Что такое молекулярно генетическое исследование на коклюш

Выявление возбудителя коклюша (Bordetella pertussis), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции определяется генетический материал (ДНК) микроорганизма в биоматериале.

Палочка коклюша, бактерия Борде – Жангу [полимеразная цепная реакция].

Синонимы английские

Whooping cough, B. pertussis, DNA [Polymerase chain reaction].

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок из носоглотки, мазок из зева (ротоглотки).

Как правильно подготовиться к исследованию?

• За 3-4 часа до взятия мазков из ротоглотки (зева) не употреблять пищу, не пить, не чистить зубы, не полоскать рот/горло, не жевать жевательную резинку, не курить. За 3-4 часа до взятия мазков из носа не закапывать капли/спреи и не промывать нос. Взятие мазков оптимально выполнять утром, сразу после ночного сна.

Общая информация об исследовании

Bordetella pertussis (B. pertussis) – это грамотрицательная аэробная коккобацилла, являющаяся возбудителем коклюша. Инфекция передается воздушно-капельным путем. Риск заболеть наиболее высок у не вакцинированных АКДС детей и беременных женщин. Следует отметить, что прививка АКДС не обеспечивает стопроцентную защиту от заражения, так как иммунный ответ постепенно угасает в течение 1-3 лет после вакцинации. В этой связи подростки и взрослые, вакцинированные более чем 3 года назад и находившиеся в тесном контакте с больным коклюшом или носителем B. pertussis, также подвергаются риску заражения.

В клинической практике применяют несколько лабораторных тестов для диагностики коклюша: посев на питательную среду, метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), серологические методы и исследование с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР – метод молекулярной диагностики, позволяющий выявлять в биологическом материале (например, в носоглоточном аспирате) фрагменты генетического материала (ДНК) возбудителя инфекции и наиболее точно и быстро диагностировать коклюш.

Специфичность ПЦР достигает 100 %, что обусловлено использованием в реакции специфичной именно для B. pertussis пары праймеров. Положительный результат у пациента с признаками поражения респираторного тракта позволяет подтвердить диагноз "коклюш" и исключить наличие других бактериальных (в том числе паракоклюша) и вирусных заболеваний.

Исследование с помощью ПЦР характеризуется высокой чувствительностью, превосходящей чувствительность бактериологического метода, ПИФ и реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Следует, однако, заметить, что она зависит от клинической стадии заболевания, в которую был взят биоматериал, от возраста пациента и предшествующего лечения.

В течении коклюша можно выделить 4 стадии: инкубационный период, катаральную, пароксизмальную стадию и стадию выздоровления. ПЦР является предпочтительным методом идентификации возбудителя при подозрении на коклюш в катаральную и раннюю пароксизмальную стадию (около 4 недель после появления первых симптомов). В этот период чувствительность ПЦР максимальна и превосходит чувствительность бактериологического метода. По прошествии более 3-4 недель чувствительность ПЦР несколько снижается. Это имеет особое значение при диагностике заболевания у взрослых пациентов, которые, как правило, игнорируют первые симптомы болезни, характерные для катаральной стадии, и обращаются за помощью в более поздние сроки, в пароксизмальную стадию. При диагностике коклюша в позднюю пароксизмальную стадию и при выздоровлении наиболее точные результаты будут получены при комбинации серологических исследований (например, РНГА) и исследования с помощью ПЦР.

Также ПЦР оптимальна для диагностики коклюша у младенцев, хотя у детей старшего возраста, а также подростков и взрослых она характеризуется большим числом ложноотрицательных результатов. Так, ее чувствительность при взятии биоматериала в первые 10 дней болезни в возрастных группах до 1 года, 1-4 года и старше 5 лет составила 70, 50 и 10 % (для сравнения: чувствительность "золотого стандарта" диагностики коклюша - посева на питательную среду - в этот период не превышает 60 %). В качестве биоматериала для диагностики коклюша у младенцев предпочтителен носоглоточный аспират. У детей старшего возраста, подростков и взрослых берут мазки из носоглотки и зева. Использование тампона из кальция альгината в этом случае не рекомендуется.

В отличие от других лабораторных методов, точность ПЦР в меньшей степени зависит от приема антибактериальных препаратов. Так, чувствительность метода при взятии биоматериала на 4-й день лечения эритромицином составила 89 % (бактериологического посева – 56 %), на 7-й день – 56 % (посева – 0). Поэтому ПЦР чаще выбирают для выявления B. pertussis у пациентов в катаральной стадии заболевания, если биоматериал сдается на фоне начатого лечения. Результаты теста при сдаче биоматериала на фоне лечения в пароксизмальную стадию во многих случаях ложноотрицательные.

Исследование с помощью ПЦР с успехом применяется у вакцинированных АКДС пациентов. При этом идентификация B. pertussis в мазках этой группы может означать транзиторное носительство, но не активную инфекцию, поэтому результаты ПЦР рекомендуется оценивать с помощью дополнительных эпидемиологических, клинических и лабораторных данных.

Для чего используется исследование?

• Для диагностики коклюша, особенно у младенцев в период катаральной и ранней пароксизмальной стадии заболевания.

Когда назначается исследование?

• При симптомах коклюша в катаральной стадии: лихорадка, насморк, заложенность носа, слезотечение.
• При симптомах коклюша в пароксизмальной стадии: приступы интенсивного кашля, сопровождающиеся глубоким свистящим вдохом, рвотой, цианозом кожи лица.
• При обследовании пациента, находившегося в тесном контакте с больным коклюшем.

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Причины положительного результата:

• коклюш;
• транзиторное носительство.

Причины отрицательного результата:

• отсутствие коклюша;
• ложноотрицательные результаты чаще наблюдаются при сдаче биоматериала в позднюю пароксизмальную стадию и стадию реконвалесценции, на фоне лечения антибиотиками.

Что может влиять на результат?

• Стадия заболевания – наиболее точный результат будет получен при сдаче анализа в первые 3-4 недели после начала заболевания.
• Возраст пациента – наиболее точный результат будет получен при обследовании пациентов в возрасте до 1 года.
• Применение эритромицина и других антибиотиков может приводить к ложноотрицательным результатам.



• Анализ не предназначен для оценки эффективности лечения.
• Результат исследования следует оценивать с помощью дополнительных эпидемиологических, клинических и лабораторных данных.

Также рекомендуется

Кто назначает исследование?

Инфекционист, педиатр, пульмонолог, врач общей практики.

Литература

• Laboratory manual for the diagnosis of whooping cough caused by Bordetella pertussis / Bordetella parapertussis. World Health Organization. Dept. of Immunization, Vaccines and Biologicals. WHO/IVB/04.14, 2004.
• Müller FM, Hoppe JE, Wirsing von König CH. Laboratory diagnosis of pertussis: state of the art in 1997. J Clin Microbiol. 1997 Oct;35(10):2435-43.
• Riffelmann M, Wirsing von König CH, Caro V, Guiso N; Pertussis PCR Consesus Group. Nucleic Acid amplification tests for diagnosis of Bordetella infections. J Clin Microbiol. 2005 Oct;43(10):4925-9.
• Lind-Brandberg L, Welinder-Olsson C, Lagergård T, Taranger J, Trollfors B, Zackrisson G. Evaluation of PCR for diagnosis of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis infections. J Clin Microbiol. 1998 Mar;36(3):679-83.
• Dalby T, Krogfelt KA. Laboratory diagnosis of pertussis: agglutination is not suitable. Respirology. 2011 Nov;16(8):1160-2.

На сегодня болезнь также является довольно опасной. Ежегодно около 300 000 людей умирает от этой патологии. Смертельными являются осложнения болезни, которые чаще наблюдаются у пациентов детского и преклонного возраста, в силу анатомо-физиологических и иммунных особенностей. Это говорит о том, насколько важно знать симптомы болезни и особенности лечения.

Особенности симптомов зависят от периода болезни. Они бывают следующие:

Рассмотрим их подробнее.

Инкубационный период длится с момента поступления возбудителя в организм до появления первых симптомов. Как правило, это от 3 до 20 суток. За это время дыхательные пути поражаются возбудителем настолько, что организм перестаёт компенсировать состояние и начинается клиническая картина болезни.

Катаральный период соответствует степени поражения организма патогенным агентом, а значит развивается постепенно. Пациент даже не может сразу определить начало болезни, настолько размытыми являются первые симптомы. Первый знак - сухой кашель или даже небольшое откашливание. Может быть насморк, при котором из носовых ходов выделяется слизь в незначительном количестве. Пациенты младшего возраста более тяжело переносят этот период, так как их анатомическое строение дыхательных путей способствует более быстрому развитию болезни. В целом, начало болезни напоминает ОРВИ, что часто сбивает с толку как пациентов, так и специалистов. Кашель постепенно становится все сильнее, к нему присоединяется раздражительность и беспокойное состояние пациента.

Далее развивается период спазматического кашля, что, обычно, совпадает с 2 неделей катарального периода. Длительность этого отрезка болезни - несколько недель, 3-4. В это время наблюдаются наиболее яркие проявления болезни, а именно спазматический кашель, который возникает приступами. Перед приступом появляются его предвестники - дискомфорт и першение в горле, чувство сдавливания в грудной клетке, паника и беспокойство. Время возникновения приступов может быть разным, нередко они беспокоят ночью.

Как распознать приступ кашля? Он состоит из сильных толчков, которые сменяют судорожные вдохи. Такой вдох сопровождается слабым стоном и свистом и называется репризой. Этот звук возникает при прохождении воздуха через сильно суженные дыхательные пути. По окончанию приступа у пациента начинает отходить вязкая прозрачная мокрота.

Если болезнь доходит до тяжёлой степени, могут появляться рвота, судороги, тахикардия, дыхательная недостаточность.

Внешне такой приступ сопровождается отёчностью тканей лица, цианозом, набуханием сосудов шеи. Может наблюдаться покраснение глаз, в повышенном количестве отходит слюна и слёзная жидкость.

Между приступами кашля ребёнок находится в нормальном состоянии, играет, кушает с аппетитом, не испытывает какого-либо дискомфорта. Из характерных симптомов, которые бывают при коклюше: язва белого цвета на уздечке языка, которая бывает при его повреждении зубами, кровоизлияния в конъюнктиву, склонность к носовым кровотечениям.

Стадия разрешения болезни постепенно сменяет предыдущий этап. Кашель возникает все реже, становится менее специфичным, исчезают приступы и репризы. Пациент становится слабым, астеничным, ощущает раздражительность и усталость. Это состояние истощённости может удерживаться некоторое время после болезни.

Период восстановления или реконвалесценции занимает около полугода. Пациент устаёт при физических нагрузках, детям трудно даются уроки, наблюдается капризность и эмоциональная лабильность. В этот период несколько снижена иммунная функция организма и пациент становится более склонный к ОРВИ, во время которых опять возникает типичный кашель для коклюша.

Такие периоды характерны для типичной клинической картины коклюша. Но есть и атипичные формы заболевания. Это абортивная и стёртая форма. Они могут наблюдаться у тех, кто вакцинирован, а также у взрослых, чей иммунитет более развит, чем у детей и пожилых людей.

Стёртая форма сопровождается обычным сухим кашлем, который не проходит на фоне приёма противокашлевых средств. Характерных приступов при этом нету. такой кашель может беспокоить пациента от нескольких недель до нескольких месяцев, однако состояние остаётся стабильным, осложнения не проявляются.

Абортивная форма характеризуется молниеносным течением, при котором симптомы внезапно появляются и так же внезапно проходят через несколько дней.

Когда необходима диагностика коклюша?

Показаниями к диагностике коклюша являются клинические проявления болезни, которые необходимо подтвердить или опровергнуть. Так как патология имеет инфекционный характер, постановка диагноза на основе клинических данных невозможны - необходимы результаты лабораторного исследования. Если у пациента есть характерные приступы кашля - анализ обязателен.

Существуют также эпидемические показания к диагностике. Необходимо сдавать анализы всем лицам, которые посещают или находились в детских учреждениях, больницах, родильных отделениях, где были обнаружены пациенты с коклюшем и есть риск заражения.

Кроме того, диагностика требуется для дифференциального диагноза при таких состояниях, как муковисцидоз, инородное тело дыхательных путей, астма, острые бронхиты, лимфогранулематоз, корь, пневмония, ОРЗ.

Современные методы диагностики патологии

На сегодня используются такие методы исследования:

Рассмотрим подробнее эти виды диагностики.

Исследование проводится на 5-7 день болезни, именно в это время оно обладает наибольшей информативностью. Также следует учесть то, что лучше всего проводить забор материала до начала приёма антибактериальной терапии, иначе результат может быть ложноотрицательным. Перед сдачей анализа нельзя принимать пищу, полоскать рот, пить, чистить зубы. Забор материала проходит с задней стенки глотки с помощью специального тампона. Иногда к пациенту подносят посуду с питательной средой во время кашля. Полученный материал сеют на питательный среды, которые подходят для жизнедеятельности и роста микроорганизма. Через несколько суток после получения материала можно сделать предварительной заключение, а через неделю - точный результат анализа.

Данная методика применяется на более поздних сроках болезни, через несколько недель после появления характерных симптомов. К этому времени бактериологический метод теряет свою эффективность, так как возбудитель практически исчезает из дыхательных путей, а вот антитела к нему циркулируют по организму. Определяются титры антител к патогену и их тип. Различают три класса иммуноглобулинов, М, А и G. Антитела класса М появляются на 2 неделе заболевания, иммуноглобулины А говорят о том, что болезнь развивается больше 2-3 недель, а иммуноглобулины G можно обнаружить после 4 недель болезни.

Это основной метод из серологической диагностики. Для исследования требуется венозная кровь. Полученный материал соединяют с лабораторным реактивом, который содержит патоген. Если в крови есть антитела, происходит возникновение иммунокомплекса, что говорит о наличии заболевания. Перед сдачей анализов пациент не должен принимать пищу, медикаменты, подвергаться физическим нагрузкам. Проводится исследование парных сывороток, промежуток между которыми от 10 до 14 дней. Результаты получают на основе прироста титра антител, что говорит о дальнейшем развитии патологии и позволяет исключить тот факт, что антитела появились в результате вакцины или ранее перенесённой болезни.

Метод полимеразно-цепной реакции - наиболее современный и качественный способ подтверждения или исключения диагноза. Для реакции необходимо сдать кровь. В лабораторных условиях проводится её исследование на предмет фрагментов аминокислот генетического материала возбудителя. Далее подтверждается или исключается принадлежность полученной структуры именно к тому типу возбудителя, который вызывает коклюш. Для анализа требуются специфические дорогостоящие реактивы и соответствующее оборудование лаборатории, а также навыки персонала.

Имеется в виду обычный анализ крови, который не обладает специфическими результатами. На его основе можно только уверенно сказать про наличие воспалительного процесса бактериального генеза, так как наблюдается лейкоцитоз с типичным сдвигом лейкоцитарной формулы. Такой результат может стать началом лабораторной диагностики, на основе которого врач сделает следующие назначения.

Схема диагностического исследования

Схема диагностики отличается по возрасту пациента, а также по наличию прививки от болезни.

Схема диагностики для тех, кто не прививался:

в первые две недели болезни эффективно проведение бактериологического обследования или ПЦР;

на 3-4 неделе болезни применяют ПЦР или серологическое исследование;

более 4 недель болезни - показание для серологического обследования.

На фоне приёма антибиотиков применяется ПЦР.

Для привитых лиц применяется такая схема обследования:

на 1-2 неделе болезни - метод ПЦР, бактериологический анализ;

на 3-4 неделе используют ПЦР;

срок болезни более 4 недель требует серологической диагностики.

Расшифровка результатов

Результаты бактериологического метода однозначны: наличие микроорганизмов в материале говорит о том, что именно они являются причиной патологии.

Гематологический метод является неспецифичным, диагностическое значение имеет повышение лейкоцитов более чем 9·109/л.

Результаты ПЦР являются положительными, если в организме есть фрагменты генетического материала бактерии.

Результаты серологической диагностики расшифровываются следующим образом:

менее 10,0 - отрицательный результат, отсутствие антител. Такой результат может быть у здорового человека или у пациента, который заболел менее, чем три недели назад;

от 10,0 до 50,0 - слабоположительная реакция, недостоверный результат, который требует повторной диагностики;

более 50,0 - реакция положительная, антитела обнаружены. Такой результат говорит о том, что человек болен или недавно перенёс коклюш.

Основные аспекты профилактики и лечения болезни

Профилактика коклюша заключается в плановой вакцинации. Применяется вакцина АКДС, которая содержит компоненты против коклюша, дифтерии и столбняка и применяется в возрасте 3, 4, 5, 6 месяцев, а после этого в 1,5 и 6 лет. Существует также экстренная профилактика, которая заключается в введении специфического иммуноглобулина после контакта непривитого ребёнка или ребёнка до года с носителем бактерии.

Вакцина обладает высокой эффективностью, однако она не исключает возможного заболевания. Обратите внимание на то, что болезнь в таком случае будет более лёгкой формы, не принесёт осложнений, а также не приведёт к тяжёлым последствиям, ограничившись лишь стёртыми симптомами болезни. Вакцина необходимо не столько для предотвращения самой болезни, сколько для профилактики её тяжёлого течения и смертельных осложнений. Неспецифическая профилактика заключается в соблюдении эпидемических мероприятий в коллективе, где есть случаи заболевания, ограничении контакта с носителями микроорганизма, санитарно-гигиеническими мероприятиями.

Лечение проводится в амбулаторных условиях для пациентов с лёгким течение болезни, а госпитализируют тех, кто тяжело переносит болезнь, детей маленького возраста. Применяется антибактериальная терапия, глюкокортикоиды, антигистаминные средства, витамины, препараты, которые влияют на дыхательную функцию. В тяжёлых случаях требуется дополнительное введение кислорода, ноотропов, психостимулирующих препаратов.

Причины пройти диагностику в СЗЦДМ

Лаборатория центра оснащена новейшим диагностическим оборудованием. Анализы выполняются быстро и качественно. В штате медицинских центров работают высококвалифицированные специалисты, что позволяет сделать диагностику разносторонней и эффективной. Пациент может не только установить факт заболевания, но и пройти расширенную проверку организма, а также лечение. Для наших врачей нет заболевания отдельной системы - они оценивают полноценное состояние пациента и лечат его, а не патологию. Есть возможность получить результаты исследования на личную электронную почту или получить их в распечатанном виде в медицинском центре.

Полный текст:

Цель исследования: оценка эффективности применения молекулярно-генетической диагностики при обследовании контактных лиц в очагах коклюшной инфекции.

Результаты. Из обследуемых контактных лиц в очагах коклюшной инфекции в 80,9% были дети и 19,1% — взрослые. В трех из восьми образовательных учреждений ранее были выявлены случаи коклюша у 7 детей в возрасте 7, 9, 11 и 15 лет. Диагноз коклюша у них был подтвержден в одном случае с помощью бактериологического метода и в шести случаях — с помощью серологических методов (ИФА и РНГА). Обнаружено 33 положительных ДНК-образца (7,7% от общего числа проб). ДНК-положительные образцы выделены от 18 учащихся и 15 работников образовательных учреждений. Среди учащихся положительные образцы в основном обнаружены у учеников 4-х классов в возрасте 10–11 лет. Среди работников образовательных учреждений ДНК-положительные образцы в большинстве (33,3%) случаев выделены от педагогов, а также от медицинского персонала и работников столовой. В двух очагах, где ранее были установлены источники инфекции, обнаружено 15 ДНК-положительных образцов, при этом у троих обследованных с ДНК-позитивными пробами наблюдались клинические проявления. В тех очагах, где ранее не был установлен источник инфекции и проводили обследования длительно кашляющих детей, обнаружено 18 ДНК-положительных образцов, причем у двух обследованных c ДНК-положительными пробами отмечались клинические проявления в виде кашля.

Заключение. Проведенные исследования подтвердили высокую эффективность применения молекулярно-генетических методов при обследовании очагов коклюшной инфекции для установления источника инфекции и при наличии длительно кашляющих детей.

младший научный сотрудник лаборатории диагностики дифтерийной и коклюшной инфекций,

д.м.н., доцент, руководитель лаборатории диагностики дифтерийной и коклюшной инфекций, 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10;

профессор кафедры микробиологии и вирусологии, Москва

д.м.н., главный научный сотрудник лаборатории профилактики коклюша и кори,

младший научный сотрудник лаборатории профилактики коклюша и кори,

д.б.н., профессор, директор,

д.м.н., профессор, зам. директора по биотехнологии,

к.б.н., доцент, доцент кафедры микробиологии и вирусологии,

ассистент кафедры микробиологии и вирусологии,

д.м.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии и вирусологии,

д.м.н., профессор кафедры клинической аллергологии и иммунологии,

академик РАН, профессор, д.м.н., зав. кафедрой клинической аллергологии и иммунологии,

1. Онищенко Г.Г. Эпидемиологическое благополучие населения России // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2013. № 1. С. 42–51. [Onischenko G.G. Epidemiological well-being of population of Russia. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 2013, no. 1, pp. 42–51. (In Russ.)]

2. Пpадед М.Н., Яцышина С.Б., Селезнева Т.С., Малинина С.В., Биpюлева Н.В., Любимова Т.Е., Воpобьева Н.С. ПЦР-диагностика инфекций, вызванных B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica // Клиническая лабораторная диагностика. 2013. № 1. С. 53–56. [Praded M.N., Yatsyschyna S.B., Selezneva T.S., Malinina S.V., Birulyeva N.V., Lubimo va T.Ye., Vorobyeva N.S. The kit of reagents for polymerase chain reaction diagnostic of infections caused by B. pertussis, B. paraper tussis and B. bronchiseptica. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika = Clinical Laboratory Diagnostics, 2013, no. 1, pp. 53–56. (In Russ.)]

3. Селезнева Т.С., Титова Н.С., Заргарьянц А.И., Максимова Н.М., Маркина С.С. Влияние вакцинопрофилактики на эпидемический процесс управляемых инфекций в Российской Федерации // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. № 2. С. 6–11. [Selezneva T.S., Titova N.S., Zargaryants A.I., Maksimova N.M., Markina S.S. Effect of vaccination on the epidemic process of vaccine-preventable diseases in Russian Federation. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni = Epidemiology and Infectious Diseases, 2002, no. 2, pp. 6–11. (In Russ.)]

5. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Pertussis – United States, 1997–2000. MMWR Morb. Mortal. WKLY Rep., 2002, vol. 51, no. 4, pp. 73–76.

6. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Pertussis Epidemic – California, 2014. MMWR Morb. Mortal. WKLY Rep., 2014, vol. 63, no. 48, pp. 1129–1132.

7. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Pertussis Epidemic – Washington, 2012. MMWR Morb. Mortal. WKLY Rep., 2012, vol. 61, no. 28, pp. 517–522.

8. King A.J., Van Gаkom T., Van der Heide H.G., Advani A., Van der Lee S. Changes in the genomic content of circulating Bordetella pertussis strains isolated from the Netherlands, Sweden, Japan and Australia: adaptive evolution or drift? BMC Genom., 2010, no. 11: 64. doi: 10.1186/1471-2164-11-64

9. Litt D.J., Jauneikaite E., Tchipeva D., Harrison T.G., Fry N.K. Direct molecular typing of Bordetella pertussis from clinical specimens submitted for diagnostic quantitative (real-time) PCR. J. Med. Microbiol., 2012, vol. 61, no. 12, pp. 1662–1668. doi: 10.1099/jmm.0.049585-0

10. Stone B.L., Daly J., Srivastava R. Duration of Bordetella pertussis polymerase chain reaction positivity in confirmed pertussis illness. J. Pediatric Infect. Dis. Soc., 2014, vol. 3, no. 4, pp. 347–349. doi: 10.1093/jpids/piu004

11. Qin X. Resurgence of whooping cough and the role of laboratory diagnosis. Clin. Microbiol. News Lett., 2015, vol. 37, no. 9, pp. 69–76.

12. Qin X., Galanakis E., Martin E.T., Englund J.A. Multitarget PCR for diagnosis of pertussis and its clinical implications. J. Clin. Microbiol., 2007, vol. 45, no. 2, pp. 506–511.

13. Rodgers L., Martin S.W., Cohn A., Budd J., Marcon M., Terranella A., Mandal S., Salamon D., Leber A., Tondella M.L., Tatti K., Spicer K., Emanuel A., Koch E., McGlone L., Pawloski L., Lemaile-Williams M., Tucker N., Iyer R., Clark T.A., Diorio M. Epidemiologic and laboratory features of a large outbreak of pertussis-like illnesses associated with cocirculating Bordetella holmesii and Bordetella pertussis – Ohio, 2010–2011. Clin. Infect. Dis., 2013, vol. 56, no. 3, pp. 322–331. doi:10.1093/cid/cis888

14. Van Amersfoorth S.C., Schouls L.M., Van der Heide H.G., Advani A., Hallander H.O., Bondeson K., Von König C.H., Riffelmann M., Vahrenholz C., Guiso N., Caro V., Njamkepo E., He Q., Mertsola J., Mooi F.R. Analysis of Bordetella pertussis populations in European countries with different vaccination policies. J. Clin. Microbiol., 2005, vol. 43, no. 6, pp. 2837–2843.

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Борисова Ольга Юрьевна. Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики при этих инфекциях. : диссертация . доктора медицинских наук : 03.00.07 / Борисова Ольга Юрьевна; [Место защиты: ФГУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии"].- Москва, 2009.- 257 с.: ил.

Содержание к диссертации

Глава I. Патогенные свойства возбудителей коклюша и дифтерии 18

1.1. Некоторые аспекты эволюционной изменчивости микроорганизмов 18

1.2. Биологические свойства возбудителя коклюша 26

1.2.1. Фенотипическая характеристика Bordetella pertussis 26

1.2.2. Антигенная структура и серотипирование штаммов возбудителя коклюша 27

1.2.3. Патогенные свойства штаммов В. pertussis 31

1.2.4. Генетическая характеристика штаммов В. pertussis 36

1.3. Биологические свойства возбудителя дифтерии 46

1.3.1. Микробиологическая характеристика Corynebacterium diphtheriae 46

1.3.2. Характеристика возбудителя дифтерии, циркулирующего на различных этапах эпидемического процесса дифтерийной инфекции 48

1.3.3. Патогенные свойства штаммов С. diphtheriae 55

1.3.4. Генетическая характеристика штаммов С. diphtheriae 57

Глава II. Применение молекулярно-генетических методов в диагностике коклюша и дифтерии 72

2.1. Использование молекулярно-генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний 72

Собственные исследования 84

Глава III. Материалы и методы 84

3.1 .Штаммы бактерий 84

3.2. Идентификация культур 87

3.3. Генотипирование штаммов В. pertussis 90

3.3.1. Выделение хромосомной ДНК 90

3.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) по выявлению генов: SI субъединицы коклюшного токсина (ptxA), пертактина (рт), фимбриальных генов (fim2 и/гтЗ), фактора колонизации трахеи (tc/A) 90

3.4. Генотипирование штаммов С. diphtheriae 97

3.4.1. Выделение ДНК С. diphtheriae 97

3.4.2. Амплификация фрагментов tox гена 97

3.5. Определение вирулентности штаммов В. pertussis 98

3.5.1. Заражение животных 98

3.5.2. Определение вирулентности 98

3.5.3. Лейкоцитозстимулирующая активность (ЛСА) культур 98

3.6. Статистическая обработка результатов 98

3.7. Программное обеспечение 99

Результаты исследования и их обсуждение 100

Глава IV. Структура основных генов патогенности В. pertussis и особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции 100

4.1. Особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции 101

4.1.1. Характеристика различных периодов эпидемического процесса коклюшной инфекции и фенотипические особенности возбудителя 101

4.2. Генетическая структура популяции штаммов В. pertussis в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции 112

4.2.1. Последовательность нуклеотидов ptxA гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями (аллеломорфами) этого гена 112

4.2.2. Последовательность нуклеотидов ргп гена, кодирующего пертактин, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями этого гена 117

4.2.3. Последовательность нуклеотидов фимбриальных генов (fim2 и/ЇтЗ) и распространение штаммов В. pertussis с различными их аллельными вариациями 125

4.2.4. Последовательность нуклеотидов tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, и распространение штаммов В. pertussis с различными аллельными вариациями этого гена 131

4.2.5. Сопоставление генетической структуры штаммов В. pertussis, используемых для производства АКДС-вакцины, и штаммов, выделенных от больных коклюшем на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции 133

4.2.6. Вирулентные свойства штаммов В. pertussis, несущих новые аллельные вариации 136

Глава V. Разработка ускоренных методов, основанных на амплификационных технологиях, для наблюдения и выявления возбудителя коклюша 144

5.1. Молекулярно-генетический метод, основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, для ускоренного выявления штаммов В. pertussis, циркулирующих на современном этапе 144

5.1.1. Разработка метода слежения за генетической структурой штаммов В. pertussis 145

5.1.2. Мониторинг штаммов В. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе, методом ГШР-ПДРФ 150

5.2. Ускоренный молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики коклюшной инфекции 152

5.2.1. Разработка ускоренного метода диагностики коклюша LAMP-вариант 153

5.2.2. Клинические испытания прямого ускоренного молекулярно-генетического метода LAMP-варианта 160

Глава VI. Особенности структуры генов, кодирующих синтез дифтерийного токсина (tox) и амилазной активности (ату) С. diphtheriae 172

6.1. Структурный ген токсинообразования (tox) С. diphtheriae 173

6.2. Особенности структуры генетической детерминанты амилазной активности штаммов С. diphtheriae 179

6.2.1. Генетическая детерминанта амилазной активности штаммов С. diphtheriae 180

6.2.2. Определение размера делеции 184

6.2.3. Способность продуцировать амилазу - дополнительный фактор патогенности С. diphtheriae 190

Глава VII. Выбор фрагмента нуклеотидной последовательности в атугеяе для определения в ПЦР принадлежности С. diphtheriae к биовару 196

Введение к работе

Актуальность проблемы

Коклюш и дифтерия являются воздушно-капельными инфекциями, управляемыми средствами специфической вакцинопрофилактики. Массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной против коклюша и дифтерии, осуществляемая в России с 1959 года, позволила достигнуть значительных успехов в борьбе с этими заболеваниями и коренным образом изменила характер течения эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций (Герасимова А.Г. и др., 2004; Лыткина И.Н. и др., 2004; Максимова Н.М. и др., 2002, 2003, 2008; Маркина С.С. и др., 2002, 2005, 2006; Петрова М.С. и др., 2000; Селезнева Т.С. и др., 2002, 2004; Чистякова Г.Г. и др., 2001, 2005).

Несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения, коклюш и дифтерия по-прежнему остаются актуальными инфекциями, как для детского, так и для взрослого населения. До настоящего времени сохраняются основные эпидемиологические особенности поддержания эпидпроцессов этих инфекций.

Однако, в настоящее время в г. Москве на фоне высокого охвата профилактическими прививками (до 95,0%) отмечается относительная стабилизация заболеваемости коклюшем (показатель заболеваемости на 100000 населения (ПЗ) 2006 г. – 13,28; 2007 г. – 12,87), регистрируется заболеваемость среди привитых детей, наметились изменения в возрастной структуре заболеваемости (увеличилась доля детей школьного возраста при сохраняющейся высокой заболеваемости детей раннего возраста) и тяжесть клинического течения коклюша (регистрируются тяжелые формы не только среди детей раннего возраста, но и у детей школьного возраста) (Лыткина И.Н. и др., 2004; Чистякова Г.Г. и др., 2005). Аналогичные тенденции развития эпидпроцесса коклюшной инфекции отмечаются в России (Герасимова А.Г. и др., 2004; Селезнева Т.С. и др., 2002). При дифтерии в настоящее время в России отмечается заболеваемость на спорадическом уровне (ПЗ – 0,48 – 0,35 в 2005 – 2007 гг.), однако, продолжают регистрировать тяжелые формы заболевания, летальные исходы, заболеваемость среди привитых лиц, а также бактерионосительство, которое имеет место на фоне высокого уровня антитоксического иммунитета (Максимова Н.М. и др., 2002, 2003; Маркина С.С. и др., 2002, 2005, 2006). Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции и сохранении возбудителей коклюша и дифтерии в окружающей среде, а значит, существует риск возникновения заболеваний, особенно среди неиммунных и/или лиц с ослабленным иммунитетом.

Таким образом, в настоящее время сохранились все условия для поддержания эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций, что определяет необходимость борьбы с ними на современном этапе и невозможность иррадикации возбудителей дифтерии и коклюша как биологических видов с помощью существующих средств вакцинопрофилактики (Мазурова И.К., 1993, 2002, 2006, 2008).

Одной из причин поддержания эпидпроцессов является изменчивость возбудителей, лежащая в основе их адаптации в меняющихся условиях существования. В последнее десятилетие появилось значительное число работ отечественных и зарубежных исследователей, рассматривающих природные и антропогенные факторы, в том числе иммунизацию, как мощный селективный фактор отбора (Борисова И.Э. и др., 2008; Селезнева Т.С., 2002; Семенов Б.Ф. и др., 2002, 2003; Cassiday P. et all, 2000; de Melker H.E. et all, 2000; Gandon S. et all, 2003, 2007; Packard E.R. et all, 2004; Preston A. et all, 2005).

Поэтому, в сложившихся условиях необходимо проводить постоянный мониторинг циркулирующих штаммов возбудителей коклюша и дифтерии с использованием молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих выявлять самые незначительные изменения в геномах, в первую очередь, в генах, ответственных за проявление патогенных свойств микробов. Эти мутации могут привести к достаточно серьезным изменениям фенотипа и появлению новых клонов возбудителя, что, в свою очередь, может оказать влияние на течение эпидемических и инфекционных процессов и требует разработки новых технологий диагностики и наблюдения за возбудителями, как дифтерии, так и коклюша.

Цель исследования: выявление молекулярно-генетических особенностей структуры основных генов патогенности B. pertussis и С. diphtheriae, циркулирующих на современном этапе развития эпидемических процессов этих инфекций, и разработка принципиально новых подходов к совершенствованию лабораторной диагностики и средств вакцинопрофилактики коклюша и дифтерии.

Задачи исследования

Выявить особенности структуры пяти основных генов патогенности: ptxА гена, кодирующего энзиматически активную S1 субъединицу коклюшного токсина, prn гена, кодирующего пертактин, fim2 и fim3 генов, кодирующих фимбриальные белки, и tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в период 1948 – 2007 гг.

Изучить генетическую структуру штаммов B. pertussis, используемых для приготовления коклюшного компонента АКДС-вакцины, и провести сравнительный анализ с генетической структурой штаммов B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе. Оценить вирулентные свойства штаммов B. pertussis, несущих новые аллельные вариации основных генов патогенности.

Разработать ускоренный метод мониторинга, основанный на технологии ПЦР-ПДРФ, для выявления распространенных в настоящее время штаммов B. pertussis с измененной структурой гена коклюшного токсина.

Изучить структуру гена дифтерийного токсина (tox) и провести наблюдение за распространением штаммов С. diphtheriae, имеющих изменения в его структуре.

Систематизировать коллекцию штаммов B. pertussis, выделенных за период 1948 – 1994 гг., и пополнить коллекцию штаммов B. pertussis и С. diphtheriae штаммами современного периода эпидпроцессов.

Научная новизна

Получены новые данные о несоответствии структуры основных генов патогенности, ответственных за коклюшный токсин, пертактин, фимбриальные белки, штаммов B. pertussis, которые используют в нашей стране для производства АКДС-вакцины, и штаммов B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем в настоящее время, что является обоснованием совершенствования средств вакцинопрофилактики при коклюше.

Показано, что сохраняется циркуляция штаммов C. diphtheriae (в 60,0% случаев) с незначительными множественными единичными мутациями в tox гене, которые не сказываются на первичной структуре белка дифтерийного токсина, что формирует генетическую вариабельность вида. В последние годы не произошло распространения штаммов C. diphtheriae с измененной структурой tox гена (в положении 1252), приводящей к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина.

Выявлено, что в геноме штаммов C. diphtheriae биовара gravis имеется нуклеотидная последовательность (amy ген), являющаяся генетической детерминантой, кодирующей амилазную активность, в то время как штаммы С. diphtheriae биовара mitis имеют делецию этого фрагмента генома.

Впервые разработан новый метод мониторинга штаммов B. pertussis на основе молекулярно-генетического изучения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ) и получен патент на изобретение № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г.

Впервые разработан прямой ускоренный, высокочувствительный, специфичный и эффективный метод лабораторной диагностики коклюша – LAMP-вариант; получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (52390).

Впервые разработан молекулярно-генетический способ дифференцирования штаммов C. diphtheriae по принадлежности к биовару; получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке № 2007140879/13(044745).

Теоретическая значимость

Пополнена уникальная коллекция штаммов B. pertussis и С. diphtheriaе, позволяющая проводить многоплановые исследования возбудителей коклюша и дифтерии с целью создания новых препаратов и биотехнологий, направленных на совершенствование лабораторной диагностики и средств иммунопрофилактики при этих инфекциях.

Подобраны штаммы B. pertussis, вызывающие заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса, с новой генетической структурой основных факторов патогенности, как кандидаты для конструирования перспективных вакцинных препаратов.

Новый метод мониторинга штаммов B. pertussis на основе ПЦР-ПДРФ позволяет определять штаммы с измененной структурой ptxА гена коклюшного токсина для наблюдения за циркулирующей на современном этапе развития эпидпроцесса коклюшной инфекции популяцией B. pertussis.