Болезнь лепра в инвитро

Лепра – это хроническое инфекционное заболевание, которое вызывают бациллы Mycobacterium leprae и Mycobacterium lepromatosis. Оно поражает кожу, слизистые оболочки верхних дыхательных путей и глаз, а также нервную систему. Эта болезнь также известна как проказа, болезнь Хансена, скорбная болезнь, ленивая смерть, болезнь Святого Лазаря, lepra arabum, lepra orientalis, satyriasis. Это одно из древнейших заболеваний, оно известно примерно с XV-Xвеков до нашей эры.

У лепры огромный инкубационный период – от 4 до 6 лет. Однако иногда болезнь может проявиться спустя 2-3 месяца после заражения, а иногда от момента заражения до появления первых симптомов проходит до 50 лет.

Для продромального периода (стадии болезни, которая предшествует ее основным проявлениям) характерны слабость, боли в суставах, расстройства желудочно-кишечного тракта, нарушения потоотделения, отеки кистей и стоп. Иногда бывает лихорадка. В это время на слизистой оболочке перегородки носа можно обнаружить возбудителя заболевания. Через некоторое время появляются основные симптомы заболевания.

Выделяют три типа течения заболевания:

лепроматозный;
туберкулоидный;
недифференцированный (пограничный).

В течение каждого из них выделяют четыре стадии:

прогрессирующую;
стационарную;
регрессивную;
остаточных явлений.

При лепроматозном типе лепры заболевание начинается с того, что на коже появляются лепромы – бугорки и узлы коричневатого или красно-лилового цвета размером от спичечной головки до горошины. Они могут быть шаровидной или уплощенной формы. Поверхность этих бугорков гладкая, блестящая, как будто покрытая жиром. Они могут сливаться в инфильтраты довольно больших размеров.

Также на коже появляются малозаметные пятна фиолетового или вишневого оттенка с нерезко очерченными краями. В начале заболевания чувствительность кожи в области этих пятен не нарушена. Со временем края пятен уплотняются.

Через некоторое время на лепромах появляются язвы. У этих язв плотные, часто приподнятые и валикообразные края, сукровичное отделяемое, в котором можно обнаружить большое количество Mycobacterium leprae. Постепенно язвы рубцуются. Изъязвляться могут также мышцы и кости. При этом мелкие кости и суставы разрушаются, деформируются и через некоторое время отпадают. Чаще всего этот процесс затрагивает слизистую оболочку носа в области хрящевой перегородки. В результате меняется форма носа – его кончик приподнимается. При этом развивается хронический лепрозный ринит, основные симптомы его – слизистое отделяемое из носа и образование корок на слизистой оболочке.

Лепромы и пятна могут образоваться и во рту – на языке, на мягком и твердом нёбе. Дальше заболевание может распространиться на гортань и голосовые связки, при этом изменяется голос – появляется охриплость.

Часто при лепроматозном типе лепры развиваются и поражения глаз – конъюнктивит, эписклерит, ирит, кератит. Из-за помутнения и изъязвления роговицы зрение ухудшается. В некоторых случаях возможна даже его потеря.

Лимфатические узлы при этом заболевании увеличены, однако безболезненны.

При этом типе лепры поражается и нервная система. Причем поражения могут быть разнообразными. Это могут быть психозы, неврозы, невриты и полиневриты. В результате поражения нервной системы нарушается чувствительность кожи, возможны двигательные расстройства.

Это самый злокачественный и самый заразный тип заболевания.

Туберкулоидный тип лепры протекает менее злокачественно. При этом поражаются только кожные покровы и периферическая нервная система. В этом случае на коже появляются яркие, резко очерченные пятна. Они либо витилигообразные, либо красноватые. Также на коже появляются и узелки – лепромы. Они красно-бурого или красно-фиолетового цвета, часто образуют круги, в центре которых понижены болевая, температурная, а иногда и тактильная чувствительность и потоотделение. Нарушение чувствительности наблюдается и в пятнах, это их характерное отличие от витилиго. На пораженных участках кожи также выпадают волосы.

При неидентифицированном типе лепры на коже также появляются пятна, в области которых нарушена чувствительность. Границы их нерезкие. Возбудителя заболевания при этой форме лепры выявить сложно. Раньше эту форму называли пятнисто-анестетической. Страдающие этой формой лепры малозаразны и, как правило, чувствуют себя неплохо.

В некоторых случаях неидентифицированный тип лепры может перейти в лепроматозный или туберкулоидный. Какой именно тип лепры будет развиваться у конкретного человека, зависит от его генетических особенностей.

Первое письменное упоминание о лепре датируется 600 годом до нашей эры. Однако ее возбудителя смогли определить только в 1873 году. Сделал это норвежский врач Герхард Хансен. Именно он выделил Mycobacterium Leprae hominis. Эта бацилла представляет собой палочку со слегка заостренными концами, по своим признакам она похожа на микобактерию туберкулеза. Бактерии неподвижны, располагаются обычно группами. Каждая бактерия окружена плотной липидной капсулой, она не продуцирует эндотоксинов и почти не вызывает воспалительной реакции. Передается инфекция воздушно-капельным и контактным путями, то есть, через капли слюны или отделяемого из носа, или при тесном постоянном контакте со страдающим проказой.

В древности лепра свирепствовала в основном на востоке. Считается, что в Европу лепру принесли из Передней Азии крестоносцы. Именно тогда, в начале XIII века, началась эпидемия в Европе. В результате на территориях монастырей организовали лепрозории, в которых содержали заболевших лепрой. Страдающие этим заболеванием были обязаны там жить с момента обнаружения болезни и до конца жизни. В XIII веке по всей Европе насчитывалось около 19 тыс лепрозориев. При этом для семьи пациенты лепрозория считались умершими, им даже устраивали погребальную церемонию – клали в гроб, служили заупокойную службу, опускали гроб в могилу. Потом гроб доставали, и страдающего отправляли в лепрозорий. Эти учреждения также способствовали профилактике и других болезней. А до образования лепрозориев страдающие лепрой ходили в закрытых одеждах и с колокольчиками, чтобы предупредить остальных, что к ним опасно приближаться.

Проказа до сих распространена в странах Африки и Азии. В основном высока вероятность заразиться ей в некоторых районах Бразилии, Индонезии, Филиппин, Республике Конго, Индии, Мадагаскара, Непала и Танзании. В России эндемические очаги лепры есть в Нижнем Поволжье, Дальнем Востоке, Прибалтике, Северном Кавказе, Каракалпакии. Сейчас в России около 700 прокаженных. Также есть вероятность заразиться лепрой и в Казахстане. По данным ВОЗ, на начало 2012 года в мире зарегистрировано около 182 тыс страдающих болезнью Хансена. В 1985 году в 122 странах мира проказа была признана серьезной проблемой общественного здравоохранения. На сегодняшний день в 119 из них она ликвидирована.

В основном это заболевание характерно для социально неблагополучных слоев населения. Факторами риска инфицирования и развития проказы могут стать:

недостаточное питание;
алкоголизм;
простуда;
тяжелые физические нагрузки.

Эти же факторы могут способствовать трансформации лепры неидентифицированного типа в лепру туберкулоидного или лепроматозного типа.

Переносчиками заболевания могут быть и животные – броненосцы (млекопитающие, обитающие в Южной и Центральной Америке и имеющие панцирь из подвижно связанных роговых щитков), и, возможно, низшие приматы. Однако люди заражаются от них чрезвычайно редко.

Дети заражаются проказой гораздо легче, чем взрослые. Однако дети до года болеют ей очень редко. Чаще всего заражаются дети до 10 лет.

При попадании возбудителей лепры в организм заболевание развивается только у 10-20 %. Однако у половины из них симптомы неясные. А вот у другой половины заболевших формируется развернутая картина заболевания. Остальные же болезнью Хансена не заболевают.

Для постановки правильного диагноза потребуется осмотр дерматовенеролога. Врач должен тщательно опросить пациента, выяснить, не был ли тот в эндемичных зонах, не контактировал ли со страдающими лепрой. Также нужно сдать анализы:

общий анализ крови;
биохимический анализ крови;
общий анализ мочи;
анализ крови на сифилис;
гистологическое исследование препарата кожи;
бактериологическое исследование соскоба со слизистой оболочки носа.

Также необходимы следующие исследования:

Заболевание дифференцируют с туберкулезом кожи, третичным сифилисом, лейшманиозом, витилиго, плоским лишаем.

Кроме того, делают лепроминовую пробу. Лепромин – это суспензия убитых микобактерий лепры, полученная из пораженных тканей человека или броненосца. Если ввести его подкожно, то через 48 часов проявится туберкулиноподобная реакция – покраснение или папула (реакция Фернандеса), а через 3-4 недели – бугорок или узел, который через некоторое время некротизирует и рубцуется (реакция Мицуды).

При ранней диагностике и своевременном и правильном лечении сейчас возможно вылечить проказу без последствий. Однако если болезнь диагностирована слишком поздно, возможны потеря зрения, контрактуры пальцев рук, нарушения чувствительности кожи.

Сегодня в России осталось всего 4 лепрозория:

Научно-исследовательский институт по изучению лепры Федерального агентства по здравоохранению (Астрахань);
Сергиево-Посадский филиал Государственного научного центра дерматовенерологии Федерального агентства по здравоохранению (Московская область, Сергиево-Посадский район, Березняковское сельское поселение, поселок Зеленая Дубрава);
ФГУЗ Терский лепрозорий (Ставропольский край, Георгиевский район, поселок Терский);
ГУЗ Лепрозорий департамента здравоохранения Краснодарского края (Краснодарский край, Абинский район, поселок Синегорск).

Поздно начатое лечение приводит к инвалидизации пациента.

Основное значение в профилактике лепры имеет индивидуальная гигиена. Нужно стараться избегать контактов с заболевшими. Если вы оказались в районе эндемического очага, не старайтесь без нужды сближаться с местным населением.

Если один член семьи заболел лепрой, остальные ставятся на диспансерный учет и обследуются не реже одного раза в год. Кроме того, члены семи страдающего проказой обязательно должны пройти курс превентивного лечения. Он может занять от 6 месяцев до трех лет.

Работающим со страдающими проказой нужно соблюдать осторожность, все анализы брать только в перчатках, обязательно пользоваться защитной марлевой повязкой.

Очень важно выявлять это заболевание на ранних стадиях, обследовать людей в эпидемически неблагополучных районах, а также превентивно лечить тесно контактировавших с заболевшими.

Для всех, кто не успел присоединиться ранее - ещё есть уникальный шанс стать ПОТЕНЦИАЛЬНЫМИ ДОНОРАМИ и вступить в Национальный регистр доноров костного мозга имени Васи Перевощикова. Регистр назван именем мальчика, который заболел лейкозом, но Вася так и не дождался своего донора.

Акция "Я-ДОНОР!" реализуется в рамках социального проекта "Зарядись добром" при финансовой поддержке Администрации Томской области.

ОТВЕТЫ НА АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ О ДОНОРСТВЕ КОСТНОГО МОЗГА.

ЧТО ТАКОЕ РЕГИСТР ДОНОРОВ КОСТНОГО МОЗГА?
Это единая система хранения обезличенных генетических данных – фенотипов в виде кода.

ЗАЧЕМ НУЖЕН НАЦИОНАЛЬНЫЙ РЕГИСТР ДОНОРОВ КОСТНОГО МОЗГА В РОССИИ?
Шанс найти совместимого донора для больного выше среди людей сходного с ним этнического происхождения, проживающего на одной территории. Найти донора в зарубежных регистрах стоит 1,4 млн рублей, а в российском - 400 т.р. (оплачивают благотворительные фонды). В Национальном регистре доноров костного мозга США ― 10 миллионов потенциальных доноров, в Германии ― 6 миллионов. В Российском регистре всего 97 тысяч потенциальных доноров. По разным оценкам, нам нужно хотя бы 500 тысяч добровольцев в Российском регистре. Тогда каждому второму больному гражданину РФ, которому показана трансплантация, найдется донор здесь, в России.

ПРИ КАКИХ УСЛОВИЯХ Я НЕ МОГУ СТАТЬ ДОНОРОМ КОСТНОГО МОЗГА?
- Возраст ДО 18 лет или ПОСЛЕ 45
- Вес ДО 50 кг
- Наличие следующих заболеваний: злокачественные новообразования, заболевания крови, органические заболевания центральной нервной системы, полное отсутствие слуха и речи, психические заболевания, наркомания/ алкоголизм, диффузные заболевания соединительной ткани, лучевая болезнь, болезни эндокринной системы, оперативные вмешательства, СПИД, носительство ВИЧ-инфекции, сифилис, любой гепатит в истории болезни, туберкулез, бруцеллез, сыпной тиф, туляремия, лепра. Если у вас есть заболевание, а в этом списке его нет, но вы сомневаетесь - впишите его в анкету перед сдачей крови.

ЕСЛИ МНЕ УДАЛЯЛИ АППЕНДИЦИТ, ДЕЛАЛИ КЕСАРЕВО СЕЧЕНИЕ МОГУ Я СТАТЬ ПОТЕНЦИАЛЬНЫМ ДОНОРОМ?
Да, можете.

НУЖНО СПЕЦИАЛЬНО ГОТОВИТЬСЯ К СДАЧЕ КРОВИ?
Готовиться специально не нужно, кровь сдается НЕ натощак, лучше всего за сутки не употреблять алкоголь, и не сдавать при наличии повышенной температуры тела.

ЧЕМ ЭТО ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ СДАЧИ КРОВИ ДЛЯ ПЕРЕЛИВАНИЯ?
Сдается 4-9 мл крови, кровь отправляется на анализ - HLA-типирование, в результате которого определяется фенотип человека - генетический код. После чего данные заносятся в защищенную базу - регистр. Возможно через какое-то время вам позвонят и пригласят стать донором костного мозга.При сдаче крови для переливания - кровь сдается в размере 450 мл, затем отправляется на хранение или переливание пациенту с которым кровь совпадает по резус-фактору.

ЧТО ТАКОЕ КОСТНЫЙ МОЗГ И ГДЕ ОН НАХОДИТСЯ В ОРГАНИЗМЕ?
Костный мозг — это орган кровеносной системы, отвечающий в организме за кроветворение и выработку иммунных клеток, находится в плоских костях нашего организма, внешне похож на кровь.

ЕСЛИ МЕНЯ ПРИГЛАСИЛИ СТАТЬ ДОНОРОМ, КАК БЕРУТ КОСТНЫЙ МОЗГ ДЛЯ ПЕРЕСАДКИ?
Есть два способы забора клеток костного мозга – под общим наркозом из тазовой кости с помощью небольшой иглы, так и из периферической вены (предварительно донору 4 дня вводят специальный препарат, стимулирующий выход кровеносных клеток в периферическую кровь, затем берут кровь из вены одной руки и возвращают в другую). Донор сам выбирает способ забора клеток.

СУЩЕСТВУЮТ ПОСЛЕДСТВИЯ ПОСЛЕ ПРОЦЕДУРЫ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ ДОНОРА?
После забора клеток донор находится на больничном от 5-9 дней. Возможны незначительные болезненные ощущения в месте прокола, возможны последствия, связанные с наркозом, либо слабость в теле как при ОРВИ. При этом стоит отметить, что серьезных последствий после процедуры у доноров врачи не отмечают. Клетки восстанавливаются 7-21 дней.

ЧТО ПРОИСХОДИТ ПОСЛЕ ПРОЦЕДУРЫ ЗАБОРА КЛЕТОК С ДОНОРОМ В ЮРИДИЧЕСКОМ ПЛАНЕ?
Жизнь донора застрахуют на один год, человек получит справку, подтверждающую факт донорства, и это позволит получать ежемесячный налоговый вычет в размере 500 руб. в течение жизни. Спустя 6 месяцев будет проведено лабораторное обследование.

ПОСЛЕ ВСТУПЛЕНИЯ В РЕГИСТР, КОГДА МНЕ ПОЗВОНЯТ И ПОПРОСЯТ СТАТЬ ДОНОРОМ?
Никто не может предугадать нуждается ли ваш "генетический близнец" в пересадке костного мозга. Возможно вам позвонят через 2 месяца, годы или никогда.

ДЛЯ ПЕРЕСАДКИ НУЖНО ЛИ ДОНОРУ ЕХАТЬ КУДА-ТО ИЛИ ЕЕ МОЖНО СДЕЛАТЬ В ТОМСКЕ?
Для того, чтобы стать донором костного мозга необходимо приехать в клиники г.Москвы или СанктПетербурга. Пока в России делают пересадки только там. Все расходы, связанные с перелетом, проживанием и пр. для донора берут на себя благотворительные фонды.

Фермент, который в норме участвует в регуляции артериального давления, синтезируется в повышенных количествах эпителиоидными клетками гранулемы при саркоидозе и является показателем активности заболевания.

АПФ, дипептидилкарбоксипептидаза,киназа II.

Serum Angiotensin Converting Enzyme, SACE, ACE, Kinase II, Dipeptidyl Carboxypeptidase, Peptidylpeptide Hydrolase.

Спектрофотометрический метод с пептидным субстратом.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исключить из рациона жирную пищу за 24 часа до исследования.
Не есть в течение 12 часов до исследования.
Исключить прием ингибиторов ренина за 7 дней до исследования.
Избегать физического и эмоционального перенапряжения в течение 24 часов до исследования.
Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ) в норме вырабатывается в эпителиальных клетках легких и выявляется в небольших количествах в кровеносных сосудах и почках. Он способствует преобразованию ангиотензина I в мощный вазоконстриктор ангиотензин II, который сужает сосуды, что вызывает повышение артериального давления.

При саркоидозе уровень АПФ в крови значительно повышается и коррелирует с активностью патологического процесса. Считается, что при этом АПФ вырабатывается в увеличенном количестве эпителиоидными клетками узелковых воспалительных образований – гранулем.

Саркоидоз – системное заболевание неизвестной этиологии, характерной особенностью которого является образование неказеифицирующих гранулем в различных органах и тканях. Преимущественно поражаются лимфатические узлы, легкие, печень, кожа, глаза. Заболевание наблюдается чаще в возрасте 20-40 лет и нередко протекает бессимптомно, обнаруживаясь при профилактическом рентгенологическом обследовании легких.

Клиническая картина саркоидоза зависит от длительности процесса, локализации и распространенности поражения, активности гранулематозного процесса. Симптомы чаще неспецифичны: лихорадка, недомогание, потеря массы тела, увеличение лимфатических узлов, боли в суставах. При поражении легких возникает одышка, сухой кашель, боли в груди. На коже возможны узловые и диффузно-инфильтративные изменения. При поражении глаз – увеите – наблюдается покраснение и ощущение жжения в глазах, светочувствительность. Учитывая возможное полиорганное поражение при саркоидозе и сходство клинической картины со многими заболеваниями различной этиологии (туберкулезом, новообразованиями, бактериальными и некоторыми грибковыми инфекциями, пневмокониозами, системными аутоиммунными заболеваниями), очень важна правильная дифференциальная диагностика в постановке точного диагноза.

Аномальная секреция АПФ приводит к повышению его концентрации не только в крови, но и спинномозговой жидкости и бронхоальвеолярном лаваже. Диагностическое значение имеет рост уровня АПФ сыворотки крови более чем на 60 %. Этот параметр может коррелировать с общим количеством гранулем в организме больного. Специфичность данного теста составляет более 90 %, чувствительность - 55-60 %. В активную фазу саркоидоза уровень АПФ может увеличиться более чем в два раза. АПФ сохраняется на нормальном уровне при других заболеваниях с поражениями легких (туберкулез, лимфогранулематоз). При динамическом наблюдении снижение уровня АПФ на фоне лечения указывает на эффективность терапии и является хорошим прогностическим признаком.

Для чего используется исследование?

Диагностика саркоидоза;
дифференциальная диагностика заболеваний, клинически схожих с саркоидозом;
оценка активности заболевания;
мониторинг течения саркоидоза;
оценка эффективности лечения саркоидоза.

Когда назначается исследование?

При наличии клинических признаков вероятного саркоидоза у пациентов в возрасте 20-40 лет: гранулемы в органах и тканях, хронический сухой кашель, покраснение глаз, боли в суставах, лихорадка, потеря массы тела, увеличение лимфоузлов;
при выявлении изменений в структуре легких, схожих с саркоидозом, во время рентгенологического исследования;
при мониторинге течения заболевания;
при лечении саркоидоза.

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть использовано для диагностики лепры. Сущность изобретения состоит в том, что при обнаружении в слюне антител к М. leprae класса IgA иммуноферментным анализом в слюне дополнительно определяют антитела к М. leprae классов IgG и IgM с помощью антигенов М. lufu и по показателю оптической плотности уровня антител 0,40 и более диагностируют лепру. Техническим результатом является повышение точности диагностики лепры. 7 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии? и может быть, в частности, использовано для диагностики лепры.

Из практики медицины известен способ диагностики лепры, заключающийся в обнаружении в крови антител к возбудителю лепры с помощью иммуноферментного анализа, использующего в качестве антигена M.lufu, культивируемые in vitro. (патент N 2124730, 1999 г. Способ диагностики лепры. Юшин М.Ю., Дячина М.Н., Дегтярев О.В., Калянина О.В.).

Недостатками известного способа является то, что способ инвазивен, для его осуществления требуется взятие крови у обследуемых с использованием инструментария, что несет потенциальную опасность инфекционного заражения и не позволяет получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Известен способ диагностики лепры в полевых условиях, состоящий в обнаружении специфического антигена M. leprae - фенольного гликолипида-1 (ФГЛ-1) в моче обследуемых в реакции Dot ELISA на нитроцеллюлозной мембране (R. R. J. Kaldany, A. Nurlign. Development of a dot-ELISA for detection of leprosy antigen uria under field conditions. Leprosy Rev., 1986, v 57, Suppl. 2. p. 95-100). Недостатками известного способа являются: низкая диагностическая чувствительность (способом возможно обнаружение антигена только у больных с высокой бактериальной нагрузкой; через 2 месяца лечения антигены M.leprae перестают обнаруживаться данным способом в моче у больных), труднодоступность реагентов для проведения анализа (моноклональные антитела к ФГЛ-1), возможность получения только качественных (да/нет), а не количественных результатов анализа, многоэтапность и сложность подготовки пробы для исследования (концентрирование мочи в 10 раз, лиофилизация, растворение лиофилизата мочи до 1/100 начального объема, экстракция ФГЛ-1 смесью хлороформ-метанол, центрифугирование, лиофилизация, ультразвуковая дезинтеграция). Известный способ не позволяет получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Наиболее близким к заявляемому является способ диагностики лепры, основанный на иммуноферментном определении в слюне нелеченных больных лепрой антител класса IgA к специфическому антигену M.leprae - ФГЛ-1 (M.Abe., J.Miyaji, T Okushita, F. Minagawa, Y. Yoshina, Y. Sakamoto, K. Saikawa. Anti-mycobacterial antibodies in saliva. Leprosy Rev. 1986, Sup. 2. p. 213-223).

Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что оба они относятся к диагностике лепры, объектом исследования является слюна человека, а исследование проводится с помощью иммуноферментного анализа.

Однако известный способ имеет следующие недостатки: - недостаточная точность способа, обусловленная использованием в качестве антигена ФГЛ-1 - компонента M. leprae, обладающего узкой видовой специфичностью, и конъюгата меченных пероксидазой антител к IgA человека, не выявляющих специфические антитела других классов иммуноглобулинов; - труднодоступность ФГЛ-1 в качестве антигена.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение точности диагностики лепры. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением положительного результата. Решение поставленной задачи заключается в том, что при обнаружении в слюне антител к M.leprae класса IgA в иммуноферментном анализе предлагается совокупность отличительных от прототипа признаков, т.е. дополнительно определяют антитела к M.leprae классов IgG и IgM с помощью антигенов M.lufu и по показателям оптической плотности уровня антител 0,40 и более диагностируют лепру.

Предлагаемым способом достигается повышение точности диагностики лепры, т. е. повышение чувствительности способа, возможность прогнозирования активации болезни у больных с регрессом и контроля за эффективностью противолепрозного лечения, а также снижение трудоемкости способа.

Проблема диагностики лепры остается одной из наиболее актуальных в современной лепрологии. Иммунодиагностика лепры основана на определении в биологических средах человека антигенов и/или антител к M.leprae. Необходимость эпидемиологических обследований среди контактных лиц, а также больших групп населения регионов распространения лепры требует разработки технически простых, достаточно информативных и максимально неинвазивных способов диагностики. Одним из подходов для разработки таких методов диагностики является использование слюны в качестве объекта для исследования. Известно, что в слюне человека можно обнаружить многие метаболиты сыворотки крови, в том числе и различные классы иммуноглобулинов (антител) к возбудителям инфекционных заболеваний. Обнаружение антител к M.leprae в слюне можно использовать для диагностики инфицирования, а изучение динамики их уровня в процессе лечения - для оценки эффективности специфического лечения. При выявлении антител к M.leprae в слюне необходимо исследование "параллельных" проб сывороток крови и слюны для максимально возможных совпадений результатов в обеих биологических средах, так как в слюну антитела попадают главным образом из сыворотки крови.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Слюну от каждого исследуемого пациента в количестве 2-3 мл. собирали в стеклянные флаконы и хранили до использования при -20 o C. В день постановки иммуноферментного анализа флаконы размораживали, центрифугировали 15 мин при +4 o C со скоростью 3000 об./мин, надосадочную жидкость использовали в цельном виде без разведения.

M. lufu культивировали на среде Левенштейна-Иенсена в течение 7 дней, затем смывали со среды 0,85% раствором NaCl (из расчета: 500 мг бакмассы - 10 мл раствора NaCl). Бактериальную суспензию подвергали ультразвуковому разрушению на аппарате MSE-100 (Англия) (7-10 мин дробно при 18 кГц). Разрушенную суспензию центрифугировали 30 мин при 10000 об./мин. Супернатант использовали в качестве антигена для сенсибилизации планшетов.

Постановку ИФА осуществляли на поскодонных полистироловых планшетах для иммунологических реакций (Ленмедполимер ТУ 64-2-278-79). Антиген M.lufu разводили в 10 мл карбонат-бикарбонатного буфера pH 9,6 (Na₂CO₃ 1,59 г, NaHCO₃ 2,93 г H₂O 1 л) до конечной концентрации белка 5 мкг/мл и заливали в лунки планшета по 100 мкл. Планшет инкубировали 18 часов при +4 o C. Затем планшет трижды отмывали забуференными физраствором (34 г NaCl на 4 л H₂O, доводили pH до 7,4 2М Na₂PO₄ + 0,05% Твин-20) и заливали в каждую лунку по 100 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (0,584 г NaCl, 12,8 г Na₂HPO₄, 2,62 г NaHPO₄, pH 7,2-7,4) и инкубировали 1 час при +37 o C. Затем планшет вновь отмывали вышеуказанным способом.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в клинике и амбулатории НИИ по изучению лепры на 116 больных лепрой в течение 1998-1999 г. В качестве здорового контроля (лица, не контактировавшие с больными лепрой) обследованы 23 рабочих одного из промышленных предприятий г. Астрахани, проходившие ежегодные профилактические медицинские осмотры. Ниже приводятся результаты апробации.

Сущность предлагаемого изобретения поясняется таблицей 1.

Из таблицы 1 видно, что проведенный корреляционный анализ результатов тестирования предлагаемым способом образцов сыворотки крови и слюны у больных лепрой показал высокую степень связи уровня антител в обеих биологических средах, что подтверждает возможность использования слюны в качестве биосреды, альтернативной сыворотке крови, для выявления антител к M.leprae.

Больная К. , 1932 г.р., история болезни N 2044. Больна лепрой с 1955 г. Диагноз: лепроматозный тип лепры (LLs). С 1968 г. выписана на амбулаторное лечение, но периодически поступает в клинику НИИ по изучению лепры по поводу осложнения лепрозного процесса - хронического специфического полиневрита, хронического остиомиелита костей стоп, трофических язв стоп. В декабре 1998 г. поступила в клинику с обострением полиневрита. В настоящее время у больной специфический процесс находится в состоянии регресса. Активных проявлений на коже нет, БИН=0, M.leprae в коже не обнаружены. При посещении амбулатории и в период пребывания в клинике было произведено исследование содержания антител к M.leprae в слюне. В примере 1 и в последующих примерах приведены также показатели ОП уровня антител к M.leprae в образцах сывороток крови у этих же больных, чтобы показать, что уровень антител к M.leprae в слюне коррелирует с таковым в сыворотке крови. Слюну больной К. собирали в стеклянные флаконы, центрифугировали 15 мин при 3000 об./мин, надосадочную жидкость использовали для ИФА в цельном виде. Планшет сенсибилизировали антигеном M. lufu, разведенным в 10 мл карбонат-бикарбонатного буфера (Na₂CO₃ 1,59 г, NaHCO₃ 2,93 г, Н₂О 1 л pH 9,6) до конечной концентрации белка 5 мкг/мл по 100 мкл в каждую лунку. Планшет инкубировали при +4 o C 18 часов. Затем планшет трижды отмывали забуференным физраствором (34 г NaCl на 4 л H₂О, доводили pH до 7,4 2М Na₂PO₄ + 0,05% Твин-20) и заливали в каждую лунку по 100 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (0,584 г, NaCl, 12,8 г Na₂HPO₄, 262 г NaHPO₄ pH 7,2-7,4) и инкубировали 1 час при +37 o C. Затем планшет вновь промывали вышеуказанным способом. Образцы слюны (цельные) заливали в 2 лунки планшета по 50 мкл в каждую лунку. В качестве положительного контроля (K+) использовали сывороточный пул от больных с активной лепрой, показатель оптической плотности (ОП) уровня антител которого в ИФА с антигеном M.lufu соответствовал 1,50 - 1,70. Планшет инкубировали 1 час при +37 o C. После инкубации планшет отмывали, как указано выше. Затем в лунки вносили по 100 мкл конъюгата (кроличьи антитела к общим иммуноглобулинам человека - IgG, IgA, IgM классов, меченные пероксидазой, производства ВЕКТОР-БЕСТ) в разведении 1:1000 и инкубировали 1 час при +37 o C. После отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл субстрата (4 мг ортофенилендиамина, 0,1 мл 3,3% H₂O₂, 10 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,5, 0,05М лимонная кислота + 0,05М однозамещенный фосфорнокислый натрий) и инкубировали 40-60 мин при +20 o C. Об окончании реакции судили по появлению желто-коричневого окрашивания в лунках положительного контроля (K+), после чего реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 50 мкл 2М H₂SO₄. Результаты реакции оценивали на фотометре "УНИПЛАН" при длине волны 490 нм и выражали в единицах оптической плотности (ОП). Положительными считали образцы, показатели ОП которых в 2 и более раз превышали показатели отрицательного контроля т.е. 0,40 и более. В данном случае уровень антител к M. leprae IgG, IgA и IgM классов у больной К. составил 0,40, т.е. был положительным.

Из приведенных в табл. 2 данных видно, что у больной К. лепрозный процесс в стадии регресса, но обострение полиневрита подтверждено серологически повышением уровней антител к M.leprae как в сыворотке крови (0,45), так и в слюне (0,40). Снижение уровня антител в процессе лечения также шло параллельно в сыворотке и слюне.

Больная Г. , 1939 г.р., история болезни N 3861. Поступила в клинику НИИ по изучению лепры 26.02.98 с диагнозом: лепроматозный тип лепры (LLp), лепрозный полиневрит прогрессирующего течения, хронический остиомиелит костей кистей. На коже - активные проявления лепрозного процесса: пятна, инфильтраты, лепромы. В скарификатах кожи M.leprae, БИН-7,86, 16,68, 4,14, 1,83+. Гистология кожи - инфильтрат лепроматозной структуры с наличием большого количества гомогенных M. leprae. Несмотря на проводимое противолепрозное лечение, инфекционный процесс имел прогрессирующее течение с частыми обострениями. Трижды проводилось определение уровня антител к M.leprae в сыворотке крови и в слюне, как описано в примере N 1.

В приведенном примере (см. табл. 3) у больной Г. клинически активная лепра, подтвержденная бактериоскопически и серологически. Высокий уровень антител к M.leprae в сыворотке крови коррелировал с высоким уровнем антител в слюне (0,82-1,00 -0,65). Показатели уровня антител в слюне больше 0,40.

Больной А., 1967 г.р., история болезни N 3859. Поступил в клинику НИИ по изучению лепры 08.08.94. Диагноз - лепроматозный тип лепры (LLs). Клинически на коже туловища, конечностей - инфильтраты, лепромы. Бактериоскопически в скарификатах кожи большое количество M.leprae. БИН-11,7-11,7-0,8-1,8+. Биопсия кожи - инфильтрат лепроматозного характера с большим количеством M.leprae. Серология - высокий уровень антител к антигенам M.leprae в сыворотке крови. С 1997 года лепрозный процесс стал постепенно регрессировать.

На коже - остаточные элементы лепрозных проявлений, БИН=0, в скарификатах кожи M.leprae не обнаружены. Серология - антитела к M.leprae не обнаружены. Биопсия - регрессирующий инфильтрат лепроматозной структуры без M.leprae. У больного трижды было произведено определение антител к M.leprae в крови и слюне по методике, описанной в примере N 1.

Как видно из примера (см. табл. 4), у больного А. третий год лепрозный процесс в стадии клинического и бактериоскопического регресса, что подтверждается результатами серологических анализов сыворотки крови и слюны: показатели ОП слюны ниже фоновых значений (0,02-0,15-0,06) т.е. Изобретение относится к области вакцинации и диагностики заболеваний К

Читайте также: