Аллергическая диагностика бруцеллеза у животных

Бруцеллез (Brucellosis) — инфекционная, хронически протекающая болезнь домашних, некоторые виды диких животных и человека, характеризующаяся поражением многих систем жизнеобеспечения, нарушением функций сосудистой, пищеварительной, мочеполовой систем и системы воспроизводства.

Изучая причины мальтийской лихорадки, английский врач Д. Брюс в 1886 – 1887 гг. установил, что виновником ее является специфический микрококк, названный им Micrococcus melitensis. Дальнейшие исследования показали, что источником возбудителя мальтийской лихорадки являются козы, пораженные инфекцией, а причиной заражения людей — потребление молока от таких коз. Несколько позже Micrococcus melitensis был выделен у овец.

В1897 г. датские ученые Банг и Стриболд установили, что массовые аборты у коров вызывает микроорганизм, названные B. abortus bovis. В 1914 г. Траум обнаружил очень сходный микроорганизм, названный Br. abortus suis, при массовых абортах у свиней.

Для диагностики бруцеллеза в 1897 г. Райтом была предложена серологическая реакция агглютинации, а в 1922 г. Берне разработал внутрикожную аллергическую пробу, облегчающую распознавание болезни.

Долгое время мальтийская лихорадка у людей и массовые аборты у домашних животных считались самостоятельными заболеваниями. В 1918 – 1920 гг. Ивенс, Мейер и Фезье, изучая биологические свойства возбудителя мальтийской лихорадки и массовых абортов у крупного рогатого скота, обнаружили их чрезвычайную близость. Эти исследования явились основанием объединить указанных возбудителей, в том числе и возбудителя массовых абортов у свиней, в одну родовую группу под наименованием Brucella (в честь Брюса), а вызываемые ими заболевания именовать бруцеллезом.

В России начало изучения бруцеллеза было положено работами Е. И. Марциновского (1911), но детальному изучению заболевание подверглось в различных местностях СССР лишь с 1935 г. Большой вклад в изучение бруцеллеза сельскохозяйственных животных внесли отечественные ученые: С. Н. Вышелесский, П. Ф. Здродовский, П. А. Вершилова, М. К. Юсковец, Е. С. Орлов, Р. А. Цион, А. П. Бессонов и др. Были всесторонне изучены биологические свойства возбудителя, усовершенствованы методы диагностики, показаны значение в борьбе с бруцеллезом вакцинальной профилактики и пути ее совершенствования.

Клинические признаки бруцеллеза у крупного рогатого скота

Длительность инкубационного периода 2 – 3 недели. Первым показателем развившегося инфекционного процесса служит появление в крови инфицированных животных агглютининов в постепенно нарастающих титрах.

У коров основным клиническим признаком бруцеллеза является аборт и реже рождение нежизнеспособного приплода. Коровы, заразившиеся до покрытия, в большинстве случаев приносят нормальный приплод. Аборт чаще всего происходит на 5 – 8-м месяце. За 1 – 2 дня до наступления аборта у коров отмечается припухание наружных половых органов, выделение из влагалища бесцветной или буроватой жидкости и набухание вымени. После аборта происходит задержка последа и развивается эндометрит, сопровождающийся обильными слизисто-гнойными или гнойно-фибринозными выделениями. При тяжело протекающем эндометрите повышается температура тела, снижаются удои, отмечается потеря веса, убыстряется СОЭ; умеренный лейкоцитоз. Эндометритам нередко сопутствуют серозные или серозно-катаральные маститы. В процессе могут вовлекаться яичники и фаллопиевы трубы, что приводит к нарушению полового цикла и временному или стойкому бесплодию.

У отдельных животных в связи с абортом или независимо от него можно наблюдать развитие серозных бурситов или серофибринозных артритов. Последние в большинстве случаев возникают в суставах передних конечностей — запястном, путовом, коленном, локтевом. У быков бруцеллез, хотя и редко, сопровождается развитием орхитов и эпидидимитов.

Лабораторная диагностика бруцеллеза основана на результатах бактериологического и серологического исследований. Бактериологическое исследование в основном применяют при первичной постановке диагноза на бруцеллез в ранее благополучных хозяйствах.

В лабораторию направляются пробы крови (сыворотки) для серологического исследования, абортивный плод с плодными оболочками, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей или желудок плода, кусочки печени, селезенки, пробы молока (последние порции). При убое животных берут паренхиматозные органы, лимфатические узлы, пораженные суставы, у самцов — семенники. Объектом исследования могут быть молочные продукты (брынза, сыр, масло), объекты внешней среды.

При массовых диагностических исследованиях ставят пробирочную РА, роз бенгал пробу (РА на стекле), РСК, РДСК, кольцевую реакцию с молоком (КР). Диагностикумы для этих исследований, а также бруцеллин ВИЭВ для аллергической диагностики готовятся на Щелковском биокомбинате.

По данным К. В. Шумилова до 1952 года борьба с бруцеллезом крупного рогатого скота в нашей стране сводилась к проведению диагностических исследований и удалению из стад больных животных, без применения противобруцеллезных вакцин. В связи с осложнением эпизоотической ситуации в 1953 году в систему противобруцеллезных мероприятий была включена иммунизация животных вакциной из штамма B. abortus 19.

Вакцину из штамма B. abortus 19 применяли до 1970 года. За 20 лет применения вакцины многие хозяйства, даже области, были оздоровлены от болезни. Однако в регионах с широким распространением бруцеллеза эффективность оздоровительных мероприятий оказалась низкой. В первую очередь, это было обусловлено высокой агглютиногенностью вакцины. Агглютинины и комплементсвязывающие антитела, вырабатывающиеся в ответ на введение вакцины, сохраняются в организме животных до 5 – 8 лет и затрудняют дифференциацию иммунизированных животных от больных бруцеллезом.

С 1971 по 1974 год вакцину из штамма B. abortus 19 использовали только на телках 5 – 8 месячного возраста. С 1974 года и по настоящее время в России в комплексе противобруцеллезных мероприятий применяются вакцины из штаммов B. abortus 82 и 19. Живая сухая вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма № 82 отличается от вакцины из штамма 19 слабым серологическим ответом с быстрым снижением уровня гуморальных антител, что позволяет при помощи серологических реакций дифференцировать вакцинированных животных.

За 30 лет работы с применением вакцины из штамма B. abortus 82 и смены пяти поколений коров к 2004 году (К. В. Шумилов) количество неблагополучных по бруцеллезу пунктов и заболевших животных значительно сократилось.

Сухая живая вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма B. abortus 75/79-АВ разработана сотрудниками ВГНКИ и Алтайской НИВС с использованием культуры штамма 75/79, выделенного от коровы, ранее иммунизированной вакциной из штамма B. abortus 82. После многократных пассажей выделенного штамма через организм морских свинок и телок и целенаправленной селекции на питательных средах, был получен новый вакцинный штамм 75/79-АВ. Вакцины не обладает абортогенными свойствами, что дает возможность проводить иммунизацию маточного поголовья независимо от сроков стельности. Вакцина является слабоагглютиногенной; агглютинины и комплементсвязывающие антитела регистрируются у привитых животных в течение трех месяцев после иммунизации, что делает возможным их исследование по истечении указанного срока. У животных, иммунизированных вакциной, выраженный иммунитет сохраняется в течение года, что позволяет за указанный срок оздоравливать неблагополучные хозяйства от бруцеллеза.

Штамм B. abortus КВ 17/100, находящийся в R-форме, получен путем целенаправленной селекции по культуральным, морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам из вакцинного штамма B. abortus 104М, находящегося в S-форме. Адъювант-вакцина не индуцирует синтез S-бруцеллезных антител в диагностических титрах у животных, не сенсибилизированных бруцеллами. Адъювант-вакцина индуцирует синтез S-бруцеллезных антител у крупного рогатого скота с латентной формой бруцеллеза, что позволяет за счет быстрого удаления из стад таких животных, ускорить оздоровление хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу.

Адъювант-вакцина не абортогенна и может быть использована для иммунизации маточного поголовья крупного рогатого скота независимо от сроков стельности.

от 11 июля 1968 года

ПО ПРИМЕНЕНИЮ БРУЦЕЛЛИНА ВИЭВ ДЛЯ АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

БРУЦЕЛЛЕЗА У МЕЛКОГО РОГАТОГО СКОТА И СВИНЕЙ

1. Бруцеллин - стерильный биологический препарат, представляет собой прозрачную, слегка опалесцирующую желтовато-коричневую жидкость, содержащую специфические вещества, извлеченные из бруцелл .

2. Бруцеллин расфасовывается во флаконы. При встряхивании и переворачивании флакона препарат не должен просачиваться через пробку. На каждом флаконе должна быть этикетка (или надпись) с обозначением наименования биопредприятия , изготовившего бруцеллин , наименования биопрепарата и его количества во флаконе, даты изготовления, срока годности, доз для применения, номера серии и контроля.

Бруцеллин во флаконах с нарушенной целостью, без этикетки, с наличием посторонних примесей (плесень, комочки, хлопья, муть и пр.), а также подвергавшийся замораживанию к применению непригоден. Бруцеллин должен быть использован в день вскрытия флакона.

3. Бруцеллин пригоден для применения в течение 18 месяцев со дня изготовления при условии хранения в темном, сухом помещении при температуре 2 - 16°.

4. Бруцеллин применяют для аллергической диагностики бруцеллеза у овец и коз методом пальпебральной пробы и у свиней методом внутрикожной пробы в соответствии с инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза сельскохозяйственных животных.

Исследовать животных на бруцеллез с применением бруцеллина разрешается только ветеринарным врачам или ветфельдшерам с законченным средним специальным образованием под наблюдением ветеринарного врача.

5. Бруцеллин вводят овцам и козам под кожу нижнего века левого глаза в дозе 0,5 мл ( пальпебральная проба). Голову животного прочно фиксируют, затем шприцем емкостью 5 мл, снабженным бегунком, через короткую тонкую иглу (N 0415-0813) бруцеллин вводят под кожу на 1 см ниже края века со стороны наружного угла глаза.

Животных с заболеванием глаз или с густым шерстным покровом в области век метят. Им вводят бруцеллин в одну из подхвостовых складок внутрикожно в дозе 0,2 мл.

Свиньям бруцеллин вводят внутрикожно в дозе 0,2 мл (через иглу для внутрикожного введения) с наружной стороны ушной раковины левого (или правого) уха, ближе к его основанию. На месте введения препарата образуется уплотненный бугорок размером с горошину.

При инъекции обязательно соблюдение правил асептики. Участок кожи перед уколом протирают ватой, смоченной в спирте или 3-процентном растворе борной кислоты. Иглы и шприцы перед началом работы стерилизуют кипячением. Для каждого животного используют стерильную иглу.

6. У животных, больных бруцеллезом, на месте введения бруцеллина появляется воспалительная реакция в виде плотной или тестоватой припухлости, обычно хорошо видимой при осмотре; у свиней, кроме того, могут появиться гиперемия, иногда кровоизлияние в виде темно-красного пятна в центре отека. У здоровых животных местная реакция не возникает.

7. Реакцию на введение бруцеллина у овец и коз учитывают один раз через 42 - 48 часов, у свиней - 2 раза через 24 и 48 часов путем осмотра, а при неясно выраженной реакции - пальпацией места инъекции.

При обнаружении на месте введения препарата припухлости реакцию оценивают как положительную.

В случае неясно выраженной реакции прощупывают место введения препарата и сравнивают с кожей века другого глаза (или подхвостовой складки), а у свиней - с кожей основания уха другой стороны. Если обнаруживают хотя бы небольшую разницу, реакцию считают положительной. При отсутствии указанных признаков реакции результат исследования считают отрицательным. Реагирующих на бруцеллин животных метят, выделяют из отары (стада) и изолируют.

8. При исследовании овец и коз в неблагополучных по бруцеллезу отарах (стадах) в целях более полного выявления больных животным, не реагировавшим на первое введение, при читке реакции бруцеллин вводят через 42 - 48 часов повторно в то же место и в той же дозе.

После второго введения бруцеллина реакцию учитывают через 24 часа, как указано в пункте 7 Наставления. При этом всех реагирующих овец и коз метят и изолируют.

9. Если при учете реакции на первое введение аллергена в отаре не будет выявлено реагирующих животных, повторно бруцеллин не вводят.

10. С животными, признанными при исследовании бруцеллином реагирующими положительно, поступают согласно инструкции по предупреждению и ликвидации бруцеллеза сельскохозяйственных животных.

11. После применения бруцеллина у животных можно в любые сроки брать кровь для исследования на бруцеллез серологическими методами (РА и РСК).

12. Результат исследования овец, коз и свиней бруцеллином записывают в акте, который сохраняют в хозяйстве; копию акта направляют главному ветеринарному врачу района.

Интернет архив законодательства СССР. Более 20000 нормативно-правовых актов.
СССР, Союз Советских Социалистических республик, Советская власть, законодательство СССР, Ленин, Сталин, Маленков, Хрущев, Брежнев, Андропов, Черненко, Горбачев, история СССР.

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

240 руб. | 75 грн. | 3,75 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Павлов Александр Александрович. Генная и серологическая диагностика бруцеллеза крупного рогатого скота : диссертация . кандидата биологических наук : 03.00.07.- Саратов, 2002.- 104 с.: ил. РГБ ОД, 61 03-3/472-0

Содержание к диссертации

Глава 1. Обзор литературы ч 11

1.1. Распространение бруцеллеза на территории РФ 11

1.2. Методы диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных

1.2.1. Серологическая диагностика бруцеллеза 15

1.2.2. Аллергическая диагностика бруцеллеза 29

1.3. Полимеразная цепная реакция 31

Глава 2. Материалы и методы 43

2.1. Материал для исследования 43

2.2. Выявление ДНК бруцелл методом ПНР 44

2.3. Серологические методы 49

2.4. Статистические методы исследования 51

Глава 3. Применение тест-системы "Ген-Бру" для молекулярно биологической диагностики бруцеллеза животных 52

3.1. Оценка эффективности ПЦР при обследовании иммунизированного крупного рогатого скота и больных бруцеллезом животных 52

3.2. Использование ПЦР в комплексе с серологическими реакциями (РА, РСК) 60

Глава 4. Оценка информативности ПЦР-анализа при исследовании различных образцов диагностического материала 65

4.1. Выбор диагностического материала от животных для детекции бруцелл методом ПЦР 65

4.2. Изучение диагностической чувствительности ПЦР при исследовании сыворотки крови и цельной крови у больных и иммунизированных против бруцеллеза животных 71

Список использованной литературы

Серологическая диагностика бруцеллеза

Инвертированная ПЦР позволяет амлифицировать не только ДНК с известной последовательностью, но и фланкирующие ее области. Участок ДНК гидролизуется рестриктазой, разрывая нуклеиновую кислоту в точках правее и левее известной последовательности. Образуемый фрагмент ДНК замыкается в кольцо с помощью ДНК-лигазы и подвергается ПЦР. Праймеры, используемые в реакции, направлены 3 -концами наружу по отношению к известной последовательности, благодаря чему амлифицируются и фланкирующие участки ДНК. Инвертированная ПЦР применяется для изучения сайтов интеграции провирусов, мобильных элементов промоторных областей генов известных белков и т.п. [Вартапетян А.Б., 1991].

В некоторых случаях, чтобы предотвратить ложноотрицательный результат вследствие мутации последовательности ДНК, выбранной в качестве мишени амплификации, применяют мультипраймерную или множественную ПЦР, заключающуюся в одновременном применении нескольких праймеров, гомологичных разным участкам генома тестируемого микроорганизма. Праймеры подбираются таким образом, чтобы условия их амплификации были одинаковыми. Используя множественную ПЦР с соответствующими праймерами можно одновременно детектировать несколько различных возбудителей инфекционных заболеваний.

Для эффективного обнаружения внутриклеточных паразитов (вирусов, микроорганизмов рода Chlamidia, Micoplasma, Brucella и др.) применяют ПЦР-Іп situ. Особенность этой модификации заключается в том, что амплификация ДНК проводится непосредственно в клетке (гистологическом срезе или клеточном монослое). Учет реакции проводится гибридизацией с меченным ДНК-зондом.

Чтобы уменьшить риск контаминации в настоящее время все чаще применяют праймеры, иммобилизированные на полимерную основу. В таком варианте амплификация ДНК проходит в твердой фазе [Chevrier D. et al., 1993; Rasmussen S. et al., 1994].

С помощью ПЦР возможна не только быстрая и точная детекция микроорганизма, но и определение его количества. Для этого применяют конкурирующую ПЦР и Taq-man ПЦР.

Конкурирующая ПЦР основана на одновременной амплификации ДНК-мишени и контрольной ДНК с известным количеством копий. После проведения реакции количество продукта ПЦР определяют двумя способами. Самый простой (но менее точный) - визуальное сравнение интенсивности сигналов амплифицированной ДНК-матрицы и копий контрольной ДНК. Более точное определение возможно титрованием продукта амплификации и установлением наименьшего разведения образца ДНК, дающего положительный результат в ПЦР. [Ferre F., 1992; Picard С. et al., 1992; Clementi M. et al., 1993; Mirold D.D., Huss-Vanell K., 1994; Cross N. C, 1995].

Принцип метода Taq-man ПЦР заключается в использовании олигонуклеотидного зонда, содержащего 2 флуоресцентные метки и гомологичного последовательности ДНК-матрицы [Kalinina О. et al., 1997; Zang R. et al., 1997]. При этом одна из меток способна поглощать излучение второй. В процессе реакции Taq-полимераза гидролизует олигонуклеотидный зонд в направлении 5 — 3 и наблюдается смещение максимума флуоресценции. Измерение интенсивности флуоресценции позволяет определить количество ДНК-мишени, соответствующее начальной стадии ПЦР.

Генетические методы диагностики инфекционных болезней, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, не ограничиваются , только ПЦР. Перспективными направлениями альтернативных методик I являются ЛЦР, ЦЗТ, NASBA-метод и др.

Выявление ДНК бруцелл методом ПНР

Материал для исследования от крупного рогатого скота: цитратная кровь и сыворотка крови здоровых (не иммунизированных против бруцеллеза и иммунизированных сухой живой вакциной из слабоагглютиногенного штамма Бруцелла абортус № 82) и больных бруцеллезом животных; молоко и соскобы со слизистой цервикального канала матки больных бруцеллезом коров. Материал для исследования от морских свинок: кровь и сыворотка крови инфицированных В. melitensis шт. 565 (доза 1000 м.к., подкожно) животных; кровь и сыворотка крови иммунизированных В. abortus шт. 82 (доза 1 млрд. м.к., подкожно) животных.

Кроме материала от животных в ПЦР исследовались препараты сухой живой вакцины против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма Бруцелла абортус № 82 (производство Государственного Щелковского биокомбината, серия № 029, контроль № 98, изготовлена 28.05.99, годна до 28.05.2000).

Кровь от крупного рогатого скота получали пункцией яремной вены стерильными иглами Боброва в две пробирки по 10 мл. Первая пробирка содержала 1 мл 4 % раствора цитрата натрия. Кровь из второй пробирки использовалась для получения сыворотки крови.

Соскобы со слизистой внутренних половых органов коров отбирали стерильными ватно-марлевыми тампонами при помощи влагалищного зеркала Полянского. Далее тампоны тщательно прополаскивали в стерильном физиологическом растворе, который затем центрифугировали при 1500 об./мин. в течение 15 минут. Осадок исследовали в ПНР.

Сборные пробы молока в количестве 10 мл от каждой коровы получали путем сдаивания последних порций. Предварительно кожа сосков вымени протиралась чистой увлажненной марлей и обрабатывалась 70 спиртом.

Образцы противобруцеллезной вакцины из В. abortus шт. 82 исследовались в ГЩР в нативном состоянии (2x1010 м.к./мл) и в разведениях приготовленных на физиологическом растворе (0,14 М NaCl), с конечной концентрацией 1x106, 1х104, 1х102, їх 10і м.к./мл

В ПЦР исследовали образцы цитратной крови и сыворотки крови от инфицированного бруцеллами и иммунизированного сухой живой противобруцеллезной вакциной из шт. № 82 В. abortus крупного рогатого скота, а также клинически здорового неиммунизированного против бруцеллеза крупного рогатого скота. Кроме того, ПЦР-анализу подвергались образцы молока и соскобы со слизистой внутренних половых органов больных бруцеллезом коров; препараты сухой живой противобруцеллезной вакцины из слабоагглютиногенного шт. № 82 В. abortus. Также исследовали сыворотку крови и кровь от иммунизированных В. abortus шт. № 82 и инфицированных В. melitensis шт. 565 морских свинок.

ГЩР-смесь-1 (праймеры и нуклеотиды) - 50 мкл; ПЦР-смесь-2 (буфер и Taq-полимераза) - 11 мкл; воск для ПЦР - 15 мкл; ПКО (положительный контрольный образец) - 10 мкл. В каждую пробирку, включая положительный и отрицательный контроли, вносили по 15 мкл реакционной смеси и наслаивали на поверхность 30 мкл минерального масла. В соответствующие пробирки под масло вносили по 10 мкл ДІЖ В. abortus шт. № 19 и 9 мкл дистилированной воды. В пробирку для отрицательного контроля вносили 10 мкл дистилированной воды.

Использование ПЦР в комплексе с серологическими реакциями (РА, РСК)

С момента открытия бруцелл Брюсом (1887) и Бангом (1897) произведено колоссальное количество исследований в разных странах и изучен широкий перечень вопросов, относящихся к бруцеллезу животных. Однако и в наши дни эта хроническая инфекционная болезнь представляет большую проблему глобального масштаба и для органов здравоохранения и для ветеринарных специалистов.

В настоящее время бруцеллез сельскохозяйственных животных на территории РФ распространен почти повсеместно. Очаги бруцеллеза регистрируются на Крайнем Севере, в зоне промышленного оленеводства [Калиновский А.И. с соавт., 1997], в Нечерноземье, Сибире, Дальнем Востоке, Поволжье и юге России [Димов С.К., 1980; Желудков М.М. с соавт., 1997]. Спектр возбудителей энзоотии бруцеллеза, протекающих в данных регионах, представлен В. melitensis, В. abortus, В. suis, В. ovis и в отдельных случаях В. canis.

В последнее время наблюдается интенсивное развитие ДНК-технологий, объективными причинами которого стали революционные открытия в области молекулярной биологии и генной инженерии (Стент Г., 1974). Это обусловило возникновение нового направления в лабораторной методологии - генодиагностики инфекционных болезней. Принцип генетической диагностики заключается в определении различными способами специфичного для искомого микроорганизма участка нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). Основными направлениями генодиагностики являются ДНК-зондирование и методы амплификации нуклеиновых кислот.

Наибольшее распространение из них получила полимеразная цепная реакция. Техника постановки ПЦР относительно доступна и вместе с тем обеспечивает достаточно высокие эффективность, специфичность и чувствительность анализа. Продолжительное время ПЦР оставалась прерогативой научно-исследовательских лабораторий и институтов. Применение этого метода в ветеринарной практике носило единичный характер [Шумилов К.В. с соавт., 1996]. В 1995 году ситуация коренным образом изменилась с выходом приказа МСХ и П № 350, направленного на интенсивное внедрение ПЦР в ветеринарию.

На данный момент полимеразная цепная реакция разработана для детекции у животных Mycobacterium spp., Chlamidia spp., Salmonella, Listeria monocytogenes, Y. enterocolitica, Micoplasma spp., Campilobacter jejuni, Lyssavirus и в том числе для обнаружения Brucella spp. Применение ПЦР позволило обеспечить эффективную детекцию бруцелл с чувствительностью ІхІОМхЮ3 м.к./мл в различном материале, независимо от степени диссоциации возбудителя, а также исключить ложноположительные результаты реакции в присутствии Y. enterocolitica 0:9, Е. coli 0:157 и других микроорганизмов, имеющих общие с бруцеллами антигенные детерминанты.

Изучение диагностической чувствительности ПЦР при исследовании сыворотки крови и цельной крови у больных и иммунизированных против бруцеллеза животных

Огромный интерес для ветеринарных специалистов представляют исследования направленные на решение проблемы дифференциации иммунизированных живыми противобруцеллезными вакцинами (из штамма № 82 и др.) животных от естественно инфицированных, так как применяемые в данный момент иммунобиологические методы в большинстве своем не дают такой информации. Ситуация несколько изменилась с внедрением в практику реакции иммунной диффузии (РИД) с О-ПС антигеном. Но эффективность этого метода к сожалению оказалась ниже таковой, чем у комплекса РА и РСК.

Для установления с помощью ПЦР возможных различий между инфекционным и иммунным процессами провели анализ крови и сыворотки крови на наличие ДНК бруцелл от зараженных B.melitensis шт. № 565 и привитых В.abortus шт. № 82 морских свинок. Материал исследовали на 25 сутки, с расчетом на то, что в эти сроки вероятнее всего наступит генерализованная инфекция (в первом случае) и явление бактериемии (в обоих случаях) [Здродовский П.Ф., 1948; Вершилова П.А. с соавт., 1974]. Сопоставление результатов ПЦР-анализа крови и сыворотки крови от двух групп животных показало, что, во-первых, исследование крови было предпочтительным при инфекционном процессе (87,5 % положительных проб), а при иммунной перестройке статистически достоверной разницы в вероятности обнаружения ДІЖ бруцелл в крови и сыворотки крови не установлено (21,4 % и 35,7 % соответственно). Во-вторых, частота обнаружения специфической ДНК в крови инфицированных животных оказалась в 4 раза выше, чем у иммунизированных морских свинок. Это может отражать интенсивность процесса взаимоотношений макро- и микроорганизма. Наиболее динамично, как правило, развивается процесс инфицирования организма.

Полученные таким образом данные могут быть использованы при интерпретации результатов ПЦР-анализа и разработке схемы дифференциации поствакцинального процесса от инфекции.

Диагностика бруцеллеза имеет ведущее значение в борьбе с нею. Своевременное выявление реагирующих животных - залог успеха при сохранении благополучия и оздоровлении неблагополучных хозяйств. У большинства животных бруцеллез протекает часто без клинических проявлений и поэтому выявить в таких случаях проще методом серологической, бактериологической диагностики.

При заболевании животных бруцеллезом изменяется реактивность организма, что приводит организм к образованию антител и развитию аллергического состояния, т.е. в результате этого происходит специфический ответ иммунной системы (гуморальной, клеточной).

Поэтому при диагностике бруцеллеза необходимо учитывать проявление иммунобиологических реакций на различных стадиях инфекционного процесса, т. к. при этом происходят активизации различных антител в крови (агглютининов, преципитинов, комплементсвязывающих веществ и т.д.), а также аллергического состояния организма.

Так как проявление различных иммунобиологических реакций на различных стадиях инфекционного процесса не постоянны, результатом которого является неполное выявление реагирующих животных даже при комплексном исследовании. В связи, с чем исследование животных надо проводить многократно.

Разработке диагностики и методов их применения посвящено множество работ, но до сих пор не изыскан совершенный метод диагностики и диагностикум.

С несомненным успехом был испытан, а затем применен на практике абортин С.Н. Вышелесского (1934), который готовили в виде суспензии в физиологическом растворе убитой нагреванием агаровой культуры бруцелл, содержащей 2 х10 9 микробных тел. По отзывам С.Н. Вышелесского, Е.С. Орлова, М.Е. Авакумово, Д.К. Бессонова (1935), Е.К. Волик и Г.М. Базылева (1935), И.А. Каркадиновской (1936), М.И. Штуцера и Н.Ф. Федотова (1936), П.Н. Жованик, Б.Г. Петренко и А.М. Говорова (1937, 1940), В.В. Павловского (1940), Е.С. Орлова (1940) и многих других, этот препарат при внутрикожной пробе давал хорошие результаты, как на крупном, так и на мелком рогатом скоте. Недостатком его было то, что он обладал сенсибилизирующими свойствами. Кроме того, после внутрикожной инъекции абортина Вышелесского, как, впрочем, и после других подобных аллергенов, у животных наблюдалось появление агглютининов, которые могли сохраняться до 3 месяцев [21].

В 1937 г. для аллергической диагностики бруцеллеза у мелкого рогатого скота П.Ф. Здрадовский предложил аллерген в виде экстракта из размолотых клеток бруцелл. Этот препарат получил название бруцеллизат. Он оказался высокоактивным и был принят для применения в широкой практике. После внутрикожной инъекции этого препарата также наблюдалось кратковременное появление у некоторых животных специфических агглютининов.

Н.П. Жованик (1940) применил для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота изготовленный им бруцеллин - шутель-экстракт убитой нагреванием отмытой взвеси из агаровой культуры нескольких штаммов B. abortus. В опыте на 150 коровах, реагировавших положительно на бруцеллез в РА, при первом исследовании на бруцеллин реагировали положительно 69,3% и сомнительно - 17,3% животных, а при повторном исследовании, проведенном через 25-30 дней после первого, реагировали положительно 90% и сомнительно - 9% животных.

Проявление аллергической реакции на введение антигена (аллергена) связано с иммунной реакцией клеточного типа, формирование которого происходит тимус зависимыми или Т-лимфоцитами [22,23].

В 1968 г. Е.С. Орлов и А.Н. Касьянов предложили новый бруцеллезный аллерген - бруцеллин ВИЭВ, изготавливаемый из неагглютиногенного штамма B. abortus.

Бруцеллин ВИЭВ в исследованиях авторов показал высокую специфичность и активность при диагностике бруцеллеза у овец и коз путем пальпебральной пробы и у свиней путем внутрикожной пробы, что было подтверждено производственной проверкой, проведенной в различных республиках страны на 115 тыс. овец и коз в 236 стадах, благополучных и неблагополучных по бруцеллезу. Авторы отметили также, что пальпебральная проба с применением бруцеллина ВИЭВ может быть использована для исследования на бруцеллез северных оленей. Бруцеллин ВИЭВ, как и бруцеллогидролизат ВИЭВ, совершенно лишен сенсибилизирующих свойств. Широкое применение бруцеллина ВИЭВ в практике получило положительную оценку со стороны ветеринарных специалистов (Е.М. Борисов, В.С. Дуранов, И.И. Брудков, 1970; Ф.Г. Муфтеев, И.Ф. Коновалов, А.Ф. Ашаткин, В.П. Юрейчук, В.В. Гуськов, 1972, и другие) [24].

Аллергическое состояние у больных бруцеллезом животных возникает позже, чем появляются специфические антитела в сыворотке крови, но может сохраняться очень долго. По данным П.П. Самойлова (1952), аллергическая реакция на бруцеллез у экспериментально зараженных бруцеллезом овец проявляется на 15-30-й день, но может выпадать у 16,7% животных на срок до одного месяца, у 16,7% - до двух-трех месяцев, а у 6,6% - даже до шести-девяти месяцев. Отрицательной аллергическая реакция становится у большинства искусственно инфицированных овец через 16 месяцев.

Аллергические реакции, как и серологические, у больных бруцеллезом животных могут выпадать под влиянием истощения, интеркурентных инфекций, поражения чесоткой и других факторов, вызывающих состояние анергии.

Н.П. Ивановым был разработан оригинальный способ получения аллергена при помощи ультразвукового дезинтегратора УЗДН - 2 [25].

В.Б. Теном был изыскан более упрощенный вариант получения бруцеллезного аллергена.

В процессе иммуногенеза количество Т-лимфоцитов коррелирует с выраженностью аллергических реакций, в то время как В-лимфоциты являются источником проявления антителообразования [26].

Активизацию иммунологической реактивности во время беременности наблюдал А.К. Бронников.

Несмотря на то, в специальной литературе имеется значительное количество сообщений по изысканию методов приготовления бруцеллезного аллергена, способов введения и необходимости его применения, перспективность разработки и применения его в зависимости от вида животного все еще актуально[27].