Спинномозговая пункция при инфекционных заболеваниях

Что такое спинномозговая пункция, техника выполнения люмбальной пункции

Люмбальная (спинномозговая) пункция – это процедура, в ходе которой врач вводит специальную иглу в спинной мозг (непосредственно в его подпаутинное пространство) и осуществляет забор жидкости. Проводится она с диагностической или лечебной целью. Четкая техника выполнения люмбальной пункции позволяет избежать тяжелых последствий и осложнений, хотя они и не исключены.

Показания и противопоказания к проведению люмбальной пункции

Рассматриваемая процедура может быть проведена для диагностики или лечения определенных заболеваний. Если нужно получить точные диагностические данные, то люмбальная пункция назначается при необходимости:

• выявить или исключить присутствие инфекционного агента в спинномозговой жидкости (ликвор);
• уточнить показатели ликворного давления;
• выявить проходимость подпаутинного пространства спинного мозга.

В случае проведения лечебных мероприятий пункция может понадобиться для введения в ликвор антибактериальных средств, избавления от лишнего количества спинномозговой жидкости. Показания и противопоказания к проведению люмбальной пункции делят на обязательные и условные. В рамках диагностики и лечения процедуру показано проводить при:

• любых инфекционных заболеваниях центральной нервной системы;
• подозрении на истечение ликворной жидкости;
• злокачественных опухолях, локализованных непосредственно в структурах спинного мозга;
• кровоизлиянии в паутинную оболочку.

Допускается люмбальная пункция и при рассеянном склерозе, эмболии сосудов, системных заболеваниях, лихорадке в раннем детском возрасте. При перечисленных проблемах целесообразность проведения рассматриваемой процедуры определяет лечащий врач.

Противопоказаниями к проведению рассматриваемой процедуры с диагностической или лечебной целью являются:

• отек мозга, протекающий тяжело и с выраженными симптомами;
• высокое внутричерепное давление выясненной или невыясненной этиологии;
• диагностированные новообразования головного мозга;
• окклюзионная гидроцефалия;
• проблемы в работе системы свертывания крови;
• беременность;
• длительный прием антикоагулянтов.

В некоторых ситуациях, когда требуется точная диагностика, спинномозговая пункция может быть проведена и вопреки имеющимся противопоказаниям. Например, результаты анализа люмбальной пункции при менингите дают возможность установить тип инфекционного агента и подобрать эффективные лекарственные препараты. И если патология диагностирована или подозревается у беременной женщины, то врачи пренебрегают этим положением и делают все для спасения жизни пациентки.

Как проводится люмбальная пункция

Поскольку рассматриваемая процедура достаточно сложная, то ее проводит опытный врач и только после предварительной подготовки пациента. Алгоритм подготовки к спинномозговой пункции:

• кожу в области будущего прокола и введения специальной иглы обрабатывают медицинским спиртом и смазывают йодом;
• затем вводят новокаин или лидокаин (обезболивающие препараты) подкожно;
• сразу после формирования так называемой лимонной корки введение указанных препаратов продолжают уже внутрикожно и дальше вглубь будущего прокола.

Многие пациенты интересуются, больно ли делать спинномозговую пункцию. Неприятные (но не болевые) ощущения возможны только в период подготовки к процедуре, когда врач вводит обезболивающие препараты.

После подготовки начинается непосредственно процедура:

Осложнения и последствия люмбальной пункции

В первые 2-3 часа после процедуры пациент должен находиться в горизонтальном положении, возможен некий дискомфорт – например головная боль после люмбальной пункции, которая быстро исчезает и не требует употребления обезболивающих лекарственных препаратов. Нельзя поднимать тяжести и много ходить в первые 3-4 дня.

Возможные осложнения и последствия люмбальной пункции:

• раздражение мозговых оболочек;
• стойкие боли в области прокола;
• повреждение диска и формирование грыжи;
• кровотечения;
• инфицирование центральной нервной системы.

Более подробную информацию о правилах проведения процедуры и стоимости иглы для люмбальной пункции можно получить на страницах нашего сайта Добробут.ком.

1) подозрение на инфекцию ЦНС, особенно воспаление спинномозговых оболочек (цереброспинальный менингит) (абсолютное показание);

2) аутоиммунное заболевание ЦНС;

3) метаболическое заболевание ЦНС, особенно лейкодистрофия;

4) некоторые нейропатии;

5) подозрение на субарахноидальное кровоизлияние у тех пациентов, у которых на КТ кровоизлияние не подтверждено;

6) другие заболевания ЦНС, при которых исследование спинномозговой жидкости (СМЖ) может помочь в диагностике, например, воспаление спинномозговых оболочек вследствие новообразования;

7) необходимость интратекального или субарахноидального введения контрастного вещества.

1) интратекальное введение лекарств: антибиотиков по поводу инфекции ЦНС, цитостатиков при лечении злокачественного новообразования ЦНС, анестетиков;

2) немедленное устранение определенного количества СМЖ с целью снижения ее давления (напр., при гидроцефалии).

1. Абсолютные: значимо повышенное внутричерепное давление — отек или опухоль мозга — особенно в задней части черепа (в таком случае сначала следует выполнить КТ головы).

2. Условные: инфекции кожи и тканей в области запланированной пункции, пороки развития позвоночника и спинного мозга (напр., дизрафия), расстройства свертывания (МНО >1,5 или АЧТВ превышает показатель нормы, более, чем в два раза, или количество тромбоцитов крови Осложнения

1. Постпункционный синдром

1) головная боль — обычно не сильная, появляется в течение 24–48 часов после пункции, чаще в лобной или затылочной областях; усиливается в вертикальном, а уменьшается в лежачем положении; может сопровождаться тошнотой, рвотой, головокружением, шумом в ушах, нарушениями зрения и менингеальными симптомами; проходит самостоятельно в течение суток (иногда через несколько недель). Профилактика: пункция более тонкой иглой (напр., 22 G вместо 18 G), направление среза конечности иглы в боковом направлении позвоночника (срез иглы должен находиться в сагиттальной плоскости) (чтобы волокна твердой оболочки не были пересечены, а только разделены), или применение атравматической иглы. Длительное пребывание пациента в лежачем положении после пункции не предотвращает головной боли. Лечение: лежачее положение, анальгетики перорально (парацетамол, парацетамол с кофеином, опиоиды; не применяйте НПВП и препараты, которые нарушают функцию тромбоцитов крови).

2) боль спины в месте пункции;

3) корешковые боли — чаще иррадиируют в нижние конечности; если они возникли при введении иглы — это указывает на раздражение нервных корешков (нужно немедленно оттянуть иглу и изменить направление пункции).

2. Другие (редко): парез нижних конечностей (вызванный эпидуральной гематомой; обычно у пациентов, принимавших антикоагулянты незадолго перед пункцией или после пункции); вклинивание миндалин мозжечка в затылочное отверстие (у больных с отеком мозга, опухолью или массивным субарахноидальным кровоизлиянием; приводит к смерти); субарахноидальное или эпидуральное кровоизлияние; повреждение связок позвоночника или надкостницы позвонков; острое гнойное воспаление позвонков; абсцесс; эпидермальная опухоль.

1. Информированное добровольное согласие пациента, если он в сознании.

2. Оцените количество тромбоцитов крови, МНО (INR) и АЧТВ, в случае отклонений — откорректируйте их; если пациент принимает антикоагулянты — их следует отменить →табл. 2.34-7.

3. Исключите наличие повышенного внутричерепного давления (отек мозга или опухоль) на основании обследования глазного дна (признаки отека и застойных явлений диска зрительного нерва) или КТ, которую следует выполнить при: иммунодефиците, заболевании ЦНС в анамнезе, свежем эпизоде ​​эпилептического припадка (судорог), отека или застойных явлениях диска зрительного нерва, нарушении сознания, наличии очаговых неврологических симптомов.

4. Положение пациента на боку, близко к краю операционного стола, спиной к врачу, который выполняет процедуру; нижние конечности согнуты в коленных и тазобедренных суставах, колени приведены к животу; голова максимально согнута в направлении колен (рис. 24.13-1), избегайте чрезмерного сгибания позвоночника, который на всем протяжении должен находиться в одной плоскости; спина и линия плеч находятся в перпендикулярной к столу плоскости.

Межпозвоночный промежуток, лучше между остистыми отростками L4 и L5 или L3 и L4, не выше промежутка между L2 и L3, по срединной линии, которая проходит через верхушки остистых отростков позвонков или несколько латеральнее от нее. Линия, соединяющая верхние точки подвздошных гребней бедренных костей пересекает поясничный отдел позвоночника на уровне остистого отростка позвонка L4 (рис. 24.13-1).

1. Набор для подготовки операционного поля →разд. 24.2 и, возможно, местной инфильтративной анестезии →разд. 24.3.

2. Стерильная одноразовая пункционная игла с мандреном 22 G или 20 G длиной 8,75 см (традиционная режущая типа Quincke или атравматическая, напр. типа Sprotte или Whitacre). Можно также применять иглы меньшего диаметра, которые вводят через короткую иглу большего диаметра (т. н. иглу-интродьюсер).

3. Аппарат для измерения давления спинномозговой жидкости.

4. Стерильные пробирки.

1. Подготовьте операционное поле →разд. 24.2. При необходимости проведите местную анестезию кожи и подкожной клетчатки, напр. кремом EMLA или инфильтрационно 1 % раствором лидокаина (или другим подходящим местным анестетиком) →разд. 24.3 (лишнее у пациентов без сознания).

3. С целью более детальной оценки (не всегда обязательно), удерживайте иглу одной рукой, другой подключите аппарат для измерения давления СМЖ (в норме составляет 7–15 [ 2 O; это соответствует обычно вытеканию СМЖ с иглы со скоростью 20–60 кап./мин; результат исследования является достоверным, если пациент лежит спокойно и относительно расслаблен).

4. После оценки давления наберите СМЖ в несколько стерильных пробирок с целью проведения необходимых исследований (обычно 3–5 мл, после исключения отека головного мозга макс. 40 мл).

5. После получения СМЖ введите мандрен в иглу, иглу удалите, а на кожу наложите стерильную повязку.

Пациент должен находится в лежачем положении около часа.

Пункцию спинного мозга часто называют люмбальной пункцией, поскольку она производится в поясничном отделе позвоночника (от лат. lumbar – поясничный). Речь идет о диагностической процедуре, в ходе которой через прокол забирают на анализ небольшое количество спинномозговой жидкости. В медицинском центре Шиба люмбальную пункцию практикуют для диагностики инфекционных заболеваний и злокачественных опухолей нервной системы. Несмотря на широкое использование в Израиле средств медицинской визуализации (например, компьютерной и магнитно-резонансной томографии), люмбальная пункция по-прежнему остается распространенной процедурой.

Что представляет собой пункция спинного мозга?

Пункцию спинного мозга выполняют именно в поясничном отделе из-за особенностей анатомического строения человеческого тела: на этом участке можно безопасно произвести прокол, не подвергая спинной мозг угрозе травмы. Полученный образец спинномозговой жидкости подвергают лабораторному исследованию на наличие признаков воспалительного или злокачественного процесса.

В Израиле в качестве метода лечения метастаз рака крови, локализующихся в центральной нервной системе – например, при лейкемии – используют интратекальную химиотерапию. Препараты для интратекальной химиотерапии вводится непосредственно в спинномозговую жидкость через специальный катетер.

В каких случаях целесообразна интратекальная химиотерапия?

Рак крови, или лейкоз (лейкемия), имеет тенденцию к формированию метастаз в центральной нервной системе. Центральная нервная система – головной и спинной мозг – окружена плотной мембраной, через которую затруднен доступ некоторых лекарств. Так, например, препараты для химиотерапии, если они вводятся в организм внутривенным путем, не способны преодолеть этот естественный барьер и, соответственно, не достигают своей цели. Чтобы повысить эффективность лечения метастаз (а иногда – и в целях их профилактики) препараты вводят интратекально – непосредственно в спинномозговую жидкость.

Отзыв о лечении лимфомы в Израиле с больницей Шиба - "Рекомендую всем у кого есть возможность лечиться в Шибе"

От редакции: на сегодняшний день Израиль – признанный мировой лидер в лечении всех типов лимфом. В клинике Шиба осуществляется эффективное лечение лимфомы даже на продвинутой стадии

Я прилетела в Израиль в критическом состоянии с 4-й стадией лимфомы. За 10 дней прошла диагностику, и были готовы ответы биопсий. Мой доктор - Мэирав Кэдми - действовала быстро, оперативно и профессионально. Уже через 3 месяца ПЭТ КТ показал отличный результат.
В больнице с пониманием относятся к боли, и все делается с минимальным количеством порезов и шрамов.
Очень довольна результатом и оперативной работой координатора Цан Виктории.
Рекомендую всем у кого есть возможность лечиться в Шибе!
Люба, 27 лет

Пункцию спинного мозга обычно проводят в больничной палате или в процедурной комнате. Процедуру выполняет врач. Ее продолжительность составляет 15-20 минут. Перед началом пациента просят опорожнить мочевой пузырь.

Пациента просят лечь на бок, согнуть ноги в коленях и прижать их к животу, голову наклонить вперед, прижимая подбородок к груди. В некоторых случаях люмбальную пункцию производят в сидячем положении, при этом пациент опирается на стол или спинку кровати.

Кожу в поясничном отделе спины обрабатывают антисептическим раствором. Затем производят инъекцию анестезирующего препарата, под воздействием которого участок пункции теряет чувствительность. После того, как действие анестетика достигло своего максимума, выполняют прокол кожи и осторожно проводят иглу в межпозвоночный промежуток. В норме давление спинномозговой жидкости превышает атмосферное, поэтому жидкость вытекает самостоятельно и по каплям поступает через полую иглу в пробирку. После получения небольшого количества ликвора, иглу извлекают, а место прокола кожи закрывают повязкой. Перед началом пункции и после ее окончания пациенту измеряют артериальное давление и пульс.

В течение часа нужно сохранять лежачее положение. Желательно приподнять верхнюю часть кровати или подложить под голову высокую подушку. Приподнятое положение верхнего отдела тела помогает предотвратить головную боль. Рекомендуется пить много жидкости, если к обильному питью не имеется противопоказаний. При головной боли можно воспользоваться болеутоляющим препаратом в соответствии с указаниями лечащего персонала.

Лабораторные методы диагностики при нарушении функции ЦНС при инфекционных болезнях у детей

Люмбальная пункция и исследование цереброспинальной жидкости

Люмбальная пункция проводится главным образом с целью получения ЦСЖ для лабораторного исследования, а также с лечебной целью.

Показания

1. Подозрение на инфекционные заболевания ЦНС (менингит или энцефалит).

2. Подозрение на внутричерепное (субарахноидальное или внутримозговое) кровоизлияние (если КТ невозможна или дает отрицательные результаты).

В лечебных целях к люмбальной пункции прибегают для дренирования ЦСЖ и снижения давления (например, при нормотензивной гидроцефалии, доброкачественной внутричерепной гипертензии или субарахноидальном кровоизлиянии), эндолюмбального введения лекарственных средств (например, антибиотиков при менингитах).

Противопоказания

1. Инфекция в месте предполагаемой пункции.

2. Подозрение на объемный процесс (абсцесс, опухоль, субдуральная гематома), особенно в задней черепной ямке, на что указывают нарастающие симптомы внутричерепной гипертензии, прогрессирующие очаговые симптомы, застойные диски зрительных нервов. В этих случаях перед проведением люмбальной пункции нужно обязательно исследовать глазное дно и провести ЭхоЭС.

3. Выраженная тромбоцитопения (менее 40 тыс./мкл) или снижение времени свертывания крови (более чем на 50 %).

Однако в двух ситуациях, несмотря на противопоказания, люмбальную пункцию все же приходится проводить: при наличии отека дисков зрительных нервов — когда есть подозрение на гнойный менингит, при доброкачественной внутричерепной гипертензии. В обоих случаях перед проведением люмбальной пункции нужна консультация невролога или нейрохирурга.

Истечение ЦСЖ можно усилить с помощью покашливания, надавливания на живот или яремные вены. Эти приемы затрудняют венозный отток от спинного мозга и повышают давление. Если игла не попала в субарахноидальное пространство или уперлась в кость, ее надо потянуть на себя, не извлекая полностью (срез должен остаться под кожей) и, изменив направление, ввести вновь.

ЦСЖ собирают не менее чем в 3 стерильные пробирки: в первую — для измерения концентрации белка и глюкозы, после чего содержимое пробирки центрифугируют, а осадок подвергают бактериоскопическому исследованию; во вторую — для определения клеточного состава и серологического исследования; в третью пробирку — для бактериологического исследования ликвора. При подозрении на туберкулезный менингит берут четвертую пробирку — для выявления фибриновой пленки. При высоком давлении ЦСЖ следует извлекать лишь небольшое ее количество, но в остальных случаях не следует слишком ограничивать объем выводимой жидкости, так как основные потери происходят через дефект мозговых оболочек, проделанный иглой (до 30 мл и более), к тому же скорость продукции ЦСЖ довольно велика (20 мл/ч). Чтобы уменьшить дефект, следует использовать более тонкие иглы, а срез иглы направлять параллельно оси позвоночника, так как при этом игла раздвигает, а не разрывает волокна.

После забора ЦСЖ иглу извлекают. Иногда при вставлении мандрена перед извлечением иглы может произойти ущемление корешка с последующим его отрывом, поэтому иглу рекомендуют извлекать без мандрена.

Если проведение люмбальной пункции невозможно из-за костных аномалий или инфекций в месте пункции, то прибегают к субокципитальной пункции.

Осложнения. Наиболее грозным осложнением люмбальной пункции является вклинение, обычно возникающее у больных с объемным процессом на фоне внутричерепной гипертензии. Внезапное падение давления в позвоночном канале может спровоцировать вклинение миндалин мозжечка в большое затылочное отверстие или крючка гиппокампа в вырезку намета мозжечка. Поэтому, если давление ЦСЖ оказалось высоким, для исследования следует извлечь лишь минимальное количество ЦСЖ и, назначив маннитол и кортикостероиды, установить наблюдение за больным. При ухудшении состояния во время люмбальной пункции или высоком риске вклинения иглу со вставленным мандреном иногда оставляют на месте и вводят маннитол внутривенно капельно (1,0–1,5 г/кг в течение 20–30 мин) и высокие дозы кортикостероидов (10 мг дексаметазона внутривенно струйно), после чего пункционную иглу удаляют.

При полной или частичной блокаде субарахноидального пространства, обусловленной сдавлением спинного мозга, например опухолью, извлечение ЦСЖ может привести к спинальному вклинению с быстрым нарастанием очаговой симптоматики. О наличии спинального блока свидетельствуют результаты ликвородинамических проб, ксантохромия в ЦСЖ (за счет повышения белка) и низкое давление.

У 10–30 % больных возникает постпункционная головная боль, связанная с длительным истечением ЦСЖ через отверстие в твердой мозговой оболочке, приводящим к внутричерепной гипотензии. Боль чаще всего локализуется в лобной и затылочной областях, возникает в первые 3 суток после пункции и обычно продолжается от 2 до 5 дней, но иногда затягивается на несколько недель. Характерно усиление головной боли в вертикальном положении и уменьшение в горизонтальном. Она усиливается при встряхивании головой, сдавлении яремных вен, но уменьшается при сдавлении живота. Боли иногда сопутствуют легкая ригидность шейных мышц, светобоязнь, головокружение. Лечение этого осложнения заключается в соблюдении постельного режима, приеме жидкости, внутривенном или внутримышечном введении 400–600 мг кофеин-бензоната натрия. Постпункционную головную боль можно свести к минимуму, если применять тонкие иглы, вводить иглу параллельно волокнам твердой мозговой оболочки, а перед удалением иглы осторожно повернуть больного на живот. Постельный режим после люмбальной пункции не всегда предотвращает головную боль, однако обычно больным рекомендуют лежать после люмбальной пункции на животе 2–3 часа. У части больных после пункции сохраняется корешковая боль. Изредка отмечается преходящее поражение отводящего нерва с появлением двоения и паралитического сходящегося косоглазия. Возможно развитие менингита, если игла проходит через инфицированные ткани. Крайне редкие осложнения — эпидуральная гематома со сдавлением конского хвоста (обычно у больных с коагулопатией) и холестеатома.

Увеличение числа клеток в ЦСЖ (плеоцитоз) может происходить за счет нейтрофилов или лимфоцитов. Значительный нейтрофильный плеоцитоз характерен для бактериальной инфекции, лимфоцитарный — для вирусных и хронических воспалительных заболеваний. Однако на ранней стадии развития гнойного менингита цитоз может быть невысоким, с преобладанием лимфоцитов, тогда как при серозном менингите в ЦСЖ могут преобладать нейтрофилы, и лишь повторная люмбальная пункция (через 10–12 часов) позволяет избежать диагностической ошибки. Увеличение числа лейкоцитов отмечается после субарахноидального кровоизлияния и тромбоза венозных синусов. Эозинофилы характерны для паразитарных заболеваний. Многие органические заболевания ЦНС сопровождаются небольшим плеоцитозом. Во всех случаях плеоцитоза, даже если клеточный состав нехарактерен для инфекционного заболевания, необходимо тщательное бактериологическое исследование ЦСЖ. При карциноматозе мозговых оболочек плеоцитоз обычно не превышает 100 клеток в 1 мкл.

Уровень глюкозы в ЦСЖ в норме составляет 50–60 % содержания глюкозы в крови (в норме 2,8–3,9 ммоль/л). При гипергликемии относительно низкий уровень глюкозы (например, при бактериальном менингите) можно принять за нормальный, поэтому, чтобы оценить этот показатель, нужно знать содержание глюкозы в крови. Снижение содержания глюкозы — возможный признак бактериального, туберкулезного, грибкового или канцероматозного менингитов.

Содержание белка в ЦСЖ в норме составляет от 0,2 до 0,45 г/л. В норме около 70 % белка ЦСЖ составляет альбумин и около 12 % — g-глобулины. Белки в ЦСЖ попадают из плазмы путем селективного транспорта или же синтезируются в самом подпаутинном пространстве. Поэтому повышение концентрации белка в ЦСЖ может возникать как в результате общего нарушения иммунологического статуса в организме, так и в результате нарушения гематоэнцефалического барьера, замедленной реабсорбции или повышенного локального синтеза иммуноглобулинов (Ig). Содержание белка нарастает при менингитах и энцефалитах, нейросифилисе, карциноматозе и некоторых других формах опухолей головного мозга. При опухолях спинного мозга или блокаде субарахноидального пространства содержания белка может повышаться в 10–20 раз. Значительное увеличение уровня белка отмечается при синдроме Гийена — Барре (начиная со 2-й недели заболевания), хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии. При наличии примеси крови в ликворе исходное содержание белка можно рассчитать, учитывая, что при прибавлении 700 эритроцитов уровень белка повышается на 0,1 г/л. Повышение Ig может наблюдаться и при нормальном содержании общего белка в ЦСЖ. Так, повышение Ig обнаруживается при рассеянном склерозе, синдроме Гийена — Барре, нейросифилисе. Скорость синтеза Ig в подпаутинном пространстве может быть выражена ликворным индексом IgG. Он определятся как соотношение IgG в ликворе/в сыворотке. В норме ликворный индекс колеблется от 0 до 0,7. Этот индекс у 70 % больных с клинически достоверным рассеянным склерозом превышает 0,7. Обнаружение олигоклональных IgG методом изоэлектрического фокусирования ликвора также весьма существенно для диагностики рассеянного склероза. Однако выявление олигоклональных групп IgG не является специфичным только для рассеянного склероза. Они выявляются при других заболеваниях ЦНС воспалительной и инфекционной природы. Показатели ЦСЖ при различных состояниях представлены в табл. 1.

Методы обнаружения возбудителя. Решающую роль в диагностике и лечении инфекционных болезней играет определение возбудителя. Обнаружить возбудитель в организме больного можно путем непосредственной микроскопии, бактериологического посева, биологической пробы на животных, вирусологических, серологических методов исследования и ДНК-диагностики.

Для микроскопии и бактериологических посевов используют кровь, ЦСЖ, мочу, слизь из носа и глотки, кал, различные патологические выделения. Количество выросших колоний при микробиологических исследованиях зависит от числа посеянных микроорганизмов и их жизнеспособности к моменту посева. Это означает, что объем и количество ЦСЖ, направленной на микробиологическое исследование, и быстрота ее доставки непосредственно отражаются на результатах исследования. При подозрении на бактериальную инфекцию производят окрашивание приготовленного мазка по Граму. Для исключения туберкулеза осадок ЦСЖ, полученный при центрифугировании, окрашивают на кислотоустойчивые микроорганизмы. При подозрении на грибковое поражение препарат обрабатывают тушью. Обнаружение возбудителя в ликворе (бактериоскопически или методом посева) является абсолютным доказательством соответствующей инфекционной болезни ЦНС. Следует учесть, что при микроскопии мазка ЦСЖ далеко не всегда можно обнаружить возбудителя, при бактериологических посевах материала необходимо время для получения роста микроорганизмов (не менее 72 часов), а, например, рост микобактерий туберкулеза можно получить в культуре не ранее пятой недели, что затрудняет своевременную диагностику.

Биологическая проба на животных применяется, главным образом, при зоонозах. Кроме того, биологическая проба является единственным достоверным лабораторным подтверждением ботулизма.

Вирусологические методы исследования очень трудоемкие и длительные, что не позволяет широко применять их для диагностики.

Для идентификации вирусов, а также ряда бактерий используют серологические методы, в основе которых лежит прямое взаимодействие специфических антител с антигеном. С помощью антител, содержащихся в диагностических иммунных сыворотках, могут быть идентифицированы самые разнообразные антигены, в том числе и патогенных микроорганизмов. Серологические реакции дают возможность судить не только о динамике накопления антител в процессе заболевания, но и о напряженности иммунитета, возникающего после профилактических прививок.

На практике наиболее широко применяются реакции нейтрализации, связывания комплемента, агглютинации, преципитации, нейтрализации и др.

Однако наиболее точными являются серологические реакции с участием меченых антигенов или антител — метод флюоресцирующих антител (МФА) и иммуноферментного анализа (ИФА) (G.T. Wolker et al., 1995).

Принцип МФА состоит во взаимодействии антигена и антитела, меченного флюорохромом. Последний обладает свойством люминесцировать в потоке ультрафиолетовых лучей и не влияет на специфичность антител. Результаты учитываются фотометрически. МФА является экспресс-методом, который позволяет уже через 2–3 часа установить с достаточной степенью точности этиологический диагноз. Так, при клещевом энцефалите максимальное число положительных результатов МФА определяется в первые 3 дня болезни.

ИФА (в иностранной литературе — ELISA) также основан на использовании меченых антител. Принцип метода состоит в обнаружении антигена, фиксированного на определенном носителе специфическими глобулинами, мечеными ферментами. Фермент выявляется различными субстратами, дающими с ним характерное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству исследуемого антигена. Результаты могут учитываться как визуально, так и инструментально (фотометрически). К настоящему времени разработаны различные варианты ИФА: прямой, непрямой, конкурентный, одинарный и двойной сэндвич-методы и другие его модификации, что позволяет определять отдельные фракции иммуноглобулинов, в частности IgM. Это особенно важно не только для ранней диагностики ряда инфекционных заболеваний (клещевой энцефалит, болезнь Лайма, гепатиты, герпинфекции и др.), но и для установления сроков заражения (цитомегаловирусная инфекция, токсоплазмоз, гепатиты В, С и др.).

В современной практике успешно применяются методы ДНК-диагностики. Их специфичность достигает 100 %, а чувствительность — 75–98 %. Методы ДНК-диагностики по праву считаются самыми быстрыми, чувствительными и экономичными методами не только диагностики, но и контроля за проводимым лечением. Они позволяют выделить возбудитель при самых низких концентрациях в исследуемом материале, могут использоваться при серонегативных реакциях (например, у больных СПИДом), и результат готов в течение нескольких часов (К.Т. Момыналиев, В.М. Говорун, 2000; A.M. Wang, P.E. Mark, 1990).

К методам ДНК-диагностики относят амплификационные технологии, гибридизацию ДНК, методы ДНК-чипов и оптические сенсоры. Следует отметить, что методы ДНК-диагностики не исключают, а лишь дополняют спектр традиционных методов, используемых в микробиологической и вирусологической диагностике в настоящее время.

Амплификационные технологии. В настоящее время наиболее широко используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) как для научных исследований, так и в практическом здравоохранении. В основе метода лежит амплификация (многократное умножение, синтез) специфического для данного вида возбудителя фрагмента ДНК. Синтезируемый в ходе ПЦР продукт можно детектировать различными способами. Одним из самых простых, эффективных и распространенных способов является электрофорез. Существуют и другие методы, позволяющие проанализировать образующийся в результате реакции амплификации продукт. К числу таких методов следует отнести жидкостную хроматографию и масс-спектроскопию.

По существу, специфичность ПЦР определяется праймерами и составляет 96–100 %. Такой высокий показатель обусловлен тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида возбудителя фрагмент ДНК. Однако возможен небольшой процент ложноположительных реакций, связанных прежде всего с перекрестно-реагируемыми антигенами, которые могут присутствовать в исследуемом материале, а также техническими погрешностями, ингибиторами реакций и т.д.

К существующим модификациям ПЦР относят:

1. Обратная транскриптаза ПЦР (ОТ-ПЦР). В ряде случаев механизм простой ПЦР не пригоден для идентификации РНК. Вместе с тем хорошо известно, что геномы многих вирусов состоят из молекул РНК, и вследствие этого идентификация РНК-вирусов, таких как ВИЧ, представляется актуальной задачей. ОТ-ПЦР позволяет определять РНК-содержащие вирусы.

2. Мультипраймерная ПЦР осуществляет процесс коамплификации нескольких ДНК-матриц в одной реакционной среде с использованием нескольких пар праймеров, что позволяет проводить скрининг по нескольким инфекционным возбудителям, определять одновременно наличие в биопробе комплекса факторов вирулентности и резистентности к антибактериальным и противовирусным препаратам.

3. Гнездовая ПЦР является одной из наиболее распространенных и высокочувствительных модификаций метода ПЦР. В методе используется две пары праймеров с последовательным определением специфического фрагмента ДНК.

4. Метод in situ (IS-ПЦР) в отличие от обычной ПЦР позволяет не только специфически амплифицировать какую-либо последовательность ДНК, но и локализовать ее внутри клетки. Такая способность метода IS-ПЦР делает его неоценимым как в исследовании латентных вирусных инфекций и экспрессии генов в клетке, так и в оценке эффективности новых лекарственных средств на клеточном и молекулярном уровнях.

Кроме ПЦР, к амплификационным технологиям относят лигазную цепную реакцию, которая широко используется в диагностике туберкулеза и некоторых других инфекционных агентов, содержащих ДНК; амплификацию с вытеснением цепи (SDA), реакции опосредованной амплификации (NASA, NAS, 3SR).

Для целей практической ДНК-диагностки, кроме вышеперечисленных методик, применяются также и другие технологии, позволяющие решить проблему установления характерных свойств биообъекта, например, его принадлежность к определенному штамму, наличие факторов вирулентности и т.д. К ним относят ДНК-чипы и оптические биосенсоры. Технология ДНК-чипов основана на гибридизации неизвестной нуклеотидной последовательности с расположенными в определенном порядке известными ДНК-последовательностями, иммобилизованными на поверхности стекла или кремния (ДНК-чип) с последующей детекцией. Однако на сегодняшний день нуклеотидная последовательность большинства геномов не расшифрована. Следовательно, то количество информации о генах индивидуального организма, которое можно заложить в ДНК-чип, ограничено, что, в свою очередь, препятствует более широкому применению методов ДНК-чипов. Оптические биосенсоры основаны на ДНК-чипах, но являются открытыми системами, позволяющими проводить наблюдения в реальном режиме времени, что оставляет исследователям больше возможностей для манипуляций, изучения и анализа интересующих генов.

Для методов ДНК-диагностики, в частности ПЦР, наиболее рациональным и эффективным является их применение для обнаружения микроорганизмов, трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий, а также внутриклеточных паразитов и микроорганизмов, способных длительно персистировать в организме хозяина без клинических симптомов. Особое место в этом ряду занимают микобактерии туберкулеза, некоторые вирусы, а также прионы.