Днк энтерококка фекального стрептококка e faecalis e faecium

, MD, FACP, Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University;

, MD, Wellington Regional Medical Center, West Palm Beach

Last full review/revision September 2017 by Larry M. Bush, MD, FACP; Maria T. Perez, MD

Энтерококки являются частью нормальной кишечной флоры. Они были классифицированы как группа D стрептококков, но теперь считаются отдельным родом. Существует > 17 видов, однако E. faecalis и E. faecium являются наиболее частыми этиологическими причинами инфекции у человека.

Энтерококки обычно вызывают

Внутрибрюшные инфекции и инфекции органов таза

Лечение

Различается в зависимости от локализации инфекции и результатов исследования на чувствительность

(См. также материалы Американской ассоциации кардиологов (the American Heart Association) Инфекционный эндокардит у взрослых: диагностика, антибактериальная терапия, лечение осложнений (Infective Endocarditis in Adults: Diagnosis, Antimicrobial Therapy, and Management of Complications)).

Энтерококки, вызывающие эндокардит, сложно вылечить, если не использовать комбинацию препаратов, влияющих на клеточную стенку бактерии (например пенициллин, ампициллин, амоксициллин, пиперациллин, ванкомицин) и аминогликозида (например гентамицин, стрептомицин) для достижения бактерицидной активности. Тем не менее некоторые препараты, влияющие на синтез клеточной стенки, имеют ограниченную активность или вовсе не активны в отношении энтерококков; таковыми являются нафциллин, оксациллин, тикарциллин, эртапенем, большинство цефалоспоринов и азтреонам. E. faecium более устойчив к пенициллину, чем E. faecalis. В случае, если аминогликозиды назначать нельзя, эффективной альтернативой для лечения эндокардита, вызванного E. faecalis, является комбинация пенициллина или ампициллина с цефтриаксоном. Имипенем и, в меньшей степени, меропенем активны против E. faecalis.

При осложненных инфекциях кожи, обусловленных ванкомицин-чувствительными энтерококками, как вариант эффективного лечения могут применяться даптомицин, линезолид, тедизолид и тигециклин.

Пиперациллин-тазобактам и имипенем или меропенем рекомендуются для осложненных интраабдоминальных инфекций, когда предполагается или точно установлено, что они вызваны энтерококками.

ИМП не требуют бактерицидной терапии и, если возбудитель чувствителен, возможно применение одного антибиотика, например ампициллина. Нитрофурантоин и фосфомицин часто эффективны против устойчивых к ванкомицину энтерококковов, которые явились причиной ИМП.

В последние несколько десятилетий, устойчивость к некоторым противомикробным препаратам резко возросла, особенно среди E. faecium.

Устойчивость к аминогликозидам (например к гентамицину, стрептомицину), в частности у E. faecium, продолжает проявляться.

Ванкомицин-резистентные энтерококки (ВРЭ) могут быть также устойчивыми к другим гликопептидам (например, тейкопланину), аминогликозидам и активным против клеточной стенки бета-лактамным антибиотикам (например, пенициллину G, ампициллину). В случае обнаружения микроорганизма, зараженные пациенты подлежат строгой изоляции. Рекомендуемое лечение включает назначение стрептограминов (хинупристина/дальфопристина только против E. faecium) и оксазолидинонов (линезолида, тедизолида). Даптомицин и тигециклин обладают активностью против ванкомицин-резистентных энтерококков in vitro и могут рассматриваться как вариант лечения энтерококковой инфекции.

Иногда, особенно при наличии большого числа микроорганизмов (например, вегетации при эндокардите), могут встречаться бета-лактамаза-продуцирующие энтерококки. Резистентность может проявляться клинически, несмотря на чувствительность микроорганизмов при стандартном тестировании. Эффективны могут быть ванкомицин или комбинация антибиотиков-ингибиторов бета-лактамов/бета-лактамаз (например пиперациллин/тазобактам, ампициллин/сульбактам).

Энтероккоки играют неодназначную роль в жизни человека. Энтероккоки широко распространены в природе. Они являются представителями нормальной микрофлоры человека и животных, встречаются в пищевых продуктах, в воде, растениях, у животных, птиц и насекомых. У людей, как у животных, они обитают в кишечнике, женском генитальном тракте, реже в уретре мужчин и в условиях стационара. Некоторые штаммы данных микроорганизмов, приобретя ряд признаков патогенности, могут вызывать серьезные инфекционные заболевания, а другие штаммы служат необходимым компонентом нормального микробиоценоза. Ключевым критерием для энтероккока является наличие или отсутствие у штамма генов патогенности.

В последние годы изучение энтерококков как биологических объектов и оценка их роли в физиологии и патологии человека чаще всего рассматриваются сквозь призму участия энтерококков в возникновении инфекционных заболеваний, количество которых постоянно нарастает. Однако односторонняя оценка микроорганизмов зачастую не позволяет объективно оценить их значение, так как многие из них являются составной частью нормальной микрофлоры. Обнаружение у больного энтерококков часто ставит неразрешимые вопросы перед клиницистами в плане определения врачебной тактики [4].

Род Enterococcus включает 16 основных видов, из которых наиболее распространены Е. faecalis и Е. faecium. В клиническом материале от человека чаще других видов встречаются Е. faecalis, Е. faecium, Е. gilvus и E. pallens. Длительное время данные микроорганизмы рассматривали как представителей сапрофитной флоры, не способной вызывать патологический процесс. Они входят в состав микрофлоры ротовой полости, кишечника и мочеполовой системы. E. faecium выделяется при исследованиях микрофлоры влагалища 25,3 % здоровых женщин. Большинство инфекций, вызываемых энтерококками, носит эндогенный характер и обусловлено инвазией микроорганизмов при избыточной колонизации данными бактериями сайтов прикрепления. Исследованиями убедительно показана возможность возникновения нозокомиальной инфекции, особенно при высокой частоте применения цефалоспоринов широкого спектра действия [8, 6].

Особую опасность представляет пролиферация мультирезистентных видов Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis. Эти микроорганизмы являются постоянными обитателями различных экосистем организма, в том числе и вагинального биотопа, и, кроме того, обладают способностью быстро приобретать устойчивость ко многим антибактериальным препаратам и передавать ее другим бактериям. Энтерококки являются одним из наиболее распространенных участников развития анаэробно-аэробных микст-инфекций. Являясь факультативными аэробами, они способны эффективно стимулировать рост облигатно-анаэробных патогенов, усиливая их вирулентный потенциал [1]

Наиболее частые проявления энтерококкковых поражений мочеполовой системы наблюдаются при длительном использовании катетеров, у клинически здоровых лиц подобные поражения наблюдаются значительно реже. Генерализованные формы энтерококковых инфекций могут развиваться как следствия поражений мочеполовой системы, однако более чем в 40% случаев путь попадания энтерококков в кровоток остается невыясненным [3].

В последнее десятилетие возросла роль двух видов энтерококков - E. faecalis и E. faeсium - как нозокомиальных патогенов в различных клиниках [17, 20]. Принимая во внимание увеличение числа лиц с иммунодефицитными состояниями, нельзя исключить возможное увеличение спектра видов энтерококков, причастных к патологии у человека [16].

Показано значение энтерококков как возбудителей инфекционных осложнений после операций аортокоронарного шунтирования, реконструктивных операций на сердце и трансплантации почек. Было изолировано 465 штаммов энтерококков из крови, операционного материала (клапанов сердца), мочи, отделяемого трахеи, ран, плевральной жидкости, внутрисосудистых катетеров. Энтерококки были обнаружены при воспалительных процессах у 39,8% пациентов отделений трансплантации почек, у 34,6% больных реанимационного отделения, 20,4т - сердечно-сосудистой хирургии и в 4,2% материала из операционного блока. Наибольшее количество этих микробов было изолировано из мочи (47,7%) и из трахеи (24,3%). Из крови пациентов различных отделений выделено 45 штаммов (E. faecalis - 0,7%, E. faecium - 14,6%). У выделенных энтерококков отмечена высокая степень резистентности к антибиотикам [5].

По данным B.E.Murray, в 1990 году 80-90% выделенных у человека энтерококков приходилось на долю E. faecalis и 5-10% - на E. faecium [19]. Энтерококки, изолированные при бактериемиях, составили 38,5% от грампозитивной микрофлоры и 9,7% - от всех изолятов энтерококков. По этиологической значимости энтерококки заняли второе место после коагулазоотрицательных стафилококков. Показано, что в 7-10% случаев бактериемии имеют энтерококковую этиологию. Свыше 60% тяжелых энтерококковых инфекций зарегистрированы в отделениях интенсивной терапии [11].

Исследования последних лет показали, что энтерококки синтезируют существенное количество веществ, так называемых факторов вирулентности, способствующих развитию инфекционного процесса.

Энтерококки продуцируют факторы вирулентности, которые могут объяснить их патогенетическую значимость в инфекционном процессе. К таким факторам можно отнести поверхностные белки, участвующие в процессе адгезии и инвазии еsp, аsal, еfaA, поверностные белки участвующие в процессе адгезии и инвазии сyl A, сylM - цитолизины, gel E - желотиназа, Spr E - сериновая протеиназа. Некоторые штаммы энтероккока обладают гиалуронидазной активностью. У клинических изолятов Е. faecalis обнаружена плазмида, кодирующая синтез поверхностного белка, сообщающего способность энтероккокам к интеграции с клетками кишечного эпителия. К факторам вирулентности относят также белки и токсины, обеспечивающие повреждение тканей хозяина, белки, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, а также факторы, индуцирующие воспаление [14].

Следует указать, что энтерококки редко являются причиной инфицирования здоровых лиц. Только при значительном снижении резистентности макроорганизма, особенно при травмах кишечника или мочеполового тракта в результате инструментальных исследований они могут проникать в стерильные в нормальных условиях органы и ткани организма хозяина, вызывая оппортунистические инфекции мочевыводящих путей, бактериемию, сепсис, подострый септический эндокардит, инфекции желчных путей или абсцессы в брюшной. Нельзя не отметить, что многие из так называемых факторов патогенности энтерококков являются необходимыми компонентами их функционирования, обеспечивающими их существование в свойственной им экосистеме, и не связаны напрямую с повреждением тканей хозяина или подавлением системы иммунитета. Так адгезины жизненно необходимы для нормальной колонизации в желудочно-кишечном тракте, а гидролаза желчных кислот повышает их шансы выжить в двенадцатиперстной кишке [15].

Известно, что факторы вирулентности энтерококков (цитолизин, желатиназа, агрегационная субстанция) могут быть вовлечены в патогенез инфекционного процесса по-разному, то есть экспрессия вирулентности может меняться от одного типа инфекции к другому и от одного вида макроорганизма к другому (таблица).

Энтерококк фекальный или энтерококк фекалис (лат. Enterococcus faecalis) — вид энтерококков, входящий в состав нормальной микрофлоры пищеварительного тракта человека, а также некоторых млекопитающих.

Фекальные энтерококки — самые часто встречающиеся в организме человека и домашней птицы энтероккоки. Фекальные энтерококки также колонизируют кишечник крупного рогатого скота, свиней, собак, лошадей, овец и коз.

Фекальный энтерококк может являться возбудителем различных инфекций: мочевыводящих путей, интраабдоминальных, органов малого таза, раневых, эндокардита. Фекальные энтерококки, наряду с энтерококками вида фэциум являются наиболее патогенными видами среди энтерококков, они составляют 80–90% от всех выделенных в клиническом материале человека энтерококков. Фекальные энтерококки часто бывают причиной внутрибольничных инфекций (Бондаренко В.М. Суворов А.Н. Симбиотические энтерококки и проблемы энтерококковой оппортунистической инфекции).

В то же время, фекальные энтерококки входят в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и многих позвоночных, играют важную роль в обеспечении колонизационной резистентности слизистой оболочки. Основное место обитания фекального энтерококка в организме — тонкая кишка, но он также встречается в толстой кишке, губчатой части мочеиспускательного канала, в половых органах, и, иногда, в полости рта. Фекальные энтерококки присутствуют в кале 90 % взрослых людей. Количество фекальных энтерококков во внешней среде является значимым санитарным и эпидемиологическим показателем ее фекальной загрязненности.

Бактериурия — наличие бактерий в моче может является признаком воспаления в мочевыводящих путях, мочевом пузыре, почках. При отсутствии каких-либо симптомов, истинная бактериурия (инфекция мочевых путей) диагностируется при наличии не менее 10 5 микробных тел в 1 мл свежевыпущенной мочи, иначе предполагается, что загрязнение мочи происходит при ее заборе. При наличии симптомов или при заборе мочи катетером диагностический порог может быть значительно уменьшен. Часто бактериурия не сопровождается какими-либо симптомами, тогда она называется бессимптомной или асимптоматическая бактериурией. В то же время, бактериурия нередко сочетается с симптомами цистита, пиелонефрита, простатита, уретрита, а также встречается у беременных. Бессимптомная бактериурия не всегда требует немедленного лечения.

Одним из возбудителей воспалений мочевыводящих путей (ВМП) является фекальный энтерококк, на долю которого приходится от 1 до 18 % (в зависимости от типа заболевания) всех выявленных при бактериурии патогенных микроорганизмов. Остальные виды энтерококков практически не встречаются среди возбудителей ВМП.

Антибактериальные средства (из имеющих описание в данном справочнике), активные в отношении Enterococcus faecalis: левофлоксацин, норфлоксацин, офлаксацин, рифаксимин, нифурател, доксициклин (не ко всем штаммам). Enterococcus faecalis умеренно чувствителен к ципрофлоксацину. 74 % штаммов Enterococcus faecalis не чувствительны к тетрациклину. Не активны в отношении Enterococcus faecalis линкомицин и клиндамицин. Чувствительные к ванкомицину и гентамицину штаммы Enterococcus faecalis чувствительны также к моксифлоксацину.

Для лечения острых неосложненных инфекций мочевыводящих путей, вызванных Enterococcus faecalis могут быть рекомендованы нитрофураны, цефалоспорины III поколения, гентамицин, фторхинолоны, последние — с оговоркой о неблагоприятных тенденциях к росту устойчивости. Следует отметить, что цефалоспорины лишены активности против энтерококков, а ранние фторхинолоны (ломефлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин) обладают слабой активностью против Enterococcus faecalis.

По современным представлениям вид Enterococcus faecalis относится к роду Enterococcus (энтерококки), который входит в семейство Enterococcaceae, порядок Lactobacillales, класс Bacilli, тип Firmicutes, Terrabacteria group, царство Бактерии.

По принятой ранее классификации энтерококки относились к стрептококкам серогруппы D и Enterococcus faecalis назвался Streptococcus faecalis. Традиционно он иногда называется фекальным стрептококком.

Описание

Подготовка

Показания

Интерпретация

Энтерококк фекальный (Enterococcus faecalis) — наиболее часто встречающаяся в организме бактерия рода энтерококков, представляющая нормальную микрофлору желудочно-кишечного тракта человека и некоторых млекопитающих. Обитает фекальный энтерококк в тонкой кишке, однако может обнаруживаться и в толстом кишечнике, губчатой части мочеиспускательного канала, в половых органах и изредка в ротовой полости. Заселение кишечника Enterococcus faecalis начинается с первых дней жизни ребенка и наиболее активно проходит у детей, вскармливаемых грудным молоком.

Энтерококки – молочнокислые грамположительные бактерии, факультативные анаэробы (т.е. микроорганизмы, способные осуществлять процесс жизнедеятельности как при ничтожно малом количестве кислорода, так и при значительном его присутствии). Осуществляя метаболизм бродильного типа и ферментируя разнообразные углеводы с образованием молочной кислоты, энтерококки снижают кислотность среды до 4,2-4,6 pH. Данный вид бактерий обеспечивает устойчивость слизистой оболочки к колонизации патогенными бактериями. Оптимальная температура для жизнедеятельности – от 35 до 37°С.

Несмотря на несомненную пользу от их присутствия, фекальные энтерококки являются одним из наиболее патогенных видов в своем роде бактерий, составляющих вместе с энтерококками фэциум 80-90% от всех выделенных в исследуемом материале энтерококков. Они способны возбуждать:

инфекции мочевыводящих путей;
интраабдоминальные инфекции (широкий спектр патологий, обусловленных проникновением бактерий в стерильные области брюшины);
заболевания органов малого таза;
раневые инфекции;
эндокардит (воспаление внутренней оболочки сердца).

Фекальный энтерококк является частой причиной воспалений мочевыводящих путей (ВМП) – в зависимости от типа заболевания на его долю приходится от 1 до 18 % всех выявленных при бактериурии (наличии бактерий в моче) патогенных микроорганизмов.

Кроме того, фекальные энтерококки часто бывают причиной внутрибольничных инфекций. Они устойчивы к воздействию внешней среды и дезинфицирующих средств, не гибнут до получаса при температуре до 60°С, что позволяет продолжительное время оставаться живыми, колонизируя предметы обихода.

Фекальные энтерококки присутствуют в кале 90 % взрослых людей. Количество фекальных энтерококков во внешней среде является значимым санитарным и эпидемиологическим показателем ее фекальной загрязненности.

Данное исследование проводится методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющим обнаружить специфические фрагменты ДНК Enterococcus faecalis в тестируемых образцах биоматериала: урогенитальном соскобе, сперме, моче, соскобе буккального эпителия.

Аналитические показатели теста:

исследуемый участок – фрагмент ДНК, характерный для Enterococcus faecalis;
специфичность теста – 100%;
чувствительность теста – 100 копий специфичного фрагмента ДНК фекального энтерококка в исследуемой пробе.

для определения причин хронического инфекционного процесса урогенитального тракта;
для диагностики инфекции при стертой картине воспаления мочеполовой системы;
для обследования беременных;
для выяснения причины внематочной беременности;
для диагностики бесплодия;
для контроля эффективности лечения антибиотиками (не ранее чем через 30 дней после окончания курса лечения);
при дисбактериозе кишечника;
при наличии признаков ослабления иммунитета.

Соскоб урогенитальный (цервикальный канал, влагалище, уретра)

Соскобы у женщин отбираются не ранее пятого дня от начала менструального цикла и не позже пятого дня до предполагаемой даты следующей менструации. Если наблюдаются явные признаки заболевания, отбор пробы проводится непосредственно в день обращения.

Требования по подготовке к тестированию:

за день до и непосредственно в день отбора материала запрещено спринцевание влагалища;
накануне исследования запрещено применение вагинальных препаратов – мазей, свечей и т.п.

Проба не отбирается:

параллельно с приемом внутрь или местным применением антибиотиков – после окончания курса лечения должно пройти не менее двух недель при местной терапии и 30 дней после внутреннего приема антибактериальных препаратов;
во время менструации;
ранее, чем через 24-48 часов после полового контакта;
после внутривлагалищного УЗИ;
после колькоскопии (диагностического осмотра входа во влагалище, его стенок и шейки матки при помощи специального прибора – кольпоскопа);
после мануального исследования и прочих манипуляций.

Мочеиспускательный канал (уретра)

У лиц обоего пола проба отбирается не ранее чем через 14 дней после применения антибиотиков местного действия и 30 дней после перорального приема противобактериальных средств.

За неделю до манипуляции рекомендуется прекратить прием всех медицинских препаратов. Если отказ от лечения невозможен, то пациенту необходимо поставить об этом в известность специалиста, направляющего его на обследование.

За 48 часов не вступать в половые контакты и не мастурбировать.

При отборе эпителиальных клеток из мочеиспускательного канала, манипуляция проводится перед мочеиспусканием или через 2-3 часа после него (при обильных выделениях из уретры у мужчин – через 1 час).

Сперма

Отбор материала с целью диагностики проводится до начала противобактериального, антивирусного и противопаразитарного лечения, химиотерапии, а также до лечебных или диагностических мероприятий в месте предполагаемой локализации агента инфекции. После курса лечения проба отбирается не ранее, чем через 10-14 дней при проведении локальной терапии и через 30 дней после перорального приема антибиотиков.

Сбор спермы (эякулята) проводится посредством мастурбации в стерильный медицинский контейнер, плотно закрывающийся крышкой. Проба не отбирается в ранее использовавшиеся и вымытые или обработанные средствами дезинфекции емкости. Не рекомендуется сдавать анализ при наличии обильных гнойных выделений из мочеиспускательного канала.

После сбора материал может храниться в холодильнике при температуре +2 - +8⁰С, но не более 10-12 часов.

На анализ собирается порция первой утренней мочи, выделенной не ранее, чем через 2-3 часа после предыдущего (ночного) мочеиспускания. Ее объем должен составлять порядка 20-30 мл. Емкость, используемая для сбора биоматериала – стерильный медицинский контейнер.

Моча собирается либо до проведения химиотерапии или лечения антибиотиками, либо через месяц после окончания курса лечения.

Перед началом манипуляции необходимо тщательно обмыть гениталии. Женщинам желательно воспользоваться гигиеническим тампоном во избежание попадания в пробу слизи из влагалища. Во время менструации материал не собирается.

После наполнения контейнера на треть-половину объема, емкость с мочой плотно закрывается крышкой, дабы избежать ее вытекания.

Доставка биоматериала должна быть организована в течение максимум 6 часов. До отправки в лабораторию моча может храниться как в холодильнике (при t⁰ от +2⁰С – замораживать ее нельзя), так и в комнате, но при этом температура не должна быть выше +25⁰С.

Соскоб буккального эпителия

Исследование проводится до проведения антибактериальной терапии.

Проба отбирается до приема пищи и проведения гигиенической обработки ротовой полости.

Соскоб берется медработником с внутренней поверхности щеки (буккального эпителия) или неба с помощью ворсинчатого зонда.

Нормой является отсутствие в исследуемой пробе специфических фрагментов ДНК Enterococcus faecalis.

в исследуемых образцах обнаружены специфические фрагменты ДНК Enterococcus faecalis.

специфические фрагменты ДНК Enterococcus faecalis не обнаружены;
количество агента инфекции ниже порога обнаружения.

Ф.И.О.: Иванов Иван Иванович Пол: м Год рождения: 01.01.0000

Дата исследования: 12.12.0000

Исследование

Результат

Нормы интерпретации

Примечание

[24] Enterococcus faecalis [кач.]

Пункты сдачи

1-2 дня

Материал исследования:

Соскоб урогенитальный, сперма, моча, соскоб буккального эпителия

Цена:

Авторы работы:

Научный журнал:

Год выхода:

УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2011, том 131, № 1, с. 95-101

РАЗРАБОТКА ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АССОЦИАЦИИ BACILLUS SUBTILIS И ENTEROCOCCUS FAECIUM

1 Институт проблем экологии и эволюции им.А.Н. Северцова РАН, Москва 2 Центр "Биоинженерия " РАН, Москва E-mail: ushakova@sevin.ru

Разработаны основы создания пробиотического препарата для животных с использованием ассоциации Bacillus subtilis и Enterococcus faecium. Показана возможность совместного твердофазного культивирования кишечных энтерококков (выделенного из лактирующей крольчихи штамма E. faecalis Rb и коллекционного штамма E. faecium B-8251) c B. subtilis B-8130 на геркулесе. Полученные препараты, включающие клетки бактерий, стимулировали развитие крольчат при введении препаратов в их рацион. Штамм E. faecalis Rb содержал характерные для E. faecalis гены вирулентности agg, gelE, efaAfs, что ограничивает его использование в пробиотических препаратах. В клетках E. faecium B-8251 обсуждаемые гены не обнаружены. Продукт совместной твердофазной ферментации B. subtilis B-8130 и E. faecium B-8251 при скармливании крольчатам стабилизировал обменные процессы и способствовал увеличению массы тела животных. Данная композиция перспективна для дальнейших исследований.

Ключевые слова: пробиотики, кролики, гены вирулентности энтерококков, рост и развитие.

Подбор микроорганизмов-продуцентов биологически активных веществ является важнейшей составляющей при разработке пробиотических препаратов. Для этих целей применяют сканирование различных коллекционных штаммов. Нами используется также подход, связанный с направленным изучением природных штаммов бактерий на основании зоологических наблюдений за поведением животных в сочетании с анализом морфологии и физиологических особенностей тех органов, секретов и экскретов, в которых развиваются симбионтные бактерии [12]. В частности, при изучении взаимодействия детенышей с лакти-рующей крольчихой показано, что мать активно вмешивается в отношения крольчат между собой и подавляет их агрессивные контакты [8]. В отсутствие матери высокий уровень агрессивности по отношению к другим членам группы проявляется в значительных колебаниях недельных приростов массы тела крольчат (рис. 1). Амплитуды колебаний средних недельных приростов массы тела крольчат при содержании с матерью уменьшают-

ся, и аналогичное влияние оказывают мягкие фекалии лактирующей крольчихи при ежедневном подкладывании их в клетки с крольчатами. Крольчиха выделяет мягкие экскременты, содержащие биомассу бактерий-симбионтов, которые поедает сама, а контактным способом экскреторная масса попадает в желудочно-кишечный тракт крольчат. Лишение животного возможности копрофагии отрицательно сказывается на физиологическом состоянии организма [20]. Из мягких экскрементов лактирующей крольчихи выделен микроорганизм, введение которого в корм крольчатам, содержащимся без матери, стимулировало у них обмен веществ [17]. Штамм идентифицирован как ЕЫетососст/аесаШ ЯЪ [8].

Полученные данные согласуются с результатами, представленными в работах по медико-биологической активности кишечных энтерококков. Показана перспективность их использования как в монокомпонентных пробиотических препаратах (например, препарат Ламинолакт [1, 10], так и в сочетании с лакто- и бифидобактериями в составе поликомпонентных пробиотических препаратов

Рис. 1. Динамика средних недельных приростов массы тела крольчат: 1 - с самкой, 2 - с калом, 3 - контроль.

(Линекс, Бифиформ) [2], а также пробиотиков метаболитного типа (препарат Хилак-форте), в которых содержится оптимизированный набор продуктов метаболизма лактобацилл, кишечной палочки и фекального стрептококка: молочная кислота, аминокислоты, короткоцепочечные жирные кислоты, лактоза [11].

Энтерококки - обычные обитатели кишечника, и в норме их численность не превышает общее количество кишечных палочек. Энтерококки осуществляют метаболизм бродильного типа, ферментируют углеводы с образованием в основном молочной кислоты без газа, снижают рН до 4.2-4.6. Теоретический и практический интерес представляет изучение возможности комбинирования кишечных энтерококков с пробиотиче-скими штаммами Bacillus subtilis для получения высокоэффективных кормовых добавок для сельскохозяйственных животных. Нами разрабатывается процесс получения биологически активных препаратов путем твердофазного сбраживания растительных субстратов, до некоторой степени имитирующий отдельные стадии пищеварения в слепой кишке позвоночных [13, 15, 16, 18]. В качестве рабочего штамма используется штамм B. subtilis В-8130, который входит в со став пробио-тических кормовых добавок. Субстратами служат растительные отходы - различные типы шротов, жомы, жмыхи и др. Кишечные энтерококки обладают свойствами, указывающими на перспектив-

ность их сочетания с бациллой: они успешно развиваются в содержимом кишечника, где условия близки твердофазным, и выделяют бактериоцины [7, 22-24], которые могут повысить профилактические качества препарата, в том числе и против вирусных инфекций. В экспериментах на гното-бионтах показана защитная роль энтерококков от развития летальной вирусной инфекции [2]. Однако многие штаммы энетерококков, являющиеся природными контаминантами пищевых продуктов, выделенные из кишечника животных и даже входящие в состав производственных заквасок, содержат вирулентные детерминанты [4, 21].

Задача настоящей работы - изучение степени безопасности выделенного из мягких фекалий крольчихи и коллекционных штаммов энтерококков и выбор наиболее перспективного штамма для получения пробиотического препарата в комбинации с В. зиЫШз В-8130 в условиях твердофазного сбраживания фитосубстрата.

Работа выполнена в лаборатории научно-экспериментальной базы ИПЭЭ РАН "Черноголовка". В качестве объекта исследований использованы карликовые кролики (ОгусШ^из сишси1из) породы "цветной карлик".

Для генетических анализов использовали клетки бактерий Е. ГаесаШ ЯЪ, выращенные на мясо-пептонном агаре, а также штаммы, полученные из ВКПМ: Е. ГаесаШ В-4610 и Е. Гаесшш В-8251.

Выделение ДНК из бактерий проводили по ранее описанному методу [5, 14], основанному на модифицированном методе щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли [19] и "ггагё-тех-нологии фирмы "Pгomega" (США). Концентрация полученных препаратов ДНК при использовании этого метода составляла 30-50 мкг/мл; РНК присутствовала в следовых количествах (менее 1%, согласно данным электрофоретического анализа). Всего было получено по два независимых препарата ДНК для каждого из исследуемых штаммов.

ПЦР генов вирулентности проводили с использованием следующих пар праймеров [3, 19], синтезированных фирмой "Синтол" (Россия):

ТЕ3-ТЕ4 (ожидаемый размер ПЦР-фрагмента 1553 п.н.) ген agg,

ТЕ9-ТЕ10 (ожидаемый размер ПЦР-фрагмента 419 п.н.) ген gelE,

ТЕ17-ТЕ18 (ожидаемый размер ПЦР-фрагмен-та 517 п.н.) ген су1А,

ТЕ5-ТЕ6 (ожидаемый размер ПЦР-фрагмента 705 п.н.) ген е/аА/в.

Объем амплификационной смеси составлял 50 мкл и имел состав: 1 х буфер ДНК полимера-зы ВшТая (17 мМ ^Н4)^О4, 67 мМ трис-НС1, рН 8.8, 2 мМ MgQ2); по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq ("Диалат ЛТД", Россия). Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл - 94 оС х 9 мин, 55 оС х 1 мин, 72 оС х 2 мин; последующие 30 циклов - 94 оС х 1 мин, 55 оС х 1 мин, 72 оС х 2 мин; завершающий цикл -72 оС х 7 мин.

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2%-ном геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Фотографирование полученных данных проводили при помощи системы видеодокументации BioDocII, производство "Вште1ха", Германия.

Безвредность выделенного штамма ЯЪ оценивали путем наблюдений в течение 14 дней за физиологическим состоянием белых беспородных и черных СВА лабораторных мышей (п = 20) после введения в рот по 0.5 мл суспензии суточ-

ной культуры в молоке. Изучали влияние штамма на месячных лабораторных кроликов, наблюдая в течение 2 месяцев за состоянием детенышей (n = 20), в рацион которых были введены овсяные хлопья "Геркулес" производства ЗАО "Система Зерностандарт" (Россия), обогащенные клетками бактерий. Для этого на поверхность хлопьев распылением наносили суспензию 2-суточной культуры в молоке, и затем тонкий слой "геркулеса" (1-2 см) мягко высушивали на полочной сушилке при температуре 45 оС. Препараты вводили в рацион месячных крольчат, и в течение последующих 2 месяцев следили за динамикой роста молодняка, еженедельно взвешивая животных. Павших и заболевших животных за период наблюдений не отмечено. Двигательная активность, стул и состояние шерсти были нормальными. При вскрытии лабораторных животных после окончания эксперимента никаких патологических изменений в системах и органах не выявлено.

Для совместного твердофазного культивирования штаммов B. subtilis В-8130 с выделенным штаммом Rb или с коллекционным E. faecium В-8251 получали жидкие 2-суточные культуры бациллы на глюкозо-пептонной среде [6], а энтерококков - на 0.5%-ном молоке. Далее смешивали стерильный субстрат ("Геркулес") с жидкими культурами (B. subtilis В-8130 и Rb либо B. subtilis В-8130 и E. faecium В-8251) в соотношении 2:1:1 (вес/объем). Полученной влажной массой полностью заполняли полиэтиленовые пакеты и инкубировали в условиях ограниченного доступа воздуха в течение 2 сут. Готовый продукт тестировали микроскопией на отсутствие посторонних бактерий и грибов и высушивали по способу, описанному выше.

Количество клеток в препаратах оценивали по методу Виноградского-Брида [9], подсчитывая клетки в окрашенных карболовым генцианвио-летом мазках площадью 1 см2, с нанесенными 20 мкл разведенной в 100-200 раз суспензии, полученной при встряхивании 10 г массы в 100 мл стерильного физраствора с добавлением 10% речной гальки. Определяли pH в суспензии, полученной после разведения 5 г продукта твердофазной ферментации в 15 мл

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

КОТЕНКОВА Е.В., УШАКОВА Н.А., ФЕДОСОВ Е.В. — 2010 г.

КОЗЛОВА А.А., КОТЕНКОВА Е.В., УШАКОВА Н.А., ФЕДОСОВ Е.В. — 2008 г.

ГАВРИЛОВА Н. Н., КОЗЛОВА А. А., ЛАКТИОНОВ К. С., РАТНИКОВА И. А., УШАКОВА Н. А. — 2013 г.

ВОРОБЬЕВА З.Г., КУЛЬЧИЦКАЯ М.А., ЛАЗОВСКАЯ А.Л., СЛИНИНА К.Н. — 2013 г.

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.