| Приоритеты: |
Использование: в ветеринарии, иммунологии. Сущность изобретения: в способе диагностики лептоспироза свиней методом микроточечного иммуноферментного анализа на основе дот-блоттинга в качестве антигена используют антиген, полученный выращиванием лептоспир серогрупп Pomona, Tarassovi, Grippotyhosa, Icterohacmorrhagiae, Canicola, Hebdomadis и Sejroe на водно-сывороточной питательной среде, смесь культур в равных соотношениях центрифугируют при 45000 g в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляют, полученный осадок подвергают дезинтеграции при частоте 20 кГц, мощности 100 Вт в течение 2 мин, экстракцию антигена проводят 50%-ным этиловым спиртом в течение 24 ч при -20 o С и 90%-ным этиловым спиртом при -20 o 0с в течение 6 сут, отделение антигена осуществляют центрифугированием при 80000 g в течение 30 мин, надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и доводят концентрацию белка в антигене до 20 мкг/см 3 .
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к диагностике инфекционных заболеваний, и может быть использовано для диагностики лептоспироза у свиней.
Известен способ диагностики лептоспироза путем добавления лептоспирозной культуры к исследуемой сыворотке крови животного с последующим определением титров лептоспирозных антител. В качестве антигена для обнаружения специфических антител в сыворотке крови животных с помощью реакции микроагглютинации (РМА) используют живые культуры лептоспир различных серологических групп. Диагностические штаммы лептоспир лаборатории поддерживают периодическими пересевами через каждые 10-15 дн. В реакции используют культуры лептоспир в возрасте 5-10 дн без признаков агглютинации и лизиса с накоплением микробных клеток 50-100 млн/см 3 .
Однако известный способ трудоемок, учет реакции необходимо проводить только под микроскопом. Кроме того, способ требует постоянного поддерживания в лаборатории полного набора живых диагностических лептоспирозных культур, что представляет угрозу здоровью персонала ветеринарных лабораторий, так как в соответствии с положением Министерства здравоохранения СССР лептоспир включен во вторую группу инфекций, требующих особых мер предосторожности при работе.
Известен также антигенный состав для иммуноферментного выделения антител к лептоспирам, способ приготовления и его применение для диагностики лептоспироза.
В качестве антигена используют надосадочную жидкость культуры лептоспир: L. biflexa Patoc I, L.biflexa Sao Paolo, L.andamana CH II, L. andamana Bovedo.
Лептоспиры выращивают на питательной среде 55955, содержащей минеральные соли, микроэлементы, витамины, твин и бычий сыворотки альбумин (БСА).
Каждый из штаммов отдельно выращивают в термостате в течение 8-10 дн при +28 о С до получения средней концентрации 1,10 8 -2,10 8 лептоспир в 1 см 3 . После проверки на незараженность, все культуры смешивают и обрабатывают чистым формальдегидом из расчета 1,5 см 3 на 100 см 3 смеси лептоспир и выдерживают 20-40 мин, затем смесь культур выдерживают в кипящей бане в течение 30 мин, охлаждают и доводят рН до 9,6, центрифугируют при 10000 g в течение 45 мин и собирают надосадочную жидкость, которую используют в качестве антигена. Для определения в сыворотке крови антител к возбудителю лептоспироза используют метод ELISA, применяя микроплаты с плоским дном. Учет реакции проводят визуально.
Однако полученный вышеуказанным способом антиген для выявления специфических антител к возбудителю лептоспироза в сыворотке крои людей менее специфичен, так как при изготовлении антигена используют непатогенные лептоспиры (L.biflexa), которые не вызывают заболевания лептоспирозом у животных и людей.
Для выращивания культур лептоспир требуются дорогостоящие питательные среды, для постановки реакции микроплаты.
Цель изобретения повышение эффективности способа диагностики лептоспироза у свиней и создание безопасных условий труда для персонала диагностических лабораторий.
Цель достигается тем, что лептоспирозные антитела в сыворотке крови свиней определяют с помощью способа иммуноферментного анализа (ИФА) на основе дот-блоттинга, с использованием инактивированных (убитых) антигенов и с визуальной (без инструментальной) оценкой результатов реакции.
Способ осуществляют следующим образом.
П о л у ч е н и е а н т и г е н а. Лептоспиры серогрупп Помона, Тарассови, Гриппотифоза, Иктерогеморрагия, Каникола, Гебдомадис и Сейро выращивают в водно-сывороточной питательной среде, каждую культуру в отдельности и смесь культур в равных соотношениях центрифугируют при 15 тыс. в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а полученный осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и микробные клетки лептоспир подвергают дезинтеграции при частоте 20 кГц, мощности 100 Вт в течение 2 мин. Затем проводят экстракцию антигена 50%-ным этиловым спиртом в течение 24 ч при -20 о С и 90%-ным этиловым спиртом при -20 о С в течение 6 сут. Полученный экстракт центрифугируют в течение 30 мин при 25 тыс g. После удаления надосадочной жидкости осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и доводят концентрацию белка в антигене по Лаури до 30 мкг/см 3 .
Полученные антигены наносят с помощью капилляра на нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,20-0,45 мкм и высушивают при комнатной температуре.
П р о в е д е н и е а н а л и з а. Сыворотку крови свиней исследует в планшетах в разведениях от 1:50 до 1:3200 и т.д. до титра.
Перед проведением анализа нитроцеллюлозные мембраны, сенсибилизированные лептоспирозными антигенами, предварительно выдерживают в 3%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин и затем нитроцеллюлозные мембраны, сенсибилизированные монолептоспирами разных серологических групп, а также общим антигеном вносят в планшеты в лунки с сыворотками и инкубируют 1 ч при комнатной температуре (18-24 о С) или 30 мин при 37 о в термостате. Далее осторожно удаляют раствор из каждой лунки, дважды с интервалом в 10 мин промывают каждую лунку буферным раствором. Затем в каждую лунку добавляют 0,5 см 3 разведенного конъюгата белка А с пероксидазой хрена и выдерживают 1 ч при 37 о С, проводят повторно отмывание и в каждую лунку добавляют 0,5 см 3 окрашивающего раствора (хромогена). При появлении интенсивно окрашенного пятна на нитроцеллюлозном блоке, инкубированном с положительной контрольной сывороткой (как правило, реакция проходит в течение 3-5 мин), тщательно удаляют из всех лунок следы раствора и промывают нитроцеллюлозные полоски в дистиллированной воде и оставляют на 10 мин при комнатной температуре для подсыхания, после чего проводят учет реакции.
У ч е т р е а к ц и и. Результат реакции читают против белого фона. Положительный контроль должен давать точки синего цвета на почти бесцветном фоне нитроцеллюлозного блока. Образцы, дающие интенсивность точек, сравнимую с положительным контролем, рассматриваются как положительные на наличие лептоспирозных антител. Образцы, у которых интенсивность точек равна или ниже интенсивности фона нитроцеллюлозного блока, рассматриваются как отрицательные на наличие лептоспирозных антител.
П р и м е р. Были тестированы в "слепом опыте" 100 проб сывороток крови свиней, часть которых были положительными на наличие лептоспирозных антител по результатам реакции микроагглютинации (РМА) к лептоспирам серогрупп Помона, Тарассови, Иктерогеморрагия, Каникола, Гебдомадис и Сейро.
В результате проверки установлено, что в сыворотках, положительных по результатам РМА, выявлялись лепстопирозные антитела к тем же серогруппам и в тех же титрах с помощью иммуноферментного способа на основе дот-блоттинга были отрицательными (100% специфичность).
Исследование сыворотки крови свиней с помощью иммуноферментного способа на основе дот-блоттинга проведены в неприспособленном помещении. Результат реакции получен в течение 2,5 ч.
Таким образом, предлагаемый способ диагностики лептоспироза у свиней с помощью микроточечного иммуноферментного анализа на основе дот-блоттинга значительно упрощает диагностику лептоспироза благодаря применению в качестве антигенов убитых штаммов лептоспир, вследствие чего устраняются большие трудности, связанные с необходимостью поддержании и использования в диагностических лабораториях полного набора живых лептоспирозных культур. Кроме того, упрощается также учет полученных результатов реакции, который проводится визуально, а не в "темном поле зрения" микроскопа, как при РМА, исключается возможность неправильной интерпретации результатов.
Благодаря способу повышается производительность труда в связи с устранением необходимости просматривать под микроскопом и оценивать результаты реакции всех разведений сывороток с каждым из 23 сероваров лептоспир, появляется возможность одномоментно в "полевых условиях" исследовать большое количество сывороток крови свиней благодаря использованию микротитрационных панелей, а также обеспечивается безопасность работы персонала благодаря использованию убитого диагностикума вместо живых культур лептоспир.
Антиген, приготовленный из патогенных культур лептоспир, более специфичен по сравнению с антигеном, при изготовлении которого были использованы непатогенные штаммы лептоспир.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА СВИНЕЙ, включающий определение наличия антител к возбудителю лептоспироза в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием специфического антигена и последующим учетов результатов реакции, отличающийся тем, что для определения наличия антител используют метод микроточечного иммуноферментного анализа на основе дот-блоттинга, а в качестве антигена - антиген, полученный выращиванием лептоспор серогрупп Pomona, Tarassovi, Yrippotyphosa, Icterohacmorrhagiae, Canicola, Hebdomadis и Sejroe, на водно-сывороточной питательной среде, смесь культур в равных соотношениях центрифигурируют при 45000 g в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляют, полученный осадок подвергают дезинтеграции при частоте 20 кГц, мощности 100 Вт в течение 2 мин, экстракцию антигена проводят 50%-ным этиловым спиртом в течение 24 ч при температуре минус 20 o С и 90%-ным этиловым спиртом при температуре минус 20 o С в течение 6 суток, отделение антигена осуществляют центрифугированием при 80000 g в течение 30 мин, надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и доводят концентрацию белка в антигене до 20 мкг/см 3 .
![]()
Перетрухина А. Т., Блинова Е. И.,
Спирохетозы - большая группа инфекционных заболеваний человека и животных, возбудителями которых являются патогенные спирохеты, относящиеся к группе 1 определителя бактерий Берджи.
Спирохетозы распространены повсеместно. Многие спирохетозы изучены недостаточно. Наиболее изученные спирохетозы подразделяются на следующие группы.
1. Спирохетозы кишечные, к которым относятся лептоспирозы, возбудители относятся к роду Leptospira .
2. Спирохетозы дыхательных путей (бронхиальный спирохетоз - заболевание, встречающееся в тропических странах, реже в Америке и Европе), возбудитель относится к роду Leptospira.
3. Спирохетозы кровяные, или трансмиссивные, передающиеся вшами или клещами, возвратные тифы, возбудители принадлежат роду Borrelia.
4. Спирохетозы наружных покровов, к которым относятся сифилис, фрамбезия, беджель, пинта. Возбудители данных спирохетозов относятся к роду Treponema.
К спирохетозам относят также заболевания, вызываемые ассоциацией спирохет и других бактерий: ангину Симановского - Плаута - Венсана, язвенный стоматит, фагеденическую язву тропиков, содоку и др.
По принадлежности возбудителей спирохетозов к различным родам можно выделить 3 группы: боррелиозы, лептоспирозы и трепонематозы (венерические - сифилис и невенерические - фрамбезия, пинта и пр.)
Боррелиозы
Патогенные боррелии вызывают самые разнообразные заболевания - от возвратных тифов до иксодового клещевого боррелиоза Лайма.
Возбудители тонкие, спиралевидные микроорганизмы. Подвижны, грамотрицательны. По типу дыхания - анаэробы. Требовательны к питательным средам.
Ферментативная активность боррелий не выражена.
Основным фактором вирулентности являются адгезины, к которым относится коллагенсвязывающий белок, и белок, связывающий фермент урокиназу. Антигенная структура монолитна, серовары не обнаружены.
Источником заболевания является человек. Переносчиками при возвратном тифе служат платяные и волосяные вши, при болезни Лайма - иксодовые клещи.
Микробиологическая диагностика сводится к использованию иммунологических и молекулярно-генетических методов - ИФА и ПЦР.
Профилактика основывается на системе общих противоэпидемических и санитарных мероприятий.
Средства специфической профилактики пока отсутствуют. Для лечения используют антибиотики, в случае микст-инфекций (болезнь Лайма, клещевой энцефалит) - дополнительно используют противоклещевой гамма-глобулин (см. Препараты, применяемые против клещевого энцефалита).
Лептоспирозы
Глобальные природноочаговые инфекции людей, диких, сельскохозяйственных, домашних и промысловых животных, водоплавающих птиц, сходные по патогенезу, клинике и эпидемиологии.
Лептоспиры - мелкие, спиралевидные бактерии. Подвижные, грамотрицательные, микроаэрофилы.
Источником инфекции являются больные животные, инфицирующие водные объекты. Употребление зараженной воды для питья и бытовых целей, купание, проведение работ в системе канализации и другие контакты человека с такой водой приводят к заражению. Люди также заражаются при уходе за больным скотом. Возбудитель проникает в организм человека через желудочно-кишечный тракт, слизистые оболочки, поврежденные кожные покровы.
Материалом для исследования на лептоспироз является кровь. К ускоренным методам диагностики относится метод прямой микроскопии. Основным методом диагностики является серологический метод исследования: реакция микроагглютинации с живыми культурами лептоспир для экспресс- диагностики и ретроспективного выявления лептоспироза, а также для обнаружения стертых и бессимптомных форм. Учитывая природную очаговость лептоспирозной инфекции и значительное количество серологических групп возбудителя, необходимо иметь наборы культур лептоспир и диагностических сывороток к ним.
Специфическую профилактику проводят убитой нагреванием поливалентной лептоспирозной вакциной с 0,3 % фенолов в качестве консерванта. Прививки проводят двукратными подкожными инъекциями.
Для лечения больных лептоспирозами применяется специфический противолептоспирозный гамма-глобулин.
Лептоспирозная вакцина
Предназначена дл активной иммунизации населения по эпидемиологическим показаниям.
В состав лептоспирозной вакцины входят по 2-4 штамма каждого серотипа патогенных лептоспир, убитых нагреванием с добавлением 0,3 % фенола. Для изготовления вакцины отбираются штаммы лептоспир, обладающие типичными антигенными и иммуногенными свойствами и способные вызывать гибель или заболевание кроликов весом до 300 г при подкожном введении 2 мл живой культуры.
Каждый штамм, входящий в состав вакцины, выращивается отдельно. Для вакцины отбирают культуры, содержащие не менее 50 лептоспир в поле зрения и не старше 14-дневного возраста.
Каждый серотип лептоспир собирается в отдельную бутыль и инактивируется при 56 °С в течение 1 часа. Затем к охлажденной до комнатной температуры взвеси прибавляется 0, 3 % фенола.
Затем культуры различных серотипов смешиваются в равных объемах. После взбалтывания проводится контроль на специфическую стерильность методом посева на дистиллированную воду с 2 % кроличьей сыворотки.
Вакцина разливается в ампулы по 10 мл и контролируется на стерильность и морфологию по общим методикам. Безвредность проверяется путем подкожного введения 0,5 мл вакцины 3 белым мышам. Мыши должны оставаться живыми в течение 3 суток. Проверка на иммуногенность проводится на шести кроликах весом до 300 г, которых иммунизируют подкожно двукратно дозами 1 и 2 мл с 5-дневным интервалом. Через 10-12 дней после последней инъекции кроликов заражают живой культурой лептоспир каждого типа. Кролики должны оставаться живыми в течение 10 дней наблюдения.
Готовая вакцина представляет собой прозрачную или слегка опалесцирующую бесцветную жидкость.
Препарат предназначен для специфической профилактики лептоспирозов в очагах инфекции. Плановые прививки проводятся в антропургических и природных очагах, независимо от наличия зарегистрированных заболеваний. Прививки проводятся также по эпидемическим показаниям - при угрозе распространения инфекции среди людей.
Вакцина вводится подкожно двукратно, с промежутком в 7-10 дней: первая доза - 2 мл, вторая - 2,5 мл. Через год проводится ревакцинация - 2 мл.
Противопоказания к вакцинации те же, что и при применении других вакцин.
Срок годности вакцины - 1,5 года.
Противолептоспирозный гамма-глобулин
Препарат представляет собой гамма-глобулиновую фракцию, извлеченную из гипериммунной поливалентной противолептоспирозной сыворотки волов или лошадей, иммунизированных различными серологическими типами лептоспир.
Препарат содержит антитела к различным типам лептоспир, имеет 10 % белка, 4,5 % остаточного спирта и в качестве стабилизатора - 2-4 % гликогена.
Препарат должен быть стерильным, безвредным, апирогенным и содержать специфические антитела к каждому серотипу, определяемые реакцией лизиса и агглютинации лептоспир в титре не менее 1:8000.
Лептоспирозный гамма-глобулин выпускается в ампулах по 5 мл, а для десенсибилизации - по 1 мл.
Противопоказаниями к применению гамма-глобулина служат спазмофилия и бронхиальная астма.
Лептоспирозный гамма-глобулин применяется в остром периоде заболевания, особенно при тяжелых формах, а также при ранних и поздних осложнениях после лептоспирозов.
Гамма-глобулин вводится внутримышечно после десенсибилизации: детям в возрасте от 8 до 13 лет - в дозе 3 мл, старше 14 лет и взрослым - 5-10 мл. Общая лечебная доза на курс лечения детям 8-13 лет - 9-10 мл, старше 14 лет и взрослым - 20-30 мл.
Протволептоспирозный гамма-глобулин следует хранить в защищенном от света помещении при температуре от 2 до 8 °С. Препарат, подвергшийся случайному замораживанию и оттаиванию, при сохранении физических свойств (отсутствие хлопьев, осадка, помутнения) годен для применения.
Срок годности препарата - 2 года. По истечении его образцы серии могут быть использованы для переконтроля. При сохранении активности возможно продление срока годности еще на 6 месяцев.
Лептоспирозный диагностикум (сухой)
Препарат предназначен для диагностики лептоспирозов в реакции связывания комплемента (РСК).
Для изготовления его применяют штаммы лептоспир, принадлежащие к 11 серотипам. Производственные штаммы хорошо растут на жидких питательных средах, агглютинируются не менее, чем до 2/3 титра гомологичной сывороткой с титром 1:10000; в первых разведениях наблюдается лизис лептоспир.
Специфическая активность определяется в РСК со специфической иммунной кроличьей сывороткой с титром 1:10000 (не меньше). Готовый препарат должен обладать специфической активностью в разведении 1:10.
Диагностикум выпускают в сухом виде, он представляет собой порошок белого или слегка желтоватого цвета.
Срок годности - 3 года.
Трепонематозы
К этой группе заболеваний относятся венерические (сифилис) и невенерические (фрамбезия, пинта) инфекции.
Возбудители - трепонемы - характеризуются сложными условиями культивирования. Могут расти в культурах тканей. Пересевы и пассажи не удаются.
Трепонемы - мелкие, туго спирализованные микроорганизмы. Подвижные, грамотрицательные, но окрашиваются плохо. Анаэробы и микроаэрофилы. Неустойчивы во внешней среде.
Трепонематозы - антропогенные заболевания. Пути передачи: в случае сифилиса - половой, но возможна передача и при тесных неполовых контактах, в случае невенерических инфекций - контактно-бытовой.
Трепонемы в большинстве не продуцируют экзотоксинов, но при этом обладают цитотоксической активностью в отношении нейробластов и других клеток. Кроме того, к факторам агрессии относятся протеины, схожие с бактериальными гемо-
лизинами.
Основные антигенные детерминанты трепонем - компоненты наружной стенки (белковые и полисахаридные) и компоненты капсулоподобного чехла (липидные и полисахаридные антигены).
Лабораторная диагностика не позволяет дифференцировать невенерические заболевания от сифилиса, диагноз невенерических трепонематозов ставится исключительно по клиническим признакам.
Диагностика сифилиса включает микроскопические, биологические методы, молекулярно-генетические методы - ПЦР. Материалом для исследования являются кровь и спинномозговая жидкость.
Также используются непрямые (серологические) методы выявления антител к возбудителю. Они включают реакцию Вассермана, по механизму представляющую реакцию связывания комплемента и другие методы по выявлению липоидных антител.
В последнее время часто используются специфические трепонемные тесты со специальным антигеном бледной трепонемы - РНГА, ИФА, РИФ и РИБТ (реакция иммобилизации бледных трепонем).
Иммунитет инфекционный и существует до тех пор, пока в организме имеется возбудитель. Ввиду значительных трудностей культивирования трепонем на искусственных средах попытки создать вакцины обречены на провал.
Лечение проводится антибиотиками.
Антигены для серологической диагностики сифилиса
Для серологического диагноза сифилиса методом постановки реакций связывания комплемента и осадочных применяются неспецифические антигены.
В настоящее время в качестве антигенов для серологических реакций употребляют спиртовые экстракты из органов животных - неспецифические антигены. Качество спиртовых экстрактов зависит в основном от находящихся в них липоидов. При прибавлении к такому липоидному экстракту незначительных доз холестерина активность экстракта повышается. Холестерин сам по себе не обладает такой активностью.
Неспецифический антиген для реакции Вассермана готовят из мышц сердца быка или человека, пораженных сифилисом, в виде спиртовых экстрактов с добавлением 0,25-0,3 % холестерина. К мышечной ткани, освобожденной от жира и сухожилий, хорошо измельченной, прибавляют 96 % спирт (на 100 г ткани - 125 г спирта) и оставляют на сутки при комнатной температуре. Выпавший при этом осадок отфильтровывается через бумажный фильтр, оставшаяся на фильтре масса высушивается в термостате при 37 °С, затем растирается в ступке в мелкий порошок и заливается ацетоном. Смесь часто встряхивают и сохраняют при комнатной температуре в течение 7-8 суток. Благодаря обработке ацетоном экстракт освобождается от балластных веществ.
После повторного фильтрования через бумажный фильтр масса, оставшаяся на фильтре, промывается чистым ацетоном, высушивается в термостате при 37 °С и опять растирается в порошок. В бутыль с высушенным порошком прибавляют 96 % спирт.
Отфильтрованный экстракт, к которому добавлен холестерин, является антигеном для постановки реакции Вассермана.
Срок годности данного антигена - 7-8 дней.
Антиген для осадочных реакций (реакций преципитации) Кана и Закс-Витебского также готовят в виде спиртовых экстрактов из мышц сердца быка.
Антиген для реакции Кана приготовляется следующим образом: мышцы сердца быка, зараженные трепонемами, после освобождения от жира и сухожилий пропускают 4 раза через мясорубку. Полученная масса распределяется тонким слоем в бактериологических чашках и высушивается в сушильном шкафу при 37 °С. Высушенные мышцы измельчают в фарфоровой ступке. В колбу всыпают определенную навеску этого порошка, заливают эфиром и экстрагируют для удаления нейтральных жиров в течение 10 минут, затем фильтруют. Тонкий слой порошка, оставшийся на фильтре, после высушивания при комнатной температуре ссыпается обратно в колбу, где снова подвергается обработке в течение 10 минут новой порцией эфира при постоянном встряхивании смеси. Экстрагирование эфиром производится четыре раза. Освобожденный от эфира порошок высушивается в течение 12-15 часов в термостате при 37 °С и экстрагируется 96 % спиртом. Смесь встряхивается в течение 10 минут и оставляется в темном месте на 5 дней при комнатной температуре, причем в первые 3 дня производится ежедневное встряхивание по 10 минут, остальные двое суток смесь отстаивается. Затем экстракт фильтруется через двойной бумажный фильтр и к нему добавляется 0,6 % холестерина. Перед употреблением антиген необходимо подогревать в термостате при 37 °С или на водяной бане для растворения кристаллов холестерина. Перед употреблением для реакции он разводится физиологическим раствором согласно указаний на этикетке.
Антиген Кана сохраняется в течение нескольких месяцев, не изменяя своего первоначального титра.
Антиген для реакции Закс-Витебского готовится следующим способом: мышцы бычьего сердца, инфицированные трепонемами и освобожденные от жира и сухожилий, пропускаются 2-3 раза через мясорубку; полученную массу растирают в ступке, помещают в банку с притертой пробкой и заливают 96 5 спиртом. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 месяца при ежедневном встряхивании в течение 10-15 минут. Спиртовой экстракт отфильтровывают и выпаривают досуха в колбе до получения плотного коричневого осадка, к которому добавляют 1/3 первоначального объема горячего этилового спирта, при этом растворяются только активные липоиды.
Полученный спиртовой экстракт оставляют на 2-3 дня при комнатной температуре, после чего сливают в чистую колбу и добавляют 0,45 % холестерина.
Перед постановкой реакции антиген титруется.
Все антигены для реакций связывания комплемента и реакций преципитации разливаются в ампулы и контролируются на стерильность и активность. Рабочая доза препарата и конкретный срок годности указываются на этикетке.
Антиген, сорбент и люминесцирующая сыворотка для РИФ
Для получения сыворотки кровь берут из вены. Сыворотку инактивируют однократно при 56 °С 30 минут и хранят при 4 °С
или -20 °С.
В качестве антигена используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из семисуточного орхита кролика. Для получения орхита кролика заражают интратестикулярно взвесью бледных трепонем в объеме 0,5-0,7 мл (50-60 трепонем в темном поле зрения). На 7-е сутки после заражения кроликов обескровливают, забивают и удаляют яички, которые очищают от оболочек, жира и придатков, разрезают на 10-15 кусочков каждое, заливают во флаконе 10-15 мл стерильного физиологического раствора хлорида натрия рН 7,2 и встряхивают 10-20 минут. Взвесь бледных трепонем сливают с кусочков яичка в стерильные пробирки и оставляют при 4 °С на сутки, затем отделяют от осадка, состоящего из клеток крови, сперматозоидов и крупных частиц, и сохраняют в тех же условиях или в лиофильно высушенном состоянии до использования. Перед постановкой реакции из взвеси бледных трепонем готовят мазки на стеклах и фиксируют их химически чистым ацетоном в течение 15 минут.
Антиглобулиновую люминесцирующую сыворотку перед использованием в реакции иммунофлюоресценции титруют с трепонемным антигеном и сыворотками больных сифилисом и здоровых людей. Рабочим титром принято считать такое разведение люминесцирующей сыворотки, которое обеспечивает надежное выявление специфических антител в сыворотке больных сифилисом и не дает неспецифических результатов при постановке реакции с сывороткой здоровых людей. Титр должен быть проверен на 100-150 сыворотках, и только после этого допускается использование данной серии в реакции иммунофлюоресценции с диагностической целью.
В качестве сорбентов за рубежом для реакции иммунофлюоресценции с абсорбцией или блокированием неспецифических антител специальными препаратами применяют коммерческие штаммы трепонем Рейтера, разрушенные ультразвуком, или концентрат из бульонной культуры этих трепонем.
Реакция иммунофлюоресценции ставится нестерильно, однако антиген, сорбент и люминесцирующая сыворотка должны сохраняться в стерильных условиях.
Срок годности препаратов - 1 год.
Читайте также:
Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.
Copyright © Иммунитет и инфекции
