Как определить чувствительность к антибиотикам при хеликобактер

В статье представлены результаты бактериологического тестирования 48 штаммов Helicobacter pylori (H. pylori), выделенных от пациентов в Санкт-Петербурге. Антибиотикорезистентность штаммов H. pylori оценивали методом серийных разведений. Среди анализируемы

The article describes the results of bacteriologic testing of 48 Helicobacter pylori (H. pylori) strains taken from the patients in Saint-Petersburg. Antibiotic resistance of H. pylori strains was evaluated by serial breeding method. Among the analysed isolates, 42,5% were resistant to metronidazole, 27,1% — to levofloxacin, 25% — to clarithromycin, 6,3% — to amoxicillin. All the tested strains were sensitive to tetracycline.

Эрадикация H. pylori у инфицированных пациентов, страдающих хроническим гастритом, язвенной болезнью, функциональной диспепсией и другими H. pylori-ассоциированными заболеваниями, является основной стратегией предотвращения развития некардиального рака желудка [1]. В любой клинической ситуации, при которой врач сомневается в необходимости диагностировать инфекцию H. pylori и провести уничтожение микроорганизма, дополнительным и крайне актуальным аргументом в пользу этих мероприятий должен стать профилактический эффект эрадикации относительно возникновения рака желудка, особенно у пациентов с отягощенным наследственным анамнезом [2].

Целью данной работы было получение данных о состоянии первичной антибиотикорезистентности штаммов H. pylori, выделенных от пациентов в Санкт-Петербурге.

Исследование по протоколу SHELF проводилось в Санкт-Петербурге с мая 2013 по июнь 2014 года. Одобрение было получено в центральном и локальном научном этическом комитете в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. В исследовании использовались гастробиоптаты пациентов, соответствующих следующим критериям.

Критерии исключения:

1) пациенты, ранее получавшие антимикробную терапию для эрадикации H. pylori;
2) пациенты, получавшие антибиотики из группы макролидов в течение одного года, предшествовавшего данному исследованию;
3) пациенты, участвующие в любых других клинических исследованиях;
4) пациенты, получавшие ингибиторы протонного насоса и препараты висмута в течение двух недель, предшествовавших данному исследованию;
5) больные, принимающие антибактериальную терапию на момент забора материала.

Критерии включения:

1) мужчины и женщины в возрасте от 18 до 65 лет;
2) пациенты с инфекцией H. pylori, подтвержденной быстрым уреазным тестом гастробиоптата, полученного при проведении эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС);
3) решение врача в рамках рутинной клинической практики и диагноза пациента провести ЭГДС с забором биоптата.

В качестве основы питательной среды для выделения и культивирования H. pylori использовался колумбийский агар. Каждый образец биопсии высевался параллельно на две чашки Петри с агаром, содержащим антибиотики в следующих концентрациях: ванкомицин в концентрации 6 мкг/мл, триметоприм, в концентрации 2 мкг/мл (растворяли в спирте) и амфотерицин В (или налидиксовую кислоту) в концентрации 2–10 мкг/мл.

Инкубация посевов осуществлялась в микроаэрофильных условиях при содержании кислорода около 5%. Для этих целей использовались анаэростаты системы GasPac100 c газогенерирующими пакетами типа GasPak (BBL CampyPak Plus Microaerophilic System envelopes with Palladium Catalyst).

На кровяной питательной среде на 5–7 сутки H. pylori формировал мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, влажные колонии диаметром около 1 мм. Колонии H. pylori, полученные в результате первичного посева биопсийного материала, использовали для приготовления мазков, окраски их по Граму и постановки уреазного теста.

Решение вопроса о принадлежности выделенной культуры к роду Helicobacter выносили на основании характерной морфологии выделенных колоний, а также набора тестов: морфологии культуры в мазке, окрашенном по Граму, и наличии характерных биохимических свойств (способности к продукции уреазы). Типичные клетки H. pylori при микроскопии имели вид тонких изогнутых нежно-розовых палочек.

Антибиотикорезистентность выделенных штаммов H. pylori изучали, используя метод серийных разведений, который основан на регистрации ингибиции роста микроорганизма на питательном агаре, содержащем определенные концентрации антибиотика. Определяли чувствительность штаммов H. pylori к кларитромицину, амоксициллину, левофлоксацину, метронидазолу и тетрациклину. Рабочие концентрации исследуемых антибактериальных препаратах в агаре были следующими:

• амоксициллин — 0,25; 0,12; 0,06 мкг/мл;
• кларитромицин — 1,0; 0,5; 0,25; 0,12 мкг/мл;
• левофлоксацин — 2,0; 1,0; 0,5 мкг/мл;
• метронидазол — 16; 8; 4 мкг/мл;
• тетрациклин — 2,0; 1,0; 0,5 мкг/мл.

Среды и растворы антибактериальных препаратов готовили непосредственно перед использованием.

На чашки Петри с ростом H. pylori добавляли по 1–2 мл стерильного физиологического раствора и снимали бактериальную массу. Инокулюм наносили бактериологической петлей на поверхность чашки Петри с селективной кровяной средой с определенной концентрацией антибиотика, равномерно распределяя по поверхности. Затем чашки Петри помещали в анаэростат и инкубировали при температуре 37 °С в течение 3–5 суток. После окончания инкубации отмечали чашку с концентрацией антибактериального препарата, вызывающей полное подавление роста микробов. Контроль чистоты роста культуры оценивали по посеву на чашку Петри с селективной кровяной средой без добавления антибиотиков.

Данный метод позволил подразделить штаммы H. pylori на чувствительные и устойчивые [9]. Критерии распределения штаммов по степени чувствительности приведены в табл. 1.

На каждого пациента, гастробиоптат которого использовался в исследовании, заполнялась индивидуальная регистрационная карта (ИРК), которая дублировалась в базе данных Microsoft Access Database и содержала демографические, анамнестические данные, результаты проведенных исследований.

Статистический анализ выполнялся с помощью программного пакета IBM® SPSS® Statistics, версия 21.0.

Демографические и анамнестические показатели анализировались с помощью методов описательной статистики. Для дихотомических показателей резистентности были представлены 95% доверительные интервалы для долей резистентности к тому или иному антибиотику. Подобный статистический анализ проводился в отношении выявления наличия H. pylori и выявления резистентности к антибиотикам.

В исследовании использовались гастробиоптаты 109 пациентов в возрасте от 18 до 64 лет. Возраст, пол и диагноз пациентов представлены в табл. 2.

У пациентов были диагностированы различные заболевания, ассоциированные с H. pylori. Наиболее частой нозологией являлся хронический гастрит — 78,9% (n = 86). Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки (ДПК) диагностирована у 20,2% (n = 22), а язвенная болезнь желудка — у 0,9% (n = 1).

Инфицирование H. pylori было подтверждено у всех пациентов уреазным тестом. Бактериологическим методом микроорганизм выделен лишь у 56 пациентов, что составило 51,4% (95% ДИ: 42,0%, 60,8%). Такой процент отражает технические трудности, связанные с транспортировкой и культивированием микроаэрофильного микроорганизма.

Чувствительность H. pylori к антимикробным препаратам удалось определить у 48 выделенных штаммов. Из-за скудного роста культуры в 8 случаях оценить антибиотикограмму было невозможно.

Таким образом, в анализ резистентности были включены 48 штаммов хеликобактера, выделенных от 48 пациентов. Среди анализируемых изолятов H. pylori штаммов, 17 (42,5%) были резистентны к метронидазолу, 13 (27,1%) — к левофлоксацину, 12 (25%) — к кларитромицину. Кроме того, было выявлено 3 (6,3%) штамма, устойчивых к амоксициллину. Все тестируемые штаммы были чувствительны к тетрациклину. В случаях выявления резистентности к трем и более группам антимикробных препаратов, штамм хеликобактера относили к полирезистентным. В ходе исследования 5 (11,1%) микроорганизмов были полирезистентными (табл. 3).

Двойная резистентность к кларитромицину и метронидазолу обнаружена у 2 (4,4%) изолятов, метронидазолу и левофлоксацину — у 4 (8,3%) микроорганизмов. Все штаммы, резистентные к амоксициллину, были устойчивы к кларитромицину.

Частота встречаемости резистентных штаммов отличалась среди мужчин и женщин, однако данный факт сложно интерпретировать из-за малой выборки (табл. 4).

При анализе частоты резистентности к кларитромицину выявлены различия по нозологиям. Так, у 14 пациентов, страдающих язвенной болезнью, было 5 (35,7%) случаев выделения штаммов H. pylori, резистентных к кларитромицину. В то же время у 34 больных, у которых был диагностирован только хронический гастрит, частота выделения резистентных штаммов к кларитромицину была ниже — 7 (20,6%). Однако этот факт сложно интерпретировать из-за ограниченного числа наблюдений.

Согласно Маастрихтским рекомендациям IV пересмотра, уровень резистентности H. pylori к кларитромицину в популяции является определяющим фактором при выборе схемы эрадикации [10]. Подобно другим патогенам, хеликобактер имеет региональные особенности резистентности. Резистентность напрямую коррелирует с частотой назначения антимикробных препаратов и утвержденными протоколами выбора антибиотиков [11]. Невозможно экстраполировать данные о резистентности, выявленные в одной стране, на другую, в силу значительных региональных различий чувствительности микроорганизмов. Так, резистентность к кларитромицину в Нидерландах составляет всего 5,6%, тогда как резистентность H. pylori к данному антибиотику в Австрии достигает 35,4% [11]. Уровень устойчивости к метронидазолу в Пекине составил 63,9%, а на Юго-Восточном побережье Китая — 95,4% [16, 17]. Для анализа антибиотикорезистентности H. pylori в мире нами были отобраны наиболее масштабные исследования, проводимые с 2000 по 2013 год. Проанализировано 13 исследований, из которых 3 европейских, 5 азиатских, 2 африканских и 3 американских. Более подробно уровень резистентности к антибиотикам H. pylori в различных странах приведен в табл. 5.

При анализе результатов исследований по антибиотикорезистентности H. pylori на территории России обращает на себя внимание рост уровня резистентности H. pylori к кларитромицину. Так, в 1996 г. в г. Москве не было выявлено резистентных штаммов к кларитромицину. Уже в 1999 г. уровень резистентности H. pylori к кларитромицину составил 17,1%, в 2000 г. 16,6%, в 2001 г. 13,8%, а в 2005 г. уже 19,3% [24, 25]. При интерпретации показателей резистентности важно учитывать методику определения чувствительности. Так, при использовании только генотипического метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) возможны сложности в интерпретации результатов. Примером могут служить данные, полученные в Санкт-Петербурге — 39–40% резистентных штаммов по данным ПЦР [26, 27]. В то же время резистентность к кларитромицину при оценке дискодиффузионным методом, который тоже имеет определенные ограничения, составила всего 7,7% [28].

Наибольшую информативность представляют данные о резистентности, полученные методом серийных разведений. На основании тестирования 133 штаммов методом серийных разведений сделан вывод о низкой резистентности в Смоленске в 2010 г. [29]. В нашем исследовании, при использовании сходной технологии тестирования, резистентность составила 25%, что еще раз иллюстрирует межрегиональные различия чувствительности микроорганизмов.

Фенотипический метод определения чувствительности к антибиотикам рекомендован Институтом по клиническим и лабораторным стандартам (CLSI), EUCAST, а также Маастрихтским соглашением IV пересмотра в качестве основного метода определения чувствительности H. pylori к кларитромицину [38]. Культуральный метод является высокоспецифичным тестом, однако характеризуется низкой чувствительностью [39]. Определение чувствительности H. pylori к антибиотикам в нашей стране сопряжено с рядом трудностей. Успех бактериологического выделения H. pylori во многом связан с правильностью отбора биопсийных образцов и соблюдением условий транспортировки материала в лабораторию. Хеликобактер является труднокультивируемым микроорганизмом, что требует не только навыков работы с его чистой культурой, но и четкого соблюдения методики разведения рабочих концентраций исследуемых антибактериальных препаратов. Учитывая объективные сложности, описанные выше, становится понятным отсутствие широко представленных данных об истинном состоянии антибиотикорезистентности в различных регионах нашей страны. Большинство исследователей в своих суждениях об антибиотикорезистентности H. pylori опираются на метод ПЦР как единственную доступную альтернативу бактериологическому методу, который позволяет определить генетические мутации H. pylori и прогнозировать фенотипическую резистентность [7].

Такая стратегия была использована нами для лечения пациентов, гастробиоптаты которых использовались в данном исследовании. Применение стандартной тройной терапии с двойной дозой ингибиторов протонного насоса, усиленной препаратом висмута трикалия дицитрата, привело к уничтожению H. pylori у 93,2% пациентов, несмотря на выявленную высокую резистентность к кларитромицину [44].

На основании проведенного бактериологического исследования антибиотикорезистентности штаммов H. pylori можно сделать следующие выводы и рекомендации:

Полученные данные о резистентности H. pylori в Санкт-Петербурге делают актуальным использование всех возможностей для повышения эффективности стандартного подхода: двойные дозы ингибиторов протонного насоса, увеличение длительности с 7 до 10–14 дней, добавление препаратов висмута и пробиотиков, поиск новых стратегий эрадикации.

Литература

За остальным списком литературы ? обращайтесь в редакцию.

В. И. Симаненков* , 1 , доктор медицинских наук, профессор
Н. В. Захарова*, доктор медицинских наук, профессор
А. Б. Жебрун**, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН
А. В. Сварваль**, кандидат медицинских наук
И. В. Савилова*
Р. С. Ферман**

* ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург
** НИИ ЭиМ им. Пастера, Санкт-Петербург

Показания к обследованию. Хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, лимфомы, рак желудка.

Материал для исследований. Биоптаты слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки; образцы фекалий, желудочный сок, зубной налет, сыворотка крови.

Этиологическая лабораторная диагностика включает посев клинического материала с дальнейшей культуральной и биохимической идентификацией возбудителя, определением антибиотикочувствительности; выявление ДНК микроорганизма; обнаружение специфических АТ к АГ Helicobacter pylori. Скрининговые экспресс тесты, такие как определение уреазной активности возбудителя в биоптатах желудка, гистологическое исследование биоптатов, дыхательные тесты, носят ориентировочный характер.

Сравнительная характеристика методов лабораторных исследований. Посев биопсийного материала слизистой оболочки желудка, полученного при эндоскопическом обследовании, является наиболее информативным из используемых методов, он позволяет проводить дополнительные исследования (определение чувствительности микроорганизма к антибиотикам), однако высокая трудоемкость такой диагностики делает ее малораспространенной. Принадлежность выделенной культуры к роду Helicobacter оценивается на основании морфологии колоний и культуры в мазке, окрашенном по Граму, а также по ферментативным свойствам (продукция уреазы, каталазы и оксидазы). Дифференциальная диагностика H.pylori проводится с Сampylobacter jejuni.

Наибольшее распространение на практике получили экспресс-методы исследования биоптатов слизистой желудка, основанные на выявлении уреазной активности микроорганизмов, присутствующей в таких препаратах. По диагностической специфичности и чувствительности они уступают прямым методам выявления возбудителя, кроме того, требуют инвазивной процедуры получения биоптатов при эндоскопии. Чувствительность и специфичность данных тестов существенно варьирует при использовании реагентов разных производителей.

Выявление ДНК методом ПЦР в сравнении с быстрыми уреазными тестами обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, в сравнении с культуральными исследованиями – меньшей трудоемкостью, с гистологическими исследованиями – меньшей субъективностью. Наборы реагентов для диагностики инфекции с использованием ПЦР предназначены как для обнаружения ДНК H.pylori, так и для характеристики генов, кодирующих факторы вирулентности патогена.

Выявление в сыворотке крови пациента специфических АТ к АГ микроорганизма используется для первичной диагностики инфекции. Недостатком такого способа диагностики является отсутствие возможности контролировать результаты этиотропного лечения после его окончания, так как уровень специфических АТ медленно снижается после эрадикации H.pylori. При первичной диагностике инфекции положительный результат обнаружения АТ, клинические симптомы и эндоскопически выявленная язвенная болезнь желудка/двенадцатиперстной кишки или эрозивный гастрит достаточны для обоснования диагноза и использование дополнительных методов диагностики не требуется. В Европейских странах выявление АТ методом ИФА является наиболее распространенным методом диагностики инфекции Helicobacter pylori, позволяющим диагностировать наличие возбудителя без эндоскопического обследования.

Показания к применению различных лабораторных исследований. Посев материала, отобранного с использованием инвазивных процедур, с дальнейшей культуральной и биохимической идентификацией возбудителя, выполняют по клиническим показаниям. Выявление АТ используют для первичного скрининга.

Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований. Выявление возбудителя культуральным методом или обнаружение ДНК возбудителя методом ПЦР являются достоверным подтверждением инфицированности. Обнаружение АТ к H.pylori свидетельствует об инфицированности данным возбудителем и может указывать на хронический гастрит типа В, язвенную болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки. Уровень специфических АТ коррелирует с массивностью обсеменения слизистой желудка H.pylori и патоморфологической картиной процесса. Обнаружение АТ выявляют факт инфицирования при манифестных, субклинических формах, а также в стадиях ремиссии заболевания. Терапию не назначают на основании результатов выявления АТ к H.pylori, для уточнения диагноза рекомендуется проведение эндоскопического исследования.

При выявлении специфических АТ могут быть получены ложноотрицательные результаты, обусловленные несколькими причинами: особенностями иммунной системы пациента, не вырабатывающей АТ к АГ H.рylori, взятием проб крови на исследование на ранней стадией инфицирования возбудителем, недостаточной чувствительностью используемого метода. Ложноположительный результат может быть получен у новорожденных (трансплацентарная передача АТ от матери); после санации (эрадикации возбудителя и достоверном отсутствии его в тканях по результатам бактериологического исследования) в течение 6 месяцев.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Copyright ФБУН Центральный НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, 1998 - 2020

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Владельцы патента RU 2588469:

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в гастроэнтерологии. Предложен способ определения чувствительности Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам. Проводят серию двукратных разведений антибактериальных препаратов в бульоне Шедлера с рН 7,6±0,2 в горизонтальных лунках 96-луночного планшета. Приготовленную взвесь бактерий вносят в лунки, культуру инкубируют в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов при температуре 37°С. Добавляют реагент, используемый при постановке уреазного теста идентификации Helicobacter pylori. Измеряют оптическую плотность содержимого лунок планшета с помощью спектрофотометра, используя длину волны 630 нм. Минимальная подавляющая концентрация антибиотика определяется при построении графика соотношения концентрации антибиотика и оптической плотности и находится в точке выхода кривой на нулевой уровень значения оптической плотности. Способ обеспечивает повышение точности определения чувствительности культур Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам. 2 ил., 6 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, в частности медицинской микробиологии, и может быть использовано для определения чувствительности Helicobacter pylori, а также других уреазопозитивных культур к антибиотикам с целью выбора препарата для включения в схему эрадикационной терапии.

Резистентность Helicobacter pylori к антибиотикам является распространенным явлением как в России, так и во всем мире. С каждым годом наблюдается рост устойчивости штаммов данного микроорганизма к антибактериальным препаратам, входящим в состав схем эрадикационной терапии, что снижает эффективность лечения и обосновывает все возрастающую актуальность проводимых в данном направлении исследований.

Одним из путей повышения эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori, является индивидуальный подбор антибактериальных препаратов по результатам определения антибиотикочувствительности возбудителя [Оптимизация лечения заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori [Текст] / Е. Ткаченко, Ю. Успенский, Н. Барышникова // Врач. - 2012. - №1. - С. 36-38].

Из уровня техники известен способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом двукратных серийных разведений препарата в жидких питательных средах [Поздеев О.К. Медицинская микробиология: учебное пособие / под ред. В.И. Покровского. - 4-е изд. испр. [Текст]. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - С. 177, 178].

Постановку данного способа осуществляют следующим образом. Среду разливают по 2 мл в 6÷10 пробирок. В первую пробирку добавляют 2 мл раствора антибиотика определенной концентрации, перемешивают, после чего переносят 2 мл в следующую пробирку, продолжая разведение до предпоследней пробирки, из которой удаляют 2 мл содержимого. Последняя пробирка - контрольная.

В каждую пробирку с соответствующим разведением антибиотика, а также в контрольную пробирку добавляют по 0,2 мл взвеси культуры, приготовленной в зависимости от вида микроорганизма в концентрации 0,1÷1·10 9 м.кл.·см -3 . Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика в отношении исследуемого штамма микроорганизма определяют по последней пробирке с задержкой роста (прозрачная среда). МПК соответствует степени чувствительности микроорганизма к данному антибиотику.

Недостатками данного метода являются трудоемкость, большой расход материалов, особенно при одновременном определении чувствительности нескольких штаммов микроорганизма к различным антибактериальным препаратам, длительность анализа, а также субъективность оценки результатов опыта - результат оценивают визуально.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам [Патент РФ №2013110948/10, 12.03.2013 Способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам [Текст] /С.В. Шабунин, О.А. Манжурина, А.В. Степанов // Патент России №2529711 С1, 2013]. Определение чувствительности бактерий, вызывающих кишечные инфекции, проводят путем посева в лунки планшета, содержащие разведения антибактериальных препаратов в концентрации 10 мкг·см -3 в питательной среде с pH 7,2-7,6 ЕД. Индикатором служит 0,5%-ный раствор бромкрезолового пурпурного. Вывод о чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам проводят по наличию или отсутствию роста бактерий и изменению окраски среды с красной на желтую.

Однако данный метод адаптирован только в отношении группы кишечных бактерий (Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis и др.), которые растут на специфических селективных питательных средах, непригодных для роста Helicobacter pylori. Недостатком данного метода является также визуальная оценка результатов исследования.

Задачей изобретения является уменьшение трудоемкости, сокращение расхода материала и времени анализа с 3-5 суток до 24 часов, повышение точности определения чувствительности культур Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам путем оценки результатов с помощью спектрофотометра.

Поставленная задача решена путем внесения в лунки 96-луночного планшета бульона Шедлера, добавления в лунки первого вертикального ряда планшета антибиотиков в определенной концентрации, осуществления серий двукратных последовательных разведений каждого препарата в горизонтальных рядах планшета с последующим внесением в каждую лунку одинаковой концентрации исследуемого штамма Helicobacter pylori, инкубации содержимого в течение 24 часов при 37°C в микроаэрофильных условиях, внесения по окончанию инкубации реагента, используемого для биохимической идентификации Helicobacter pylori при постановке уреазного теста, учета результата оптической плотности содержимого лунок на спектрофотометре.

Определение чувствительности к антибиотикам было проведено в отношении штаммов, находящихся в музейной коллекции кафедры микробиологии Вятского Государственного университета (г. Киров).

Для исследования, на основании анализа литературных источников [Ткач С.М. Оптимизация терапевтических стратегий лечения Helicobacter pylori на современном этапе [Текст] // Крымский терапевтический журнал. - 2009. - №2. - С. 43-48; Ивашкин В.Т. Рекомендации Российской Гастроэнтерологической Ассоциации по диагностике и лечению инфекции Helicobacter pylori у взрослых. - 2012. - Т.22. - №1. - С. 87-89] были выбраны антибактериальные препараты, наиболее часто используемые в схемах эрадикационной терапии хеликобактериозов: кларитромицин, амоксициллин, доксициклин, метронидазол, ципрофлоксацин, фуразолидон.

Из культуры Helicobacter pylori с концентрацией 1·10 9 м.к.·см -3 , используя бульон Шедлера [Патент РФ №2012125394/10, 20.06.2012 Двухфазная питательная среда для тонкослойного культивирования Helicobacter pylori и способ его осуществления [Текст] / В.А. Алешкин, Г.Ш. Исаева, Е.П. Селькова, С.С. Афанасьева // Патент России №2012125394 С1, 2013 г.], готовят десятикратные разведения путем последовательного переноса по 0,10 см 3 суспензии клеток в 0,9·см 3 бульона, получая концентрации 1·10 8 , 1·10 7 м.к.·см -3 . Для проверки чувствительности к антибиотикам используют суспензию клеток с концентрацией 1·10 7 м.к.·см -3 .

В качестве питательной среды для определения чувствительности Helicobacter pylori к антибиотикам используют бульон Шелдера с pH 7,6±0,2 ЕД.

В качестве индикатора применяют реактив для постановки уреазного теста [Конорев М.Р. Методы диагностики Helicobacter pylori [Текст]/ Методические рекомендации. - Витебск, 2000. - С. 25], который готовят следующим образом:

- приготовить на дистиллированной воде 0,4 М фосфатно-солевой буфер с pH 6,7-6,8 ЕД путем смешивания заранее приготовленных солей: 0,4 М КH₂PO₄ и 0,4 М К₂HPO₄;

- растворить 5 г мочевины и 0,02 г азида натрия в 90 см 3 приготовленного по п. 1 0,4 М фосфатно-солевого буфера, получив реагент №1;

- 0,02 г фенолового красного развести в 10 см 3 бидистиллированной H₂O, получив 0,2% феноловый красный - реагент №2;

- 90 3 см реагента №1 смешать с 10 см реагента №2. Готовый раствор хранить при температуре 4°C.

Постановку способа проводят следующим образом. Один планшет рассчитан на исследование чувствительности семи культур с одним антибиотиком. В лунки стерильного 96-луночного планшета вносят по 100 мкл бульона Шедлера. Концентрацию антибиотика для внесения в первую лунку каждого горизонтального ряда определяли по результатам предварительных опытов с более широким диапазоном значений. Исходя из этого, антибиотик добавляют в первую лунку каждого горизонтального ряда планшета в концентрации 256 мг·л -1 (128 мг·л -1 или 64 мг·л -1 ) и титруют слева направо, перенося 100 мкл из каждой предыдущей лунки в последующую до 12 лунки, из которой 100 мкл удаляют. В каждую лунку первого горизонтального ряда вносят по 10 мкл бульона, в лунки остальных горизонтальных рядов вносят 10 мкл готовой взвеси культуры Helicobacter pylori, выделенной из биологического материала соответствующего пациента, в концентрации 1·10 7 м.к.·см -1 , получая конечную концентрацию культуры в каждой лунке 1·10 6 м.к.·см -1 . Схема опыта представлена в таблице 1.

Выбор времени инкубации был определен экспериментальным путем. При инкубации содержимого планшета более 24 ч (в течение 48 ч) после добавления индикатора значение оптической плотности, определяемое на спектрофотометре, превышало 1,0, что затрудняло интерпретацию результатов.

Результаты оценивают на планшетном спектрофотометре типа Multiscan ascent (Финляндия), измеряя оптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны 630 нм.

Принцип оценки чувствительности Helicobacter pylori к антибиотикам, входящим в схемы эрадикационной терапии с использованием мочевины и фенолового красного, заключается в следующем. Если соответствующая концентрация антибиотика не подавляет рост Helicobacter pylori, микроорганизм размножается и продуцирует уреазу. При добавлении реагента, содержащего мочевину, уреаза взаимодействует с мочевиной, при этом мочевина разлагается на углекислый газ и аммиак. Аммиак сдвигает pH среды в щелочную сторону, что сопровождается изменением цвета индикатора на розово-красный. Таким образом, чем более выражена уреазная активность микроорганизма, тем интенсивней цвет окраски содержимого лунки, что определяется по значению оптической плотности.

За минимальную подавляющую концентрацию принимают ту концентрацию антибиотика, которой соответствует первое минимальное значение оптической плотности в лунке, отличающееся от предыдущего не менее чем в 2 раза.

Микроскопия мазков, сделанных из соответствующих лунок при отработке способа, показала отсутствие в мазках микробных клеток. При высеве содержимого из таких лунок на колумбийский агар рост микроорганизма отсутствовал.

Для подтверждения правильности полученных результатов параллельно проводили определение МПК антибиотиков в отношении Helicobacter pylori с применением метода двукратных серийных разведений в пробирках. Учет результатов проводили на 3-5 сутки инкубации культур при 37°C в микроаэрофильных условиях в течение 3-5 дней. МПК в отношении исследуемого штамма определяли по концентрации антибиотика, содержащейся в последней пробирке с задержкой роста микроорганизма (прозрачный бульон). Помимо визуальной оценки проводили постановку уреазного теста с содержимым пробирок в планшетах. Для этого после тщательного перемешивания 110 мкл содержимого пробирок, последовательно по мере убывания концентрации содержащегося в них антибиотика, переносили в лунки планшета, добавляли 50 мкл реагента и проводили измерение на спектрофотометре.

Результаты определения МПК исследуемых антибиотиков в отношении Helicobacter pylori при постановке метода в планшетах с использованием уреазного теста были сопоставимы с результатами, полученными при определении МПК в пробирках.

Для отрицательного контроля была использована уреазонегативная культура Escherichia coli. Определение чувствительности Escherichia coli к антибиотикам с помощью уреазного теста в планшетах не выявило закономерностей, определяемых при постановке данного теста с уреазепозитивной Helicobacter pylori.

Изобретение поясняется следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Определение чувствительности штаммов Helicobacter pylori к ципрофлоксацину с помощью уреазного теста

Результаты оценки чувствительности штаммов Helicobacter pylori к ципрофлоксацину с помощью уреазного теста в планшетах представлены в таблице 2.

Из данных, представленных на рисунке 1, видно, что МПК ципрофлоксацина в отношении тестируемой культуры Helicobacter pylori составляет 1 мг·л -1 .

Результаты определения МПК ципрофлоксацина в отношении культур Helicobacter pylori при постановке уреазного теста в планшетах были сопоставимы с таковыми при определении МПК методом двукратных разведений ципрофлоксацина в пробирках. Учет результатов при этом проводили визуально и на планшетном спектрофотометре после инкубации содержимого пробирок в течение 5-ти суток в микроаэрофильных условиях при температуре 37°C. Для объективной оценки результата после тщательного перемешивания 110 мкл содержимого пробирок переносили в лунки планшета с последующей постановкой уреазного теста и учетом данных на спектрофотометре, используя длину волны 630 нм.

В таблице 3 представлены результаты определения чувствительности культур Helicobacter pylori к ципрофлоксацину с использованием различных условий постановки уреазного теста (непосредственно в планшетах через 24 ч и в планшетах при использовании содержимого пробирок после 5-ти суток инкубации).

Пример 2 - Определение чувствительности штаммов Helicobacter pylori к кларитромицину с помощью уреазного теста.

Результаты оценки чувствительности штаммов Helicobacter pylori к кларитромицину с помощью уреазного теста в планшетах представлены в таблице 5.

На примере оценки МПК кларитромицина в отношении культуры №2 Helicobacter pylori построен график зависимости оптической плотности содержимого лунок планшета от концентрации антибиотика в лунках (рисунок 2). Значение МПК находится в точке выхода графика на нулевое значение оптической плотности.

Из данных, представленных на рисунке 2, видно, что МПК кларитромицина в отношении тестируемой культуры Helicobacter pylori составляет 8 мг·л -1 .

Результаты определения МПК в отношении культур Helicobacter pylori при постановке уреазного теста в планшетах были сопоставимы с таковыми при определении МПК методом двукратных разведений кларитромицина в пробирках. Учет результатов при этом проводили визуально и на планшетном спектрофотометре после инкубации содержимого пробирок в течение 5-ти суток в микроаэрофильных условиях при температуре 37°C. Для объективной оценки результата после тщательного перемешивания 110 мкл содержимого пробирок переносили в лунки планшета с последующей постановкой уреазного теста и учетом данных на спектрофотометре, используя длину волны 630 нм.

В таблице 6 представлены результаты определения чувствительности культур Helicobacter pylori к кларитромицину с использованием различных условий постановки уреазного теста (непосредственно в планшетах через 24 ч и в планшетах при использовании содержимого пробирок после 5-ти суток инкубации).

Способ определения чувствительности Helicobacter pylori, заключающийся во внесении антибактериальных препаратов в лунки планшета, отличающийся тем, что в горизонтальных лунках 96-луночного планшета проводят серию двукратных разведений антибактериальных препаратов в бульоне Шедлера рН 7,6±0,2, при этом приготовленную взвесь бактерий вносят в лунки, культуру инкубируют в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов при температуре 37°С, затем добавляют реагент, используемый для биохимической идентификации Helicobacter pylori при постановке уреазного теста, после чего результат учитывают с помощью спектрофотометра, измеряют оптическую плотность содержимого лунок планшета, используя длину волны 630 нм, причем за минимальную подавляющую концентрацию принимают минимальное значение концентрации антибиотика в ряду его разведений, при котором наблюдается снижение оптической плотности до фонового уровня, и при построении графика соотношения концентрации антибиотика и оптической плотности данное значение минимальной подавляющей концентрации находится в точке выхода кривой на нулевой уровень значения оптической плотности.