Набор для латекс-агглютинации пневмококков

Латексная агглютинация

Наборы для идентификации и дифференциации микроорганизмов из клинического материала или из чистой культуры методом латексной агглютинации.

Выпускаются в двух форматах:

1) Жидкие

Латексный реагент представлен в жидкой форме, хранение при + 2-8° С 1 год

Латексный реагент нанесен на реакционную карточку и лиофилизирован, хранение при + 2-25° С до 2 лет

Артикул

Название (русское/английское)

Фасовка

Описание

Бактериальный менингит

Набор Wellcogen на менингококковые инфекции/Wellcogen Bacterial Antigen Kit

Быстрый тест для прямого определения антигенов в жидкостях тела методом латексной агглютинации (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды):

- Streptococcus гр. B

- H. influenzae тип b

- N. meningitidis групп A, C, Y, W135

- N. meningitides гр. B/E.coli K1.

• Время реакции – 3 минуты
• Чувствительность – 97% *
• Специфичность – более 98%
• В состав набора входят все необходимые компоненты

*для Н. influenzae тип b

Набор Wellcogen для определения H. influenzae b/Wellcogen Haemophilus influenzae b Test Kit

Прямое определение антигенов в жидкостях тела (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды)

Набор Wellcogen для определения N. meningitidis A, C, Y, W 135/Wellcogen Neisseria meningitidis A, C, Y, W135 Test Kit

Прямое определение антигенов в жидкостях тела (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды)

Набор Wellcogen для определения N. meningitidis B/E. coli K1/Wellcogen Neisseria meningitidis B/E. coli K1

Прямое определение антигенов в жидкостях тела (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды)

Набор Wellcogen для определения стрептококков группы B/Wellcogen Strep B Rapid Latex Agglutination Test

Прямое определение антигенов в жидкостях тела (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды)

Набор Wellcogen для определения Streptococcus pneumoniaе/Wellcogen Streptococcus pneumoniae Test Kit

Прямое определение антигенов в жидкостях тела (цереброспинальной жидкости, сыворотке, моче, крови, культуре с питательной среды)

Streptococcus

Набор для диагностики стрептококков групп A, B, C, D, F и G /PathoDxtra Strep Grouping Kit

Быстрый тест для дифференциации групп стрептококков A, B, C, D, F и G по Лансфильду с первичных чашек с культурой.

• Мгновенная экстракция без инкубации для восстановления
• Работа напрямую с колониями, без разведения в пробирках
• Сокращение времени проявления результатов
• Не требует дополнительных реагентов
• Идентификация всех клинически значимых стрептококков, включая группу D
• Возможность дополнить набор наиболее расходуемыми реагентами

Набор для диагностики стрептококков групп A/PathoDxtra Strep Group A Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор для диагностики стрептококков групп B/PathoDxtra Strep Group B Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор для диагностики стрептококков групп C/PathoDxtra Strep Group C Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор для диагностики стрептококков групп D/PathoDxtra Strep Group D Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор для диагностики стрептококков групп F/PathoDxtra Strep Group F Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор для диагностики стрептококков групп G/PathoDxtra Strep Group G Latex

Предназначен только для использования с набором DR0700M

Набор Streptex для диагностики групп стрептококков A, B, C, D, F и G (ферментная экстракция)/Streptex

Набор для идентификации стрептококков групп A, B, C, D, F, G по Лансфильду с использованием ферментной экстракции

Набор для диагностики стрептококков групп A, B, C, F и G (кислотная экстракция)/Streptex Rapid

Набор для идентификации стрептококков групп A, B, C, F, G по Лансфильду с использованием кислотной экстракции

Набор для быстрой диагностики стрептококков групп A, B, C, F и G (кислотная экстракция)/Streptex Acid Extraction Kit

Набор для быстрой кислотной экстракции для использования с Streptex Rapid Latex Agglutination Test для идентификации стрептококков групп A, B, C, F, G по Лансфильду

Набор DrySpot для диагностики Streptococcus pneumonia/Pneumo

Сухой латексный тест для подтверждения Streptococcus pneumoniae в культурах на чашках или положительных культурах крови.

Staphylococcus и MRSA (метициллин-резистентный стафилококк)

Набор DrySpot для идентификации Staphylococcus aureus (MRSA)/Dryspot Staphytect Plus

Сухой латексный тест для идентификации S. aureus после первичного посева

Плазма кроличья для выявления коагулазы (лиофилизированная)/Coagulase Plasma (lyphohilized)

Реагент для выявления фермента коагулазы у стафилококков

Related JoVE Videos

The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.

If that doesn't help, please let us know.

Латекс тестирование агглютинации является простым, быстрым и недорогим методом для серотипирование Пневмококк, и также широко применяется в диагностической микробиологии. Эта рукопись описывает в собственное производство латексной агглютинации реагентов, процедур контроля качества и применение этого метода к пневмококковой серотипирования.

Porter, B. D., Ortika, B. D., Satzke, C. Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination. J. Vis. Exp. (91), e51747, doi:10.3791/51747 (2014).

Translate text to:

Please note that all translations are automatically generated.

Пневмококк (пневмококк) является одной из основных причин заболеваемости и смертности среди детей в возрасте до пяти лет во всем мире, особенно в условиях ограниченных ресурсов 1,2. Пневмококковые диапазоны болезни от локализованных инфекций, угрожающих жизни заболеваний, таких как пневмония, сепсис и менингит 1,2.

Эта рукопись излагаются основные этапы производства латексных реагентов с использованием пассивного вложения имеющихся в продаже антисыворотки латексных частиц. Контроль качества (QC) аспекты этого метода описаны, и протокол для использования латексных реагентов для пневмококковой серотипирования включен.

1 Подготовка внутренних латексных реагентов

1. Приготовление солевого буферного раствора глицина (GBS)
   1. Добавить 1,5 г глицина, 11,7 г хлористого натрия и 100 мл дистиллированной воды в стеклянном стакане 200 мл.
   2. Смешать, чтобы растворить с помощью магнитной мешалки.
   3. Передача смеси до 500 мл мерный цилиндр и добавить дистиллированную воду, чтобы сделать в общей сложности 200 мл.
   4. Перенесите раствор обратно в 200 мл стакан, проверить рН и приспособиться к 8,2 гидроксидом 5 М натрий. ПРИМЕЧАНИЕ: гидроксид натрия вызывает коррозию, средства индивидуальной защиты.
   5. Фильтр стерилизовать решение с использованием 0,22 мкм фильтры и несколько 60 мл шприцев в мл preautoclaved винт ограничен стеклянной бутылке 250.
   6. Храните при комнатной температуре.
2. Подготовка GBS с 0,2% бычьего сывороточного альбумина
   1. Добавить 0,2 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) порошка и 100 мл GBS в стеклянном стакане 200 мл и перемешивают до растворения с использованием магнитной мешалки.
   2. Фильтрстерилизовать раствор через 0,22 мкм фильтры, используя несколько 60 мл шприцев в мл preautoclaved винтовой крышкой стеклянной бутылке 250.
   3. Хранить при 4 ° С.
3. Подготовка Латекс реагент
   1. Этикетка 2 мл с круглым дном пробирке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: круглым дном трубы используются для минимизации оседание частиц, которые могут повлиять на антитела привязанность.
   2. Использование P1000 пипетки с стерильные наконечники добавить 975 мкл GBS в пробирке, затем добавить 25 мкл соответствующей пневмококковой антисыворотки для латекс реагент готовится (т.е., бассейн, группа, тип или фактор). Обратить пять раз перемешать.
   3. Развести полистирольных латексных частиц 1:10 добавлением 120 мкл латексных частиц в 1080 мкл стерильного физиологического солевого раствора.
      Примечание: Это может быть сделано в больших объемах, но должны быть свежим каждый раз, когда латекс реагенты производятся.
   4. Добавить 1000 мкл 1:10 латексной суспензии (полученного на стадии 1.3.3) к 1,000 мкл антисыворотки 1:40 подвеска (полученного на стадии 1.3.2). Обратить пять раз перемешать.
   5. Инкубируют при 37 ° С на медленно вращающемся колесе (например, 4 оборота в минуту в течение колесо диаметром 38,5 см) в течение 2 часов.
   6. Центрифуга течение 15 мин при 1100 х г. Жидкость над осадком сливают и осторожно ресуспендируют осадок в 2 мл стерильного физиологического раствора.
   7. Центрифуга течение 15 мин при 1100 х г. Удалите супернатант и добавить 1 мл GBS и осторожно ресуспендируют осадок.
   8. Внесите латекса суспензии в меченым 5 мл винт закрытой пробирке. Добавить еще 1 мл GBS.
   9. Добавить 2 мл GBS содержащем 0,2% БСА (вес / объем) (рН 8,2) (полученного на стадии 1.2). Добавить 40 мкл 10% (масса / объем) раствора азида натрия в качестве консерванта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: натрия азид опасен при вдыхании, и кожа, и раздражение глаз. Желательно приобрести готовую 10% раствор, а не порошкообразной форме, так как это сводит к минимуму риск вдыхания. Средства индивидуальной защиты (в том числе перчаткид Очкидлязащитыотбрызг) следует носить при работе с этим реагентом. Обратитесь к Паспорт безопасности для подробной информации.
   10. Магазин латексные реагенты при температуре 4 ° С.
4. Подготовка отрицательного контроля латекса реагента
   1. Этикетка 2 мл с круглым дном пробирке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: круглым дном трубы используются для минимизации оседание частиц, которые могут повлиять на антитела привязанность.
   2. Использование P1000 пипетки с стерильные наконечники добавить 975 мкл GBS в пробирке, затем добавить 25 мкл нормальной кроличьей антисыворотки. Обратить пять раз перемешать.
   3. Действуйте с шагом 1.3.3 для 1.3.10 выше

2 Контроль качества (QC) из латексных реагентов

1. Доведите латекс реагент до комнатной температуры. Непосредственно перед использованием, осторожно перемешать латексный реагент путем обращения трубки несколько раз.
2. Проверьте реагент для autoagglutination с помощью пипетки 15 мкл на предметное стекло микроскопа и действуйте с шагом 4,7 и 4,8 ниже. Там не должно бытьgglutination из латексных частиц. Реагент должен появиться белая и гладкая.
3. Проверьте реагент против панели низкого прохода пневмококковых изолятов. Используйте недавно выращенные культуры, полученные, как в шаге 3 Панель изолятов должна включать изолятов в "целевой" серотипа (удельная серотип для реагента проходит испытания) и "нецелевые" серотипов (изоляты других серотипов, которые не должны обычно пересекают вступать в реакцию с реагентом). Включите по крайней мере один изолят каждой целевой и нецелевой серотипа для каждого латекса реагента, подвергающегося QC. Если есть только один целевые или нецелевые серотипа, тест две разные изоляты конкретного серотипа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование панель должна включать в себя несколько изолятов каждого серотипа, некоторые из которых являются редкостью в инвазивных заболеваний и / или коллекций культур типа. Желательно, чтобы включать в себя некоторые каретки изолирует, так как они часто более требовательный к серотипа (данные не показаны), тем самым дополнительно проверки Выхе реагентов и обеспечение того, чтобы реагенты, скорее всего, способны серотипирование как инвазивные и перевозку изолирует.
4. Продолжайте тестирования латексных реагентов с являющихся и не являющихся целевой пневмококковой изолирует согласно методу, описанному в пунктах 3 и 4 ниже.
5. Контроль качества реагентов в момент производства, а затем, по меньшей мере ежегодно.
   Примечание: Если реагент не пройти контроль качества, партия должна быть отброшена и новый препарат производства. В случае отказа повторите QC мы рекомендуем реагенты быть представлено с использованием альтернативных методов, описанных в Ortika и др., 2013 8 и в обсуждении ниже.

3 Получение пневмококковой культур для серотипирования

1. Использование стерильной петли выбрать один колонию пневмококковой изолировать и серия на это на твердую неселективном кровяной агар так, что основная посевной охватывает примерно треть поверхности пластины. Подряд для отдельных колоний.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты, изготовленные из дефибринированной лошади или овечьей крови подходят; но пластины крови, полученные с человеческой крови или цитратной крови животных нет.
2. Планшеты инкубируют O / N при 37 ° С в атмосфере 5% CO _2.
3. Соблюдайте рост на тарелке для чистоты и оценить, что есть достаточный рост для серотипирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: чистая культура пневмококковой изолята требуется для серотипирования. В нашем опыт, сливающиеся, или вблизи сплошной рост, охватывающий примерно одну треть поверхности пластины, как правило, достаточно для завершения серотипирование. Как пневмококковых культуры могут быть склонны к автолиза, культуры, подготовленные для серотипирования должны быть проверены в течение 24 часов субкультуры. Не берите культуры пластину из инкубатора более 15 до 20 мин, после чего серотипирование начинается.

4.Проведение Латекс Агглютинация Серотипирование

Положительная реакция латекс имеет место, когда тип-специфическое антитело прикрепляется к латексной частицы связывается с капсулой пневмококка и агглютинации частиц в антитело, меченное наступает 15. 1А показывает положительную реакцию, которая характеризуется видимой агглютинации и очистки фоне подвеска. Отрицательная реакция характеризуется латекс агглютинации реагента оставшейся гладкой и белой (фиг.1В) суспензии. Реагенты оптимизированы таким образом, что положительная реакция следует соблюдать до конца временного интервала одним мин (обычно обнаруживаемого в приблизительно 20 сек). Мы не рекомендуем читать реакции после временного интервала 1 мин. Очень редко, реакции отображения слабую агглютинацию вокруг края капли, которая не сопровождается, очистив фонового приостановления или появляются "тягучий" без фоновой очистки (данные не представлены). Это самые как LY негативные реакции. В таких случаях мы рекомендуем повторное тестирование и / или дальнейшего расследования, используя другой метод серотипирования (например реакции Quellung 17).

Рисунок 1. Положительные и отрицательные реакции латекс агглютинации. Препараты пневмококковой изолировать смешивают с латексом агглютинации реагента, показывая положительную реакцию (А) или отрицательную реакцию (B). Агглютинация сопровождается очистки фоне видится в позитивной реакции (А) .There не видно агглютинации с отрицательным контроль латексной реагента или в негативной реакции теста (B). Фотографии 8 используется с ее разрешения."Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Латекс агглютинации является простой, быстрый и недорогой метод для пневмококковой серотипирования. Коммерческие пневмококковых латекс агглютинации реагенты доступны, но они в настоящее время не проводится различия все известные пневмококковой серотипы 10,12. Однако, латекс агглютинации реагенты могут быть легко получены в доме с помощью приобрели антитела на конкретных пневмококковых капсульных антигенов. В способе, описанном здесь, антитела пассивно прикреплен к латексных частиц, чтобы сделать набор реагентов латексной агглютинации.

Положительная реакция латекс происходит, когда специфические антитела, связанные с частицами латекса придают антигенов на полисахарид капсулы из пневмококковых изолировать 18,19. Частицы латекса, прикрепленные к антителам позволяют специфическая реакция антиген-антитело, чтобы быть визуализированы без увеличения.

Латекс агглютинации является подходящим методом для высокой пропускной лабораторий апD также для ограниченными ресурсами. Основные преимущества метода латекс агглютинации в том, что никакое специализированное оборудование не требуется для выполнения теста, реагенты имеют срок годности не менее 2 лет при хранении при 4 ° С 8, и что это недорого, просто и быстро выполнить. Серологическое типирование пневмококковой изолят на латексной агглютинации занимает около 10 мин, и до четырех латексные реагенты могут быть проверены параллельно на одном слайде. Кроме того, если распространенность серотипов известен соответствующий эпидемиологического, тестирование может быть выполнено в раундах, начиная с бассейнов, содержащих наиболее распространенных серотипов аналогично испытанию Quellung 17. Такой подход снижает количество тестов, необходимых для определения серотипа. Способ также высокой воспроизводимостью между различными операторами (данные не показаны). Недостатком латекс агглютинации серотипирования в том, что производство реагентов требует больших затрат времени, с приблизительно 4 ч; хотя многократного reageНТС могут быть легко получены параллельно. Кроме того, некоторые антигены, являются общими для различных серотипов пневмококков, в результате чего перекрестных реакций с некоторой антисыворотки (например, серотипа 29, 42 и группа 35). Тем не менее, эти перекрестные реакции хорошо охарактеризованы при использовании коммерческого антисыворотки (который, как правило, предварительно адсорбированный для удаления более проблематичным перекрестно реагирующих антител) и дополнительные таблицы реакции, при условии, производителем для того, чтобы различать, который присутствует серотипа. Латекс реагенты могут также пересекать реагировать, если антитела не выровнены латексных частиц; они определяются как КК неудач. По нашему опыту, строгий контроль качества является залогом успеха этого метода, даже если имеющиеся в продаже антисыворотки используются для производства. КК занимает примерно 15 мин для каждого реагента и зависит от набора соответствующего QC изолятов, как описано выше.

Метод, описанный здесь приводит реагентов, которые дают положительную реакцию также Wiтонкий тестовый период. По нашему опыту, ложных срабатываний редки в практике (данные не представлены). Наблюдаются Иногда ложные негативные реакции; обычно они касаются известных проблем с конкретной антисыворотки (например, серогруппы 6 изоляты не может реагировать с бассейном B антисыворотки), или вниз регуляции экспрессии капсулы по изолята. Использование серотипирования algrorithm, предоставляемая производителем Также важно, как и в большинстве случаев ложный положительный или отрицательный реакция приведет к "слепой конец 'результате. В этих случаях, и когда реакции трудно интерпретировать, мы рекомендуем повторить тестирование и / или тестирование с помощью альтернативного способа, таких как реакции Quellung.

Некоторые устранение неисправностей иногда требуется сделать удовлетворительные латексные реагенты. В способе, описанном здесь, антитело прикрепляется к латексных частиц с помощью пассивной адсорбции 15,19, таким образом, является критической переменной концентрации антител использовали, который определяет, насколько хорошоповерхность латексных частиц покрыта и последующее выравнивание антител активных участков 15,20. Следовательно, если слишком мало или слишком антитело присоединены к латексных частиц, что реакции антиген-антитело не будет оптимальным, и неудовлетворительные реагенты могут быть получены 15,20,21. Как титры антител варьироваться между различными партиями антисыворотки, стандартный набор разведения не могут производить реагенты, которые хорошо 8. В качестве отправной точки использовать разбавление антисыворотки 1:40, и если это не удается, разбавить антисыворотки дальше. По нашему опыту это обычно решает проблему 8. В небольшом количестве случаев реагенты могут показать слабую агглютинацию, что не сопровождается очистки суспензии, при проверке с целевой изолирует. В этих случаях разбавление антисыворотки не улучшает качество реагента, но, как правило, удовлетворительные реагенты могут быть получены путем исключения центрифугирования и промывки шаги 8,22 .

, Покрытых антителом, частицы латекса обычно используются в диагностической микробиологии для обнаружения, идентификации или серотипирования различных микробов 15,20. Таким образом, способ, описанный здесь, может быть пригоден для получения латекса реагенты для других целей, при условии, пригодны антисыворотки доступен, и соответствующие процедуры КК принимаются.

Пневмококковая инфекция обусловлена патогенным микроорганизмом Streptococcus pneumoniae. Этот возбудитель является главной причиной острых внебольничных пневмоний, занимает ведущее место в этиологии бактериальных менингитов, острых средних отитов, синуситов, вызывает первичный сепсис, заболевания кожи, суставов и другие инфекции, пневмококки являются этиологической причиной пневмонии в 20–75% случаев. Риносинусит имеет пневмококковую этиологию в 20–43% случаев, средний отит – 30–50%.

Ежегодно в США диагностируется около 4 млн. случаев внебольничной пневмонии и более 3 млн. в странах Европейского союза. В России число таких больных превышает 1,5 млн. человек в год, а заболеваемость составляет 14–15 случаев на 1000 населения. По данным Министерства обороны РФ у военных срочной службы в течение 2000–2003 гг. заболеваемость пневмонией превышала показатель 40 случаев на 1000 военнослужащих.

Заболеваемость пневмококковым менингитом в США определяется на уровне 1–2 случая на 100 тыс. населения с уровнем летальности 19–46% в различных возрастных группах. В России, по данным Референс-центра по надзору за гнойными бактериальными менингитами за 2010 г., общий уровень заболеваемости составил 0,19 на 100 тыс. населения (с колебаниями по Федеральным округам от 0,11 до 0,30 на 100 тыс. населения), с летальностью 13%.

В тоже время, пневмококк относится к нормальным обитателям ротоглотки и частота здорового носительства в популяции может достигать 40–70%. При этом возможно как одновременное носительство различных серотипов пневмококка, так и смена одного серотипа другим в течение непродолжительного времени. Заболевание пневмонией, отитом, синуситом, как правило, возникает при попадании микроба в нижние или верхние дыхательные пути на фоне нарушения защитных механизмов организма человека (снижение уровня общего и местного иммунитета, нарушение мукоцилиарного клиренса и др.). При генерализации процесса развивается сепсис, менингит, абсцессы внутренних органов, поражения сердца (эндокардит), почек, суставов.

Резервуаром пневмококковой инфекции является человек. Вместе с тем, пневмококковая патология встречается у диких и домашних копытных животных (овец, коз, телят и т. д.), преимущественно в виде пневмонии или сепсиса. Выделенный возбудитель от животных не отличается по свойствам от пневмококка, вызывающего заболевание у людей.

Основной путь передачи инфекции – воздушно-капельный, иногда контактный. Отмечены случаи внутриутробного заражения. Пик заболеваемости приходится на холодные сезоны года и носит спорадический характер. Среди заболевших преобладают мужчины. Наиболее уязвимыми возрастными контингентами являются дети до 5 лет и лица пожилого возраста (старше 65 лет). Пневмококковая инфекция наиболее тяжело, с генерализацией инфекционного процесса, протекает у лиц старших возрастов, особенно при наличии сопутствующих хронических патологий (хроническая обструктивная болезнь легких, злокачественные новообразования, алкоголизм, сахарный диабет, заболевания сердечно-сосудистой системы, почек и печени и др.), а также иммунодефицитов различного генеза.

Показания к обследованию. Пациенты при подозрении на крупозную пневмонию, острый бронхит; отит, синусит; менингит, менингоэнцефалит; септическое состояние; поражения кожи, подкожной клетчатки, соединительной ткани (редкая локализация инфекции); конъюнктивит (редкая локализация инфекции).

Дифференциальная диагностика проводится с микробными агентами:

при подозрении на внебольничную пневмонию: Haemophilus influenzae, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, семейством Enterobacteriaceae, вирусами гриппа;
• при отитах, синуситах – Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pyogenes, дрожжевыми грибами рода Candida;
• при менингите – Neisseria meningitides, Haemophilus influenzae тип b, Staphylococcus aureus, семействомEnterobacteriaceae;
• при поражениях кожи, подкожной клетчатки, соединительной ткани – Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.

Материал для исследования

• Мокрота, БАЛ, пунктаты (при подозрении на пневмонию); гнойное отделяемое, пунктаты (средний отит, синусит); СМЖ, кровь (менингит, менингоэнцефалит); кровь (септические состояния); отделяемое из раны (кожные поражения); секционный материал – культуральные исследования, выявление ДНК микроорганизма;
• СМЖ – определение АГ;
• сыворотка крови – определение АГ, АТ.

Этиологическая лабораторная диагностика включает выявление пневмококков методом микроскопии, посев исследуемого материала с дальнейшей культуральной и биохимической идентификацией возбудителя, определением антибиотикочувствительности; обнаружение специфических генетических фрагментов пневмококка и его АГ, обнаружение специфических АТ.

• взятие материала должно проводиться до начала антибиотикотерапии;
• контроль правильности отбора, доставки и обработки материала:
• • задержка приготовления препарата на 2–5 ч от момента взятия материала может привести к ошибочным результатам;
  • подтверждением взятия образца мокроты из нижних отделов дыхательных путей служит выявление менее 10 эпителиальных клеток в поле зрения при малом увеличении микроскопа;
  • материал считается пригодным для бактериологического посева при обнаружении в мокроте большого количества нейтрофилов (более 25 в поле зрения), небольшого количества эпителиальных клеток (менее 10 в поле зрения) и преобладании монофлоры, по морфологии сходной с пневмококком.

Для посева с дальнейшей культуральной и биохимической идентификацией возбудителя, определением антибиотикочувствительности используют различные виды материала: мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, отделяемое из уха и придаточных пазух, кровь, ликвор, плевральная жидкость.

При наличии роста на чашках проводится обязательная количественная оценка бактериального роста и выделение чистой культуры предполагаемого возбудителя для дальнейшей идентификации.

Принадлежность к виду Streptococcus pneumoniae подтверждается:

• характерным видом колоний на средах, содержащих кровь (колонии по форме напоминают игральные шашки или блюдца, мелкие, прозрачные, окружены зоной зеленоватого гемолиза);
• чувствительностью микроорганизма к оптохину;
• чувствительностью к желчным кислотам;
• положительной реакцией набухания капсулы с антипневмококковой omniсывороткой;
• биохимической характеристикой возбудителя с использованием соответствующих наборов реагентов.

Оценка результатов культурального исследования. Для нестерильных локусов:

• выявление при посеве в мокроте или лаважной жидкости более чем 10 3 КОЕ/мл пневмококков является диагностическим критерием постановки диагноза пневмония;
• выявление в гнойном экссудате при остром бактериальном синусите более 10 5 КОЕ/мл пневмококков является диагностическим критерием постановки диагноза синусит;
• выявление в гнойном отделяемом при остром среднем отите более 10 4 КОЕ/мл пневмококков, является диагностическим критерием постановки диагноза отит.

Для стерильных локусов:

• любое выявление возбудителя в стерильных жидкостях организма служит основанием для постановки диагноза пневмококковой инфекции.

Для определения чувствительности к антибиотикам используются несколько методов.

• Метод серийных разведений в бульоне или агаре. Принцип метода основан на оценке чувствительности возбудителя к серии последовательных разведений тестируемого антибиотика. При этом определяется точное значение минимальной подавляющей концентрации (МПК) препарата для микроорганизма. Однако изза значительной трудоемкости, метод используется преимущественно в научных лабораториях. Более широкое применение получил модифицированный метод серийных разведений, основанный на использовании пограничных концентраций антибиотика, который не дает точного определения МПК препарата для возбудителя, но позволяет оценить его принадлежность к чувствительным (S), промежуточно устойчивым (I) или резистентным (R) штаммам. Большинство готовых наборов реагентов используют именно этот принцип.
• Диско-диффузионный метод – основан на оценке диаметра зоны подавления роста вокруг бумажного диска с антибиотиком, наложенного на растущую на плотной питательной среде культуру исследуемого микроорганизма. Образование зоны ингибирования роста происходит за счет диффузии антибактериального препарата из носителя (диска) в питательную среду, при которой величина диаметра ингибирования роста жестко связана с величиной МПК. Метод не определяет точное значение минимальной подавляющей концентрации антибиотика для микроорганизма, а только позволяет отнести его к одной из категорий чувствительности (S, I, R).
• Метод эпсилометрии (Е-тест) – в качестве носителя используется полоска полимера, пропитанная различными концентрациями антибиотика, с нанесенными на нее значениями таких концентраций. Интерпретации результатов выполняют в соответствии с инструкцией к набору реагентов.

Наиболее важным при тяжелых пневмококковых инфекциях является определение чувствительности пневмококков к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам (аминопенициллинам, карбапинемам, цефалоспоринам) – основным препаратам выбора. В качестве скринингового теста для определения чувствительности к этим препаратам используется диско-диффузионный метод.

В исследование обязательно включают изучение чувствительности к макролидам, линкозамидам, стрептограминам. Данные препараты часто используются для лечения внегоспитальной пневмококковой пневмонии и заболеваний верхних дыхательных путей. Пневмококки могут быть устойчивыми только к 14- и 15-членным макролидам, при сохранении чувствительности к 16-членным макролидам и линкозамидам, а могут быть устойчивыми ко всем представителям этих классов.

Определение устойчивости к хинолонам, хлорамфениколу, тетрациклину, котримоксазолу, рифампицину, ванкомицину, позволяет более полно характеризовать фенотип возбудителя. При этом необходимо учитывать, что ранние хинолоны (офлоксацин), которые применяются в отношении пневмококков, резистентных к пенициллину, в последнее время показывают рост устойчивости к этому препарату. Для преодоления устойчивости используют новые фторхинолоны с повышенной антипневмококковой активностью: спарфлоксацин, моксифлоксацин и др.

Примерно от 5 до 15% культур пневмококков в России демонстрируют полирезистентные свойств, т. е. одновременной устойчивостью к 3 и более классам препаратов.

Для обнаружение АГ пневмококка в пробах биологических жидкостей пациента применяют методы латекс-агглютинации и ИХА. Наборы реагентов, основанные на реакции латекс-агглютинации или коагглютинации, предназначены для работы с материалом, полученным из стерильных локусов (кровь, ликвор), при работе с нестерильными локусами эти наборы могут давать ложноположительный результат. Чувствительность и специфичность наборов разных производителей составляет 94–100% и 85–98%, соответственно. Набор реагентов с использованием ИХА позволяет определить наличие указанного АГ у больных пневмонией (в моче) и менингитом (в СМЖ). Этот тест рекомендован как дополнительный метод диагностики пневмоний. При исследовании проб пациентов с высоким уровнем назофарингеального носительства возможны ложноположительные результаты.

Для обнаружения специфических генетических фрагментов пневмококка применяют ПЦР, в качестве мишеней используют специфические фрагменты генов, кодирующих факторы патогенности: пневмолизин (Ply), аутолизин (LytA), пневмококковый поверхностный АГ (PsaA), пневмококковый поверхностный протеин А (PspA), марганец-зависимая супероксид-дисмутаза (sodA), поверхностный пенициллин-связывающий белок 2b (Pbp2b), Spn9802, Spn9828. Для повышения специфичности исследования применяется мультиплексная ПЦР, при которой проводится одновременная индикация нескольких генов патогенности с сохранением высокой чувствительности реакции.

Остается проблемой установление диагностически значимых количественных показателей, позволяющих дифференцировать заболевание от носительства при исследовании материала из нестерильных локусов.

Использование метода секвенирования участка 16S рибосомальной РНК для идентификации пневмококков затруднено сходством с некоторыми видами стрептококков, входящих в группу Mitis. Гомология ДНК-ДНК между стрептококками, входящими в группу Mitis, составляет 40–60%, тогда как сходство сиквенсов 16S рРНК генов между S.mitis, S.oralis и S.pneumoniae может достигать более чем 99%. Сравнение участков 16S рРНК между штаммами S.pseudopneumoniae и S.pneumoniae (суммарный размер 1 468 пар нуклеотидов) показало 99,7% совпадение сиквенса, различие отмечено только в 5 парах нуклеотидов.

Обнаружение АТ редко используются при проведении лабораторной диагностики пневмококковой инфекции. Это связано с отсутствием надежных доступных методик, имеющих достаточную чувствительность и специфичность и ролью временного фактора, поскольку для выявления роста титров АТ необходимо значительное время от начала заболевания. В настоящий момент используются определения АТ против четырех АГ пневмококка (С-антигена, капсульных полисахаридов, фосфорилхолина и пневмолизина). Чувствительность метода для С-антигена и капсульных полисахаридов составляет 89% и 97% соответственно. Наиболее распространенные методы определения – ИФА и РИФ (МФА). При применении МФА в качестве АГ рекомендуется использовать аутоштамм пневмококка, выделенный от данного больного. В случае отсутствия аутоштамма применяют смесь штаммов из наиболее часто встречающихся на данной территории серотипов. Выявление минимального диагностического титра АТ к пневмококку у детей до 3 лет 1:320 и 1:640 у взрослых свидетельствует о пневмококковой этиологии перенесенного заболевания.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.