора в качестве одной из ДНК-мишеней Исследования, проведенные Leal-Balbino et al [2004] показали, что плазмида pCad и, в частности, ген IcrV, обладают высокой стабильностью как у вновь выделяемых штаммов чумного микроба, так и у культур, подвергавшихся длительному хранению Представленные результаты указывают на перспективность использования гена IcrV в качестве второй ДНК-мишени Однако плазмида pCad присутствует и у других патогенных представителей рода Yersinia, а ОВП имеется в геноме целого ряда микроорганизмов Е coli, С diversus, К pneumoniae, К rhmoscleromatis, К ozaenae, К oxytoca и др Маркером, определяющим принадлежность исследуемых культур к виду Y pestis, может являться хромосомный локус За, использованный нами ранее при

разработке МПЦР для одновременного выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы.

На основании представленных в базе данных NCBI GenBank нуклеотидных последовательностей выбранных нами генов (№ AF350075, NC_003143.1, NC_003131.1) с помощью программы PrimerExpress, алгоритма BLAST и разработанной на базе Visual Basic 6.0 программы по расчету праймеров для мультилокусной ПЦР подобраны олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающие амплификацию фрагмента хромосомного локуса За размером 151 п.н., гена irp2 - размером 266 п.н., и гена IcrV- размером 489 п.н.

В процессе оптимизации условий мультилокусной ПЦР изменяли сочетано один или несколько из указанных ниже параметров: температура отжига праймеров (от 50 °С до 64 °С); концентрация праймеров (от 4 до 16 пмоль); время каждого шага цикла амплификации (от 20 до 5 секунд при активном режиме регулирования температуры); количество циклов (от 35 до 40); время предварительной денатурации (от 1 до 5 минут); время завершающей элонгации (от 1 до 7 минут). В экспериментах использовали ДНК, выделенную из проб, содержащих Y. pestis 231, С-624 и М-641 в концентрациях от 1 х 102 до 1 х Ю5 м.к./мл.

Рисунок 5. Специфическая активность разработанной МПЦР для детекции и характеристики штаммов возбудителя чумы:

1 - У. 231 в концентрации 1 х 103 м.к./мл; 2 - У. резШ 231 в концентрации 5Х 103 м.к./мл; 3 -У. резНя 231 в концентрации 1х]04 м.к./мл; 4 - положительный контроль; 5 — отрицательный контроль.

Для определения специфичности разработанной МПЦР исследовали 31 штамм У. pestis, 15 штаммов У. pseudotuberculosis, 3 штамма У. enterocolitica и 68 штаммов гетерогенных микроорганизмов. Амплификация фрагмента, соответствующего хромосомному локусу За, отмечена только со штаммами чумного микроба. Положительный ответ в ПЦР с праймерами, фланкирующими участок гена irp2, наблюдался при исследовании 27 культур У. pestis, 4 - У. pseudotuberculosis, и 6 - Е. coli. Специфичность ПЦР подтверждена путем секвенирования ампликонов.

Полученные результаты согласуются с литературными данными по распространенности хромосомного ОВП среди представителей семейства Enterobacteriaceae и возможности его элиминации [Hacker J., et al., 1997; Perry R. D., 1993; Schubert S., et al., 1998; Carniel E., 1999]. Амплификация в ПЦР фрагмента гена lcrV отмечена при исследовании 31 штамма чумного микроба, 2 штаммов У. pseudotuberculosis (III эталонный и 837) и 1 штамма У. enterocolitica 121. С изолятом У. pseudotuberculosis III-5 наблюдалось формирование ампликонов, размер которых отличался от таковых для других штаммов Yersinia spp (Рис. 6.).

1 2 3 4 5 6 7 8

489 п.н. 266 п.н. 151 п.н.

Рисунок 6. Исследование с помощью разработанной МПЦР штаммов представителей семейства Enterobacteriaceae'.

1 - У. pseudotuberculosis П1-5; 2 - У. pseudotuberculosis 837; 3 - У. pseudotuberculosis W\-l\, 4 -У. pseudotuberculosis 847; 5 - У. enterocolitica 121; 6 - У. enterocolitica И-27; 1-Е. coli 18; 8 -положительный контроль.

Результаты секвенирования полученных ампликонов показали, что у штамма У. pseudotuberculosis III-5 имеется замена 21 нуклеотида в позиции 292-313 на фрагмент размером 72 п.н., который включал 11 тандемных повторов "ТСС CAT" и заканчивался последовательностью "ТСТ TCG". Установленная вставка в 51 п.н. и привела к увеличению размера ампликонов, образуемых в ПЦР. В настоящее время механизм этой вставки, ее природа и возможное влияние на синтез V-антигена неясны и представляют интерес для дальнейший исследований.

Для оценки диагностической эффективности разработанной МПЦР был исследован 31 штамм чумного микроба основного и неосновных подвидов, выделенных за период

1938-1984 гг из различных источников на территории 11 природных очагов чумы Дополнительно пробы анализировали с помощью выпускаемой в РосНИПЧИ "Микроб" тест-системы "ГенПест"

Из 31 изученного штамма чумного микроба у 28 (90,3 %) наблюдалась одновременная амплификация фрагмента Ja-локуса, генов irp2 и IcrV, а также cafl и pía локусов, за исключением двух культур Y pestis С-533 и Y pestis 1146, выделенных на территории Закавказского высокогорного очага, у которых отсутствовал фрагмент гена pía Полученные результаты согласуются с известным фактом утраты возбудителем чумы кавказского подвида плазмиды pPst Все штаммы Y pestis, имевшие по данным проведенного исследования гены irp2 и IcrV, были высоковирулентны для белых мышей -LD50 от 6 до 398 м к и DCL от 102 до 104 м к

У трех изолятов чумного микроба (9,7 %) EV НИИЭГ (вакцинный штамм), 300 (Волго-Уральский степной очаг), 293 (Прикаспийский песчаный очаг) не происходило амплификации фрагмента гена irp2 (у6/-регион ОВП) в мультилокусной системе При исследовании этих же культур в монолокусной ПЦР с праймерами к гену hmsH (hms-регион ОВП) также отмечен отрицательный результат, что может свидетельствовать о полной потере этими штаммами ОВП Для биопробных животных эти штаммы были авирулентны (DCL > 1X Ю7 м к )

Полученные результаты указывают на 100 % совпадение факта отсутствия irp2 и IcrV генов у исследуемых штаммов чумного микроба и их авирулентности по данным биологической пробы на чувствительных животных

Разработанный нами методический подход, основанный на одновременной амплификации в условиях мультилокусной ПЦР генов irp2 (ОВП), /crF(pCad) и локуса За (видоспецифичный фрагмент хромосомы), позволяет одновременно с детекцией чумного микроба, охарактеризовать его по маркерам вирулентности и, следовательно, определить эпидемическую значимость, независимо от наличия видоспецифичных плазмид pFra и pPst Предлагаемый подход эффективен для дифференцирования авирулентных штаммов возбудителя чумы от вирулентных

Таким образом, итогом нашей работы стало конструирование экспериментальных серий новых тест-систем для индикации и идентификации возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы на основе технологий мультилокусной ПЦР и ПНР в режиме реального времени Для созданных тест-систем установлена высокая специфичность и специфическая активность, как при исследовании чистых культур, так и биологического материала и объектов окружающей среды

Предлагаемый нами алгоритм конструирования генамплификационных систем для проведения индикации и идентификации возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы универсален и может быть применим по отношению к другим микроорганизмам I-II групп патогенности

1 На основании анализа геномов возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы выбраны специфические фрагменты для одновременного выявления указанных микроорганизмов методом мультилокусной ПЦР видоспецифичный для Y pestis хромосомный локус За, гены iglBC F lularensis, кодирующие белок внешней мембраны 23 кДа, ген pagA плазмиды pXOl В anthracis, отвечающий за синтез протективного антигена.

2 Подготовлена обширная выборка типичных по культуральным, морфологическим, биохимическим, серологическим и генетическим свойствам штаммов

Y pestis, F tularensis, В anthracis и гетерологичных микроорганизмов (всего 211 штаммов), позволяющая эффективно определить специфическую активность и специфичность мультилокусной ПЦР

3 Подобраны олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающие специфическую амплификацию фрагментов локуса За Y pestis размером 177 п н , генов iglBC F tularensis - 268 п н , гена pagA плазмиды pXOl В anthracis - 368 п н, а также зонды TaqMan для учета результатов реакции в режиме реального времени Разработаны оптимальные параметры проведения мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, обеспечивающие специфическую активность реакции 1 х 102 - 1X 103 м к /мл при 100 % специфичности

4 Разработана схема подготовки проб биологического материала и объектов окружающей среды, обеспечивающая высокую чувствительность анализа при детекции

Y pestis, F tularensis и В anthracis с помощью мультилокусных ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов Схема соответствует требованиям нормативной документации по биологической безопасности работ при проведении ПЦР-исследований материала, подозрительного на зараженность возбудителями особо опасных инфекций

5 Сконструирована и апробирована при исследовании полевого материала тест-система для одновременного выявления ДНК Y pestis, F tularensis, В anthracis методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов, включающая наборы для выделения ДНК, проведения ПЦР и учета результатов Специфическая активность -1х103мк /мл, специфичность - 100 %

6 Разработана и апробирована при исследовании полевого материала качественно новая генодиагностическая тест-система для одновременного выявления ДНК У pestis,

^ Магепзк, В амкгааз методом мультилокусной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени, включающая наборы для выделения ДНК и проведения ПЦР Специфическая активность - 1 * 103 м к /мл, специфичность - 100 %

7 Для одновременной детекции и характеристики штаммов возбудителя чумы по признакам патогенности предложен методический подход, основанный на одновременной амплификации фрагментов видоспецифичного для У ре$Ш хромосомного локуса За и генов, ассоциированных с вирулентностью чумного микроба 1гр2 (хромосомный остров патогенности) и 1сгУ (плазмида рСа Куклев, Василий Евгеньевич

кандидата медицинских наук

Саратов, 2007

ВАК 03.00.07

Участники и результаты

44-ФЗ, Электронный аукцион

ИНН 7810323620 КПП 781001001

VET-46-FRT-K Тест-система для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом полимеразной цепной реакции "ГРИПП"