Нейтрофильные внеклеточные ловушки сепсис
Полный текст:
1. Богачева Н. В., Крючков А.В.,ДармовИ.В., Воробьев К. А., Печенкин Д. В., Елагин Г. Д. Колесников Д.П. Экспериментальная оценка методом проточной цитофлуориметрии уровня клеточной иммунологической памяти у лиц, вакцинированных против чумы и сибирской язвы. Клин. лаб. диагностика. 2013, 11: 48-53.
2. Воробьева Н.В., Пинегин Б.В. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: механизмы образования, роль в норме и при патологии. Биохимия. 2014, 79 (12): 1580-91.
3. Долгушин И.И., Савочкина А.Ю., Курносенко И.В., Долгушина В.Ф., Савельев А.А. Самусева И.В., Майкова В.Б. Участие внеклеточных нейтрофильных ловушек в защитных и патологических реакциях организма. Российский иммунологический журнал. 2015, 9 (18), 2: 164-170.
4. Киселева Е.П. Новые представления о противоинфекционном иммунитете. Инфекция и иммунитет. 2011, 1:9-14.
5. Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Щуковская Т.Н. Влияние противочумной вакшошаа на функциональную активность клеток врожденного иммунитета человека. Прос.-особо опасных инф. 2011, 1 (107): 77-80.
6. Кравцов А.Л. Формирование внеклеточных ловушек - эффективный механизм защиты от патогена. Пробл. особо опасных инф. 2012, 2 (112): 69-74.
7. Кутырев В.В., Коннов Н.П., Волков Ю.П. Возбудитель чумы: ультраструктура и локализация в переносчике. М., Медицина, 2007.
9. Семенов Б.Ф., Зверев В.В. Концепция быстрой иммунологической защиты от патогенов. Журн. микробиол. 2007, 4: 93-100.
10. Фрадкин В.А. Диагностика аллергии реакциями нейтрофилов крови. М., Медицина, 1985.
11. Beiter К., Wartha Е, Albiger В. et al. An endonuclease allows Streptococcus pneumoniae to escape from neutrophil extracellular traps. Curr. Biolology. 2006, 16: 401-407.
12. Branzk N., Lubojemska A., Hardison S.E. et al. Neutrophil sense microbial size and selectively release neutrophil extracellular traps in response to large pathogens. Nat. Immunol. 2014, 15 (11): 1017-1025.
13. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C. et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 2004, 303: 1532-1535.
14. Camicia G., Pozner R., Larranaga G. Neutrophil extracellular traps in sepsis. Shock. 2014,42 (4): 286-294.
15. Casutt-Mayer S., Renzi E, Schmaler M. et al. Oligomeric coiled-coil adhesin YadA is a double-edged sword. PLoS ONE. 2010, 5 (12): e 15159. doi: 10.1371/journal. pone. 0015159.
16. Chen G., Zhang D., Fuchs T.A. et al. Heme-induced neutrophil extracellular traps contribute to the pathogenesis of sickle cell disease. Blood. 2014, doi: 10.1182/blood-2013-10-529982.
17. Clark S.R., Ma A.C., Tavener S.A. et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nat. Med. 2007, 13: 463-469.
18. Davey H.M., Kell D.B. Flow cytometry and cell sorting of heterogeneous microbial populations: the importance of single-cell analysis. Microbiol. Rev. 1996, 60: 641-696.
19. de Jong H.K., Koh G., Achouiti A. et al. Neutrophil extracellular traps in the host defense against sepsis induced Burkholderia pseudomallei (melioidosis). Intensive Care Medicine Experimental. 2014, 2 (21). doi: 10.1186/s40635-014-0021-2.
20. Domenech M., Ramos-Sevillano E., Garcia E. et al. Biofilm formation avoids complements immunity and phagocytosis of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 2013, 81: 2606-2615.
21. Eisele N.A., Lee-Lewis H., Besch-Williford C. et al. Chemokine receptor CXCR2 mediates bacterial clearance rather than neutrophil recruitment in murine model of pneumonic plague. Am. J. Pathol. 2011, 178 (3): 1190-1200.
22. Fuchs T.A., Abed U., Goosmann C. et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 2007, 176: 231-241.
24. Gupta A.K., Joshi M.B., Phillippova M. et al. Activated endothelial cells induce neutrophil extracellular traps and are susceptible to NETosis-mediated cell death. FEBS Lett. 2010, 584: 3193-3197.
25. Hickey M.J., Kubes P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat. Rev. Immunology. 2009, 9: 364-375.
26. Kravtsov A.L., Bobyleva E.V., Grebenyukova T.P., Kuznetsov O.S., Kulyash Y.V. Flow micro-fluorometric analysis of phagocyte degranulation in bacteria infected whole human blood cell cultures. Proc. SPIE. 2002, 4707: 395-402.
27. Landoni V.I., Chiarella R, Martire-Greco D. et al. Tolerance to lipopolysaccharide promotes an enhanced neutrophil extracellular trap formation leading to a more efficient bacterial clearance in mice. Clin, and Exper. Immunol. 2012, 168: 153-163.
28. Ma C.A., Kubes P.K. Platelets, neutrophils, and neutrophil extracellular traps in sepsis. J. Thromb. Haemostasis. 2008, 6 (3): 415-420.
29. Marcos V., Zhou Z., Yildirim A. et al. CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airways inflammation. Nat. Med. 2010, 16: 1018-1023.
30. Mayer-School A., Hurwitz R., Brinkmann V. et al. Human neutrophils kill Bacillus anthracis. PLos Pathog. 2005, 1 (3): e23. doi: 10.1371/joumal. ppat. 0010023.
31. McAdow M., Kim H.A., DeDent A.C.etal. Preventing Staphylococcus aureus sepsis through the inhibition of its agglutination in blood. PLoS Pathog. 2011,7 (10): e 1002307. doi: 10.1371/ jounal. ppat: 1002307.
32. McDonald B., Urrutia R., Yipp B.G. et al. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 2012, 12 (3): 324-333.
33. Murphey E.D., Fang G., Varma T.K., Sherwood E.R. Improved bacterial clearance end decreased mortality can be induced by LPS tolerance and is not dependent upon IFN-gamma. Shock. 2007, 27: 289-295.
34. Papayannopoulos V, Metzier K.D., Hakkim A., Zychlinsky A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 2010, 191: 677-691.
35. Prashar A., Bhatia S., Gigliozzi D. et al. Filamentous morphology of bacteria delays the timing of phagosome morphogenesis in macrophages. J. Cell Biol. 2013, 203: 1081-1097.
36. Riyara D., Buddhisa S., Korbsrisate S. et al. Neutrophil extracellular traps exhibit antibacterial activity against Burkholderia pseudomallei and are influenced by bacterial and host factors. Infec.Immun. 2012, 80 (11): 3921-3929.
37. Seper A., Hosseinzadeh A., Gorkiewicz G. et al. Vibrio cholerae evades neutrophil extracellular traps by the activity of two extracellular nucleases. PLoS Pathog. 2013, 9 (9): el003614. doi: 10.1371/journal, ppat.1003614.
38. Seper A., Fengler V.H., Roier S. et al. Extracellular nucleases and extracellular DNA play important roles in Vibrio cholerae biofilm formation. Mol. Microbiol. 2011, 82: 1015-1037.
39. Shannon J.G., Hasenkrug A.M., Dorward D.W. et al. Yersinia pestis subverts the dermal neutrophil response in mouse model of bubonic plague. mBio. 2013,4(5): eOO 170-13. doi: 10.1128/ mBio. 00170-13.
40. Silva T.M. Bacteria-induced phagocyte secondary necrosis as a pathogenicity mechanism. J. Leuk. Biology. 2010, 88 (5): 885-896.
41. Simpson A.J. Melioidosis: a clinical model for gram-negative sepsis. J. Med. Microbiology. 2001,50 (8): 657-658.
42. Tanaka K., Koike Y., ShimuraT. etal. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 2014, 9 (11): ell 1888. doi: 10.1371/ journal, pone.0111888.
43. Tang A.H., Brunn G.J., Cascalho M., Platt J.L. Pivotal advance: endogenous pathway to SIRS, sepsis, and related conditions. J. Leuk. Biology. 2007, 82: 282-285.
44. Tillack K., Breiden R, Martin R., Sospedra M. T-lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. J. Immunology. 2012, 188 (7): 3150-3159.
45. Weinrauch Y., Drujan D., Shapiro S.D. et al. Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria. Nature. 2002, 417: 91-94.
46. Yoong P., Cywes-Bentley C., Pier G.B. Poly-N-Acetylglucosamine expression by wild-type Yersinia pestis is maximal at mammalian, not flea, temperatures. mBio. 2012,3(4). E00217-12. Doi: 10.1128/mBio.00217-12.
Кравцов А.Л. РОЛЬ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК ПРИ ОСОБО ОПАСНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии (ЖМЭИ). 2016;(4):95-104.
Kravtsov A.L. ROLE OF NEUTROPHIL EXTRACELLULAR TRAPS IN ESPECIALLY DANGEROUS BACTERIAL INFECTIONS. Journal of microbiology epidemiology immunobiology. 2016;(4):95-104. (In Russ.)
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.
Нейтрофильных внеклеточные ловушки ( сетки ) представляют собой сеть внеклеточных волокон, в основном состоит из ДНК из нейтрофилов , которые связывают патогены . Нейтрофилы иммунной системы первой линия защиты от инфекции и традиционно думали убить вторжение болезнетворных микроорганизмов через две стратегии: охват микробов и секрецию противомикробных средств. В 2004 году был идентифицирован новым третьей функции: формирование сетками. НРТ позволяют нейтрофилы убивать внеклеточные патогены , минимизируя повреждение клеток - хозяев. При ин витро активации с фармакологическим агентом форболмиристатацетатом (РМА), интерлейкина 8 (IL-8) или липополисахаридом (LPS), нейтрофилы высвобождение гранул белки и хроматин с образованием фибрилл внеклеточного матрикса , известным как ИЕ посредством активного процесса.
содержание
Структура и состав
Высокое разрешение сканирования электронной микроскопии показало , что НРТ состоят из отрезков ДНК и глобулярных доменов белка с диаметром 15-17 нм и 25 нм соответственно. Они агрегировать в более крупные нитей с диаметром 50 нм. Однако в условиях потока, НРТ могут образовывать более крупные структуры, достигая сотен нанометров в длину и ширину.
Анализ методом иммунофлуоресценции подтвердил , что НРТ содержат белки из азурофильных гранул (эластазы нейтрофилов, катепсина G и миелопероксидазы ), специфические гранулы ( лактоферрин ), третичные гранулы ( желатиназа ), так и в цитоплазме; Однако, CD63 , актин , тубулин и различные другие цитоплазматические белки не присутствует в сетках.
Антимикробная активность
НРТ обезвредить патогены с антимикробными белками , такими как нейтрофильной эластазы , катепсина G и гистоны , которые имеют высокое сродство к ДНК. НРТ обеспечивает высокую локальную концентрацию антимикробных компонентов и связывается, обезвредить, и убивают микробы внеклеточны независимо от фагоцитарного поглощения. В дополнении к их антимикробным свойствам, НРТ может служить в качестве физического барьера , который предотвращает дальнейшее распространение патогенных микроорганизмов. Кроме того, обеспечивая гранулы белков в НЭО может держать потенциально вредные белки , такие как протеазы , диффузию прочь и вызывая повреждение в ткани , прилегающей к месту воспаления .
Совсем недавно было также показано , что не только бактерии , но и патогенные грибы , такие как Candida Albicans индуцируют нейтрофилы с образованием сетками , которые захватывают и убивают C. Albicans гиф, а также дрожжи образуют клетки. НРТ также были зарегистрированы в ассоциации с малярийного плазмодия инфекций у детей.
Несмотря на то , что первоначально было предложено , что НРТ будет сформирована в тканях на участке бактериальной / дрожжевой инфекции, НРТ также было показано , чтобы сформировать внутри кровеносных сосудов во время сепсиса ( в частности , в легких капилляров и синусоиды печени ). Затраты на формирование внутри-сосудистое жестко контролируется и регулируется тромбоцитами , которые ощущающие тяжелая инфекцию с помощью тромбоцитов TLR4 , а затем связываются с и активируют нейтрофилы с образованием сеток. Тромбоциты-индуцированные NET формирования происходит очень быстро (в течение нескольких минут) и могут или не может привести к гибели нейтрофилов. НРТ , образованный в кровеносных сосудах могут поймать циркулирующие бактерий , поскольку они проходят через сосуды. Ловушки бактерий в потоке было отображены непосредственно в проточных камерах в лабораторных и прижизненной микроскопии показано , что бактериальная захват происходит в синусоиды печени и капилляров легких (участков , где тромбоциты связывают нейтрофилы).
NETosis
NET активация и освобождение или NETosis, является динамическим процессом, который может прийти в двух формах, суицидальное и жизненно NETosis. В целом, многие из ключевых компонентов процесса одинаковы для обоих типов NETosis, однако, есть ключевые различия в раздражители, сроки и конечной конечный результат.
Полная NETosis активация пути еще находится в стадии расследования , но несколько ключевых белков были идентифицированы и медленно полная картина пути появляется. Процесс , как полагают , чтобы начать с NADPH - оксидаза активации белка-аргинина deiminase 4 (PAD4) через реактивно-кислородных видов (ROS) посредников. PAD4 отвечает за citrullination гистонов в нейтрофилов, что приводит к деконденсации хроматина. Азурофильные белки , такие как гранулы миелопероксидаза (МРО) и эластазы нейтрофилов (NE) , а затем проникают в ядро и далее процесс деконденсации, что приводит к разрыву ядерной оболочки. Неуплотняемый хроматин входит в цитоплазму , где дополнительные гранулы и цитоплазматические белки добавляются к ранней стадии NET. Конечный результат процесса затем зависит от того , NETosis путь активируется.
Суицидальное NETosis было впервые описано в исследовании 2007, отметило, что выпуск ИХ привел к нейтрофилам смерти через другой путь, чем апоптоз или некроз. В суицидальных NETosis, внутриклеточное образование NET сопровождается разрывом мембраны плазмы, выпуская его во внеклеточное пространство. Этот путь NETosis может быть инициировано путем активации Toll-подобных рецепторов (TLRs), рецепторы Fc, и дополняют рецепторы с различными лигандами, такими как антитела, РМА, и так далее. Нынешнее понимание является то, что при активации этих рецепторов, вниз по течению сигнализации результаты в выпуске кальция из эндоплазматического ретикулума. Этот внутриклеточный приток кальция в свою очередь, активирует НАДФН-оксидазы, в результате активации пути NETosis, как описано выше. Следует отметить, что суицидальное NETosis может занять несколько часов, даже при высоких уровнях PMA стимуляции, в то время как жизненно NETosis, которая может быть завершена в течение нескольких минут.
Образование НЭА регулируются липоксигеназы путей - при определенных формах активации ( в том числе контакта с бактериями) нейтрофильной 5-липоксигеназой формой 5-НЕТ-фосфолипиды , которые ингибируют образование NET. Данные лабораторных экспериментов показывают , что НРТ убираются прочь макрофагами , которые фагоцитируют и разлагают их.
NET-ассоциированного повреждения хост
НРТ также может оказывать вредное воздействие на хозяина, потому что воздействие внеклеточного гистонов комплексов может играть роль в развитии аутоиммунных заболеваний , таких как системная красная волчанка . НРТ может также играть роль в воспалительных заболеваний, а НРТ может быть идентифицирован в преэклампсии , родственный беременность воспалительное заболевание , при котором , как известно , нейтрофилы , которые будут активированы. НРТ также сообщались в толстой слизистой оболочке пациентов с воспалительным заболеванием кишечника неспецифическим язвенным колитом . НРТ также были связаны с производством IgG антинуклеарных антител двойных скрученных ДНК у детей , инфицированных P. трехдневной малярии .
НРТ было показано , что вклад в патогенез ВИЧ / ВИО . НРТ способны захватывать вирионы ВИЧ и уничтожить их. Существует увеличение чистой продукции на протяжении всего курса ВИЧ / SIV, которая уменьшается на АРТ . Кроме того, НРТ способны захватывать и убивать различные группы иммунных клеток , такие как CD4 + и CD8 + Т - клетки , В - клетки и моноциты . Этот эффект проявляется не только с нейтрофилами в крови, но также и в различных тканях , таких как кишечник, легких, печени и кровеносных сосудов. НРТ , возможно , внести свой вклад в состояние гиперкоагуляции в ВИЧ путем улавливания тромбоцитов , и экспрессии тканевого фактора .
НРТ также играет роль в тромбозе .
Эти наблюдения указывают на то, что НРТ может играть важную роль в патогенезе инфекционных, воспалительных и тромботических заболеваний.
Лейкемоидные реакции. Классификация, общая характеристика. Лейкемоидные реакции – это обратимые, вторичные, симптоматические изменения со стороны белой крови, характеризующиеся глубоким сдвигом лейкоцитарной формулы влево.
Останавливаясь на общих закономерностях и особенностях развития отдельных видов лейкемоидных реакций, следует отметить их принципиальные отличия от лейкозов. Так, лейкемоидные реакции не являются самостоятельным заболеванием, в отличие от лейкоза, а носят вторичный симптоматический характер, причем нередко очевидна причина, индуцировавшая развитие лейкемоидной реакции.
Как правило, лейкемоидные реакции возникают вследствие воздействия на организм бактериальных, вирусных инфекций, чрезвычайных стрессорных раздражителей, а также разнообразных патогенных факторов бактериальной и небактериальной природы, вызывающих сенсибилизацию организма. С устранением действия основного этиологического фактора возникает и быстрая нормализация состава периферической крови.
Для лейкемоидной реакции не характерны признаки опухолевой прогрессии, свойственные лейкозам, поэтому при них не возникают анемии и тромбоцитопении метапластического характера.
Как и при лейкозах, на фоне развития лейкемоидной реакции возникает выраженное омоложение периферической крови, вплоть до появления бластных элементов, однако в большинстве случаев развития лейкемоидной реакции, за исключением бластемической формы, количество бластных элементов в периферической крови не превышает 1–2 %.
В отличие от лейкоцитозов, лейкемоидные реакции характеризуются, как правило, более высоким содержанием лейкоцитов в периферической крови (исключение – цитопенические варианты лейкемоидной реакции) и более глубоким сдвигом в лейкоцитарной формуле до единичных бластных элементов.
Различают лейкемоидные реакции миелоидного типа, эозинофильного, лимфатического, моноцитарного, моноцитарно-лимфатического типов, а также вторичные эритроцитозы и реактивные тромбоцитозы.
В детском возрасте лейкемоидные реакции встречаются чаще, чем у взрослых, и преобладают реакции эозинофильного и моноцитарно-лимфатического типа, реже – миелоидные лейкемоидные реакции.
Лейкемоидные реакции миелоидного типа возникают при различных инфекционных и неинфекционных процессах, септических состояниях, интоксикациях эндогенного и экзогенного происхождения, тяжелых травмах, остром гемолизе.
Миелоидные лейкомоидные реакции имеют место при инфарктах миокарда или легкого, термических поражениях, системном васкулите, злокачественных лимфомах, тиреотоксическом кризе. Развитие миелоидных лейкемоидных реакций может провоцироваться на фоне приема ряда лекарственных препаратов: кортикостероидов, нестероидных противовоспалительных препаратов, эфедрина, гепарина, адреналина и др.
Формирование нейтрофильного лейкоцитоза и миелоидных лейкемоидных реакций может иметь наследственный характер, в связи с дефицитом рецепторов для С3 компонентов комплемента или при дефектах хемотаксиса (синдром Джоба).
В плане дифференциальной диагностики лейкемоидных реакций, следует отметить, что они развиваются, как правило, на фоне общего тяжелого состояния больного. Для лейкемоидных реакций не характерна спленомегалия, и в цитоплазме клеток нейтрофильного ряда появляются токсическая зернистость, вакуолизация ядра и цитоплазмы и даже прижизненный распад ядра. В пользу лейкемоидных реакций свидетельствует нормальный клеточный состав костного мозга.
Следует отметить, что развитие солидных опухолей также нередко сопровождается лейкемоидными реакциями нейтрофильного типа в сочетании с тромбоцитозом, тромбоцитопенией, эритроцитозом.
При реакциях миелоидного типа наблюдается лейкоцитоз от 10 000 до 50 000 в 1 мкл крови (редко более 50 000 в 1 мкл), а в лейкограмме сдвиг влево – от повышенного количества палочкоядерных клеток до единичных бластных элементов с наличием всех промежуточных форм. Степень гиперлейкоцитоза и сдвиг формулы не всегда соответствуют тяжести основного заболевания, а зависят от реакции кроветворной системы на инфекционно-токсическое влияние. В пунктате костного мозга чаще всего наблюдается увеличение содержания незрелых гранулоцитов, т.е. имеется картина раздражения миелоидного ростка крови.
Необходимо отметить, что в ряде случаев может развиться лейкемоидная реакция миелоидного типа с выраженной бластемией. Подобная реакция наблюдается у больных сепсисом, при хроническом легочном нагноении, при септическом эндокардите, туберкулезе, туляремии и др. В таких случаях приходится дифференцировать лейкемоидную реакцию с лейкозом.
Редкой формой миелоидной реакции является лейкемоидная реакция цитопенического типа, когда у больных на фоне лейкопении (количество лейкоцитов 1 500–2 500 в 1 мкл крови) имеет место сдвиг в лейкоцитарной формуле влево до единичных незрелых форм.
Возможно, что в основе лейкемоидной реакции цитопенического типа лежит задержка созревания и накопление незрелых клеточных элементов в кроветворной ткани.
В таких случаях картина крови напоминает таковую при хроническом миелолейкозе и диагностическом миелофиброзе.
Лейкемоидные реакции моноцитарного типа наблюдаются при ревматизме, инфекционном мононуклеозе, саркоидозе, туберкулезе. Резкое увеличение количества зрелых моноцитов отмечают у больных дизентерией в период острых явлений и в период реконвалесценции. Лейкемоидные реакции моноцитарного типа возникают нередко при диффуных болезнях соединительной ткани, системных васкулитах, узелковом периартериите, солидных опухолях, облучении и т.д.
Лейкемоидные реакции лимфатического и моноцитарно-лимфатического типов наиболее часто встречаются в детском возрасте при таких заболеваниях, как энтеровирусные инфекции, коревая краснуха, коклюш, ветряная оспа, скарлатина. Лейкемоидная реакция лимфо-моноцитарного типа может возникнуть при синдроме инфекционного мононуклеоза, который вызывается различными вирусами: цитомегаловирусом, вирусами краснухи, гепатита В, аденовирусом, вирусами Herpes simplex, вирусом Эпштейн-Барр.
К лейкемоидным реакциям лимфатического типа относят и иммунобластные лимфадениты, отражающие иммунный процесс в лимфатических узлах, возникающий при действии антигена – аллергена.
Заслуживает внимания так называемый симптоматический инфекционный лимфоцитоз – острое доброкачествоенное эпидемическое заболевание, характеризующееся лимфоцитозом, встречается преимущественно у детей в первые 10 лет жизни, возбудитель – энтеровирус из группы коксаки. В крови – лейкоцитоз от 30 до 100*109. Содержание лимфоцитов возрастает до 70–80 %. При краснухе, скорлатине, коклюше, отмечается лейкоцитоз от 30–40 %*109 до 90–100*109/л.
Лейкемоидные реакции эозинофильного типа занимают 2-ое место по частоте после миелоидныйх реакций, характеризуются увеличением содержания эозинофилов в крови более 15 %. При этом крайне редко возрастает содержание в крови эозинофильных миелоцитов и метамиелоцитов.
Лейкемоидные реакции эозинофильного типа встречаются при следующих формах патологии:
1. Паразитарных инвазиях (17–25 % всех случаев эозинофилии):
а) заражении простейшими (малярия, лямблиоз, амебиаз, токсоплазмоз и др.);
б) заражении гельминтами (трематодозы, аскаридоз, трихинеллез, описторхоз, дифиллоботриоз и др.), как проявление неспецифического синдрома в результате аллергизации организма, чаще при тканевых стадиях развития гельминтов и в период гибели паразитов в тканях под влиянием терапии;
в) заражении членистоногими (чесоточный клещ);
2. Медикаментозных аллергозах. При применении ряда лекарственных препаратов (антибиотики, аспирин, эуфиллин, витамин В1, антиревматические нестероидные средства, препараты золота и др.);
3. Респираторных аллергозах (аллергический ринит, синусит, фарингит, ларингит, сывороточная болезнь, бронхиальная астма);
4. Кожных заболеваниях (экзема, псориаз, ихтиоз, целлюлит и др.);
5. Заболеваниях соединительной ткани (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, узелковый периартериит);
6. Опухолевых заболеваниях (лимфосаркоме, лимфобластном лейкозе, лимфогранулематозе с поражением забрюшинных лимфоузлов, селезенки, тонкого кишечника, при этом высокая эозинофилия – прогностически неблагоприятный признак);
7. Иммунодефицитных состояниях (синдром Вискотта-Олдрича, селективный иммунодефицит IgM);
8. Органных эозинофилиях (эозинофильные панкреатиты, холецистит, паротит, плеврит, миокардит, тропическая эозинофилия легких и др.).
Ведущий гематологический признак лейкемоидной реакции эозинофильного типа – высокий лейкоцитоз с выраженной эозинофилией (20–70 % эозинофилов в общем количестве лейкоцитов).
Лейкемоидные реакци базофильного типа встречаются редко. Реактивная базофилия может развиться при аллергических реакциях, гемолитической анемии, неспецифической язвенном колите, гипотиреозе, лейкозах.
При гематологических заболеваниях (при хроническом миелолейкозе, лимфогранулематозе) встречается эозинофильно-базофильная ассоциация.
Вторичные эритроцитозы также рассматриваются как лейкемоидные реакции. Причины развития вторичных эритроцитозов чаще всего связывают с повышенной продукцией в почках эритропоэтина как реакции на гипоксию, развивающуюся при хронической дыхательной недостаточности, сердечной недостаточности, врожденных и приобретенных пороках сердца, болезнях крови. Эритроцитозы возникают при болезни и синдроме Иценко-Кушинга, при усиленной выработке андрогенов.
Эритроцитозы при контузиях, стрессе, гипертоническом синдроме имеют центральный генез.
Реактивные тромбоцитозы наблюдаются у некоторых больных со злокачественными образованиями, после спленэктомии или атрофии селезенки, при гемолитических анемиях, ревматическом полиартрите, атеросклерозе, хроническом гепатите.
Мы уже рассказывали вам про циркулирующую микроРНК, но есть еще одна не менее крутая штука — внеклеточная циркулирующая ДНК (англ. cell-free DNA, circulating DNA). Открыта она была ещё 1948 году. Сейчас к ней усилился интерес, и вот в чём, собственно, дело.
Внеклеточная ДНК (вкДНК) обнаруживается в нескольких жидкостях организма: в плазме и сыворотке крови, моче, слюне, синовиальной, перитонеальной и спинномозговой жидкости.
Мы с вами рассмотрим особенности вкДНК в двух жидкостях: крови и моче. Понятно дело, что так удобней для диагностики.
Источники вкДНК в организме
Как стало известно, вкДНК циркулирует в крови в составе апоптотических телец, микровезикул, нуклеосом, экзосом, нуклеопротеиновых комплексов с белками крови и, предположительно, в свободном виде.
Считается, что источниками возникновения вкДНК в крови являются процессы гибели клеток, созревание эритроцитов, секреция ДНК клетками, а также бактерии и вирусы. Сразу отметим, что последний источник, ДНК бактерий и вирусов, вносят очень незначительный вклад в общий пул циркулирующей ДНК, и уровень экзогенной ДНК во время инфекций не превышает нескольких десятков пкг/мл. Тогда как по современным данным нормальный уровень вкДНК в здоровом организме составляет 3-44 нг/мл в плазме и 50-100 нг/мл в сыворотке крови.
Значительная часть вкДНК в организме, вероятно, появляется в результате гибели клеток, в процессе апоптоза, некроза и нетоза. Ежедневно в организме взрослого человека посредством программируемой клеточной гибели (апоптоза) гибнет около ста миллиардов клеток, в результате чего деградирует около 1г ДНК в сутки.
В процессе апоптоза ядерная ДНК расщепляется специальным ферментом ДНКазой. После чего появляются фрагменты ДНК длиной кратной нуклеосоме (180-200 п.н., п.н. — пар нуклеотидов), которые в составе апоптотических телец (специальной упаковки после апоптоза) должны быть утилизированы макрофагами. Все знают, что пары нуклеотидов (аденин-тимин и гуанин-цитозин) в нашей ДНК повторяются три миллиарда раз. Нуклеосомы — специальные структуры в составе хроматина, состоящие из белков-гистонов, на которые в полтора оборота наматывается нить ДНК.
Дальше происходит странное. По непонятным причинам часть ДНК погибших клеток избегает встречи с макрофагами и попадает в кровь. В разное время проводились эксперименты, подтверждавшие апоптотическую природу вкДНК [1,2].
При разделении вкДНК плазмы здоровых доноров с помощью гель-электрофореза обнаруживаются полосы, соответствующие длинам фрагментов 180-200 п.н. и длинам, кратным этому числу, что соответствует межнуклеосомному расщеплению хроматина при апоптозе. Обнаружение ДНК плода в крови матери также говорит в пользу апоптоза как источника вкДНК [3].
В норме некроз вносит менее значительный вклад в появление вкДНК, увеличивая её количество при тяжёлых травмах. Некротическая вкДНК в плазме обнаруживается в виде более длинных фрагментов — длиной свыше 10 тысяч п.н. С помощью метода ПЦР (полимеразной цепной реакции) возможно различить длинные фрагменты вкДНК, появляющиеся в результате некроза, и более короткие фрагменты — из-за апоптоза.
Кроме апоптоза и некроза существует ещё один малоизвестный вид клеточной гибели, являющийся источником вкДНК — нетоз (NETosis).
При нетозе клетки-нейтрофилы выбрасывают специальные сетеподобные структуры, внеклеточные нейтрофильные ловушки (NET, Neutrophil Extracellular Trap), задача которых — дезактивация проникшего в организм патогена: вирусов, грибов и бактерий. При этом нейтрофил гибнет, выбрасывая ДНК, гистоны, различные белки и ферменты во внеклеточное пространство. Известно, что иногда процесс NET носит патологический характер, способствуя развитию тромбоза, сердечно-сосудистых и аутоиммунных заболеваний, а также рака.
Недавно, в 2018 году, было обнаружено, что при ВИЧ-инфекции происходит гиперактивация нейтрофилов, механизма NET и нетоза. В результате чего происходила обширная гибель иммунных клеток, захваченных сетями нейтрофилов, CD4+ и CD8 + Т-клеток, В-клеток и моноцитов, и развитие сопутствующих сердечно-сосудистых патологий [4].
Ещё один потенциальный источник вкДНК — секреция ДНК нормальными и опухолевыми клетками. Ещё в 1972 году было получено доказательство активного выделения ДНК лимфоцитами во внеклеточную среду [5].
Наличие такое феномена, как выделение ДНК клетками во внеклеточную среду, предполагает существование специальных механизмов переноса ДНК через клеточную мембрану. В ходе исследований было установлено, что высвобождение ДНК из лимфоцитов происходит при активном действии трипсина, проназы и плазмина на фоне дефицита ионов Са2+ и Mg2+. Избыток же ионов кальция ингибирует выход ДНК из клетки [6].
По мнению российских биохимиков из Казанского государственного университета, ещё одним вероятным источником вкДНК в крови может быть совсем неизвестная форма цитоплазматической ДНК, отличная от ядерной и митохондриальной — ДНК, ассоциированная с мембраной диплоидных лимфоцитов человека (Membrane-Associated DNA in the Cytoplasm of Diploid Human Lymphocytes) [7].
Несмотря на то, что этот тип ДНК был открыт в 1971 году, он и сейчас остаётся неизученным, и по нему есть считанные работы одних и тех же авторов, хотя и в PNAS и Nature.
По предположению Абрамовой З.И. с соавторами какая-то часть вкДНК может формироваться из этой цитоплазматической ДНК, на что указывают характерные особенности некоторых фрагментов вкДНК, отличные от ядерной и митохондриальной [6].
Рис.1 Различные пути, которыми вкДНК попадает в циркуляцию.
Более подробно обо всех аспектах биологии вкДНК (иммуномодулирующих эффектах, рецепции к вкДНК на поверхности клеток и пр.) можно прочесть в подробном обзоре профессора Козлова В.А. (НИИ клинической иммунологии СО РАМН) [8].
Внеклеточная ДНК как биомаркер при различных патологиях
Логика подсказывает, что уровни вкДНК должны изменяться при патологиях, которые сопровождает массовая клеточная гибель. В ряде исследований было показано значимое повышение уровней вкДНК при развитии аутоиммунных заболеваний (системной красной волчанки, системной склеродермии, ревматоидного артрита и др.) и что существуют характерные особенности вкДНК, типичные для определённой аутоиммунной патологии 9.
Также известно, что при остром инфаркте миокарда, который сопровождает гибель клеток сердца по типу как некроза, так и апоптоза, уровни вкДНК также повышаются. И это имело потенциальное диагностическое значение, поскольку у пациентов, у которых развились осложнения, были более высокие уровни, чем у тех, кто восстанавливался лучше [11].
У больных, перенёсших острый инсульт, концентрация вкДНК в плазме крови, измеренная в течении 24 часов, коррелирует с тяжестью инсульта и может служить предиктором смертности и тяжести исхода даже у тех пациентов, у которых нет видимых изменений, обнаруживаемых методами нейровизуализации [12,13].
Известно, что для вкДНК характерно наличие большое количества гуанин-цитозин (ГЦ)-последовательностей, которые более устойчивы к разрушению нуклеазами, чем аденин-тимин-фрагменты ДНК. Так, содержание специфической ГЦ-обогащенной последовательности генома — транскрибируемой области рибосомного повтора — в составе вкДНК в несколько раз превышает содержание этого повтора в ядерной ДНК [14].
А при хронических патологиях, сопровождающихся активацией клеточной гибели (ишемической болезни сердца, артериальной гипертонии, аутоиммунных патологиях), содержание этих ГЦ-богатых маркерных последовательностей в вкДНК крови увеличивается в 10 и более раз [15]. Это даёт полную возможность использовать показатели ГЦ-обогащённой рибосомной ДНК в составе вкДНК в качестве биомаркера хронически протекающего патологического процесса.
При борьбе с раком стоит задача обнаружить опухоль на максимально ранней стадии. Тут вкДНК представляет крайний интерес, как биомаркер опухолегенеза.
Точечные мутации в опухолевой вкДНК обнаруживались в крови пациентов задолго до постановки диагноза[16].
Установлено, что для вкДНК характерно гораздо более сильная степень окисления под воздействием активных форм кислорода (АФК), чем для ядерной ДНК.
Так, содержание хорошо известного маркера окисления ДНК, 8-охоdG, в составе ядерной ДНК в норме и при различных патологиях колеблется от 1 до 10 на миллион нуклеотидов, а в составе вкДНК содержание этого маркера составляет 300 и более на миллион нуклеотидов [19].
Резкое повышение содержания 8-охоdG во вкДНК установлено при онкологии и сердечно-сосудистых заболеваниях, которые сопровождаются окислительным стрессом, и может достигать значений в 3000 8-oxodG на миллион нуклеотидов [20].
В целом, считается, что уровни 8-охоdG в составе вкДНК представляют собой чувствительный маркер общего окислительного стресса в организме.
Внеклеточная ДНК как мобильный элемент
Большой и очень важный прорыв в исследованиях роли вкДНК во внутренних процессах произошёл 3 года назад. В 2015 году группой исследователей было сделано захватывающее открытие, показавшее, что вкДНК, подобно мобильным генетическим элементам, способна внедряться в ядерную ДНК и вызывать мутации в геноме [21]. Всё это очень удивительно.
В другой работе были предоставлены данные о поглощении и интеграции фрагментов гена DYS14, специфичного для Y-хромосомы, в мозге женщины, вынашивавшей плод мужского пола [23].
В исследовании 2015 года учёные проследили, как флуоресцентно меченые вкДНК, взятые у больных раком и здоровых людей, без проблем встраивались в ядерную ДНК мышиных фибробластов в опытах in vitro (т.е вне живого организма, в клеточных культурах). Причём, человеческая вкДНК локализовалась в ядрах мышиных клеток в течение нескольких минут, и почти 100% ядер клеток мыши показывали флуоресцентные сигналы в течение 30 минут.
Секвенирование всего генома мышиных клеток показало присутствие в нём фрагментов ДНК человека, включая характерные мобильные элементы Alu. Кроме этого, авторы обнаружили индукцию γ-H2AX-очагов, возникающих при повреждении ДНК, а также повышение активности каспазы-3 и экспрессии генов ATM, p53, p21, GADD-34 и ДНК-лигазы. Что всё вместе свидетельствует о повышенной нестабильности генома, активации реакции ответа на повреждения ДНК и апоптоза.
Затем авторы проверили действие чужеродной вкДНК in vivo, на живом организме. Мышам внутривенно вводили человеческую вкДНК, фрагменты которой затем обнаружили в сердце, легких, печени и мозге мышей, умерщвленных через 7 дней после инъекции.
Причём, ведённые мышам частицы человеческой ДНК оказались способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и проникать в мозг. Как и в случае с клетками в культуре, внутривенное введение вкДНК вызывало индукцию γ-H2AX, проапоптотической каспазы-3 и активацию ответа на повреждения ДНК. И именно ответ на повреждение ДНК, по мнению учёных, играет центральную роль интеграции вкДНК в ядерную.
Надо ли говорить, что этот вывод очень сильно противоречит всем представлениям о старении на сегодняшний день.
Логика подсказывает, что этой гипотезе соответствовала бы следующая зависимость: чем больше продолжительность жизни вида, тем меньше у особи этой формы ДНК и/или она для данного вида менее опасна.
Но до тех пор, пока такое сравнительное исследование не выполнено, остается полагать, что у долгоживущего вида (человек) и короткоживущего (мышь) вкДНК производятся, предположительно, в относительно сравнимых количествах. И обнаружение повышенных концентраций этих молекул у пожилых вполне может быть, наоборот, следствием процесса старения, а не его причиной.
Хотя это такое следствие, которое может усиливать причину. Читай статью Беликова.
Кроме этого, авторы открытия предлагают отнести вкДНК к ещё одному классу мобильных генетических элементов. И тогда, возможно, получит своё объяснение широкое участие в эволюции такого процесса, как горизонтальный перенос генов, как у беспозвоночных, так и позвоночных представителей животного мира. Благодаря которому, по одним из последних данных, геном человека мог заимствовать у других видов несколько десятков генов [24]
Остаётся открытым очень важный вопрос: как именно вкДНК попадают в клетку? Имеющиеся гипотезы включают предположения, что частицы, содержащие ДНК, могут проникать в клетки через имеющиеся в мембране поры, а также посредством разных типов эндоцитоза, протеогликан-зависимого макропиноцитоза или при взаимодействии с мембранными белками.
Внеклеточная ДНК при ожирении, воспалении, рентгеновском облучении и стрессе различной природы
Ещё одно интересное открытие было сделано год спустя японскими исследователями. Они смогли описать активное участие вкДНК, появившейся в крови в результате гибели адипоцитов у людей с ожирением, в развитии воспаления и резистентности к инсулину. Ключевым фактором, взаимодействующим в этих процессах с вкДНК, была молекула врождённого иммунитета Toll-подобный рецептор 9 (TLR9) [25].
Не обошлось и без интриги со стороны российских учёных из Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Они установили, что рентгеновское облучение и антидиабетический препарат метформин вызывают увеличение выведения с мочой вкДНК (ядерной и митохондриальной) у крыс.
Их данные показали, что до опытов количество ядерной вкДНК было на 40% выше, а митохондриальной вкДНК — на 50% выше в моче пожилых крыс по сравнению с молодыми.
Через 12 часов после облучения содержание я-вкДНК и мт-вкДНК в моче молодых крыс увеличилось на 200% и 460% соответственно по сравнению с контролем, тогда как в моче пожилых крыс оно повысилось на 250% и 720%.
Через 6 часов после введения метформина другим крысам, количество я-вкДНК и мт-вкДНК в моче молодых крыс было повышено на 25% и 55% и на 50% и 160% в моче пожилых крыс.
По мнению авторов, эти данные говорят о том, что рентгеновские лучи и метформин вызывают значительное увеличение вкДНК в моче крыс (особенно старых), вызванное активной гибелью клеток в тканях. Эти результаты также позволяют предположить, что метформин, возможно, действует как сенолитик, инициируя гибель старых клеток, содержащих структурные и функциональные нарушения [26].
В октябре прошлого года, учёные проследили взаимосвязь уровней вкДНК с психическим стрессом и физическими нагрузками у молодых людей в возрасте 18-36 лет. Результаты показали двукратное увеличение вкДНК после острого психосоциального лабораторного стресса (TSST) и пятикратное увеличение вкДНК после упражнений на беговой дорожке (с достижением истощения сил бегущего).
Было также зафиксировано повышенное количество более коротких фрагментов вкДНК, характерное для апоптоза, в крови после физического истощения.
Внеклеточная митохондриальная ДНК показала одинаковое увеличение после обеих стрессовых нагрузок. Кроме этого, профили метилирования вкДНК, используемые в этой работе в качестве маркера для различного клеточного происхождения, значительно различались для разных стресс-тестов.
Для анализа метилирования учёными был выбран активно участвующий в эмбриональном развитии ген HOXA5 из-за специфичности его метилирования в разных типах клеток. Так, для него характерно гиперметилирование в мышечных клетках, гипометилирование в клетках мозга, из клеточных линий гиппокампа и культивируемых нейронов, и дифференциальное метилирование в клетках крови.
Метилирование гена HOXA5 во вкДНК понижалось сразу после психосоциального стресса и увеличивалось после физического стресса, что, по мнению авторов, указывает на различные клеточные источники активного высвобождения ядерной ДНК. [27].
Внеклеточная ДНК и старение
Теперь главное. Рассмотрим взаимосвязь уровней и специфических особенностей вкДНК со старением.
Первые работы, показавшие такую взаимосвязь, были опубликованы в 2011–13 годах. Финские микробиологи и иммунологи из университета Тампере изучили показатели вкДНК у долгожителей старше 90 лет, участников исследования Vitality 90+, и у молодых людей (в возрасте 22–37 лет) в качестве контрольной группы.
Результаты их работ показали, что концентрация вкДНК у долгожителей была значительно выше, чем у молодых. Также были характерные различия вкДНК: у старых людей она была представлена больше низкомолекулярными фрагментами, у молодых — больше высокомолекулярными, то есть более длинными.
В следующих работах эта же группа показала, что уровни вкДНК имели чёткую взаимосвязь с маркерами воспаления (положительно коррелировали с уровнем С-реактивного белка, сывороточного амилоида А (SAA) и др.) и смертностью у людей старше 90 лет. А также то, что более высокие уровни общей и гипометилированной вкДНК были связаны с системным воспалением и развитием старческой астении (frailty) 29.
Два самых свежих последних прошлогодних исследования по вкДНК и старению показали характерные эпигенетические изменения этой ДНК.
В одном из них команда учёных проанализировала, как с возрастом изменяется метилирование мобильных генетических элементов LINE-1 и Alu во вкДНК здоровых людей, в возрасте от 23 до 61 года.
Элемент LINE-1 имеет длину около 6 тыс.п.н., тогда как высокомолекулярные фрагменты вкДНК, для сравнения, имеют размер более 10 тыс.п.н.
LINE-1 относится к ретроэлементам, т.е. к мобильным элементам, которые для своего размножения используют обратную транскрипцию, перенос генетической информации с РНК на ДНК. LINE-1 — единственный известный на сегодня мобильный элемент генома, который сохраняет способность к размножению и перемещению своих копий в геноме. Также, это самый многочисленный из подвижных структур человека: копии LINE-1 занимают в ДНК огромную долю — пятую часть всего генома.
Результаты исследования показали, что по мере старения происходит значительное уменьшение метилирования ретроэлементов LINE-1 и Alu, причём этот процесс заметно интенсивнее проходил у курильщиков.
Как сегодня установлено, активность элементов LINE-1 и Alu, которые способны вставлять свои копии в геном, вносят вклад в значительную часть генетических заболеваний человека и рака. Известно о более 100 опосредованных LINE-1 инсерциях (вставках), которые приводят к генетическим заболеваниям человека, и найдено несколько вставок LINE-1, которые прерывают гены-супрессоры опухолей и провоцируют рак [31].
Во втором исследовании учёные подтвердили снижение с возрастом метилирования элементов LINE-1 и Alu в составе вкДНК. Причём, среди 4 групп в исследовании (здоровые долгожители старше 100, нездоровые долгожители старше 100 лет, пожилые люди (71 год) и молодые люди (25 лет)) схожие характеристики вкДНК имели здоровые долгожители с молодыми людьми и пожилые люди с нездоровыми долгожителями:
Таким образом, внеклеточная циркулирующая ДНК оказалась тесно связана с состоянием здоровья и процессами, происходящими в организме в ходе старения: окислительным стрессом, воспалением и возрастзависимыми патологиями.
Современные методы исследования, такие, как количественная ПЦР в реальном времени, позволяют использовать вкДНК в качестве очень чувствительного биомаркера процессов, связанных со старением.
Проведённые исследования показали большую потенциальную ценность анализа вкДНК в диагностике рака, в траспланталогии, при сердечно-сосудистых заболеваниях и болезнях почек, фиброзе, в пренатальной диагностике (во время беременности), при травмах и сепсисе, а также в спортивной медицине.
Полученные данные о том, что вкДНК может проявлять свойства мобильного элемента и встраиваться в ядерную ДНК, тем самым влияя на развитие связанных с мутациями патологий и старением в целом, также представляют несомненный интерес.
Всё это требует дальнейших исследований и уточнений.
Обзор подготовили: Алексей Ржешевский и немного Михаил Батин
Читайте также:
