Пцр диагностика инфекций бланк

За звучной аббревиатурой ПЦР скрывается сложная и не слишком понятная для рядового пациента расшифровка — полимеразная цепная реакция. Что же такое ПЦР-диагностика, на чем она основана и почему в последнее время ее стали считать самой перспективной технологией в постановке диагнозов, касающихся инфекционных и вирусных заболеваний? Мы расскажем о преимуществах ПЦР-метода, его особенностях и этапах проведения.

ПЦР-диагностика: что это такое?

Диагностика методом ПЦР существует чуть более 30 лет. Значительно эволюционировав за это время, она зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. В основе метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. В результате сложного процесса, называемого амплификацией, под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) из одной молекулы ДНК образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Цикл образования новой молекулы ДНК занимает всего около 3 минут, а тридцати-сорока циклов вполне достаточно, чтобы получить количество молекул, необходимое для достоверного визуального определения методом электрофореза.

Кроме амплификации, то есть простого увеличения числа копий молекулы ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Это позволяет использовать ПЦР не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

ПЦР-диагностика проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. На сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов рибонуклеиновой кислоты (РНК). В некоторых из них амплификация осуществляется при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Это не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше увеличивает точность исследования методом ПЦР.

В клинической медицине ПЦР-диагностика является одним из наиболее востребованных методов анализа в самых разных сферах:

Прямое определение возбудителя инфекции. Некоторые традиционные методы, такие как иммуноферментный анализ (ИФА), выделяют только белки-маркеры, которые являются продуктом жизнедеятельности возбудителей инфекции, а потому только косвенно указывают на присутствие микроорганизмов. Наличие специфического участка в ДНК, выявленное с помощью ПЦР, безошибочно или почти безошибочно указывает на присутствие конкретной инфекции.
Высокая специфичность метода . Она обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется фрагмент ДНК, характерный только для конкретного возбудителя инфекции. Специфичность исключает возможность ложных результатов анализа, тогда как в иммунологических методах исследований ошибки вполне вероятны из-за перекрестной реакции антигенов.
Высокая чувствительность . При помощи ПЦР-диагностики можно выявить присутствие в организме даже единичных клеток вирусов или бактерий в тех случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. ПРЦ определяет наличие всего 10–100 клеток в пробе, тогда как иммунологическими и микроскопическими тестами можно определить наличие инфекции при количестве клеток не менее 103–105.
Универсальность . Сходство состава всех ДНК или РНК дает возможность применять универсальные методы лабораторных исследований, диагностируя сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы.
Скорость получения результатов . Поскольку для проведения ПЦР-диагностики не нужен посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени на нее не требуется. Весь цикл — от забора биоматериала до получения результатов — занимает 4–5 часов.
Диагностика латентных инфекций . ПЦР-методом диагностируются трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, встречающиеся в тех случаях, когда заболевание протекает в скрытой форме.

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания.

Тем не менее не стоит думать, что ПЦР-диагностика не имеет недостатков. У нее есть свои ограничения, но их количество настолько незначительно, что не может отрицательно повлиять на популярность и эффективность метода:

Вероятность амплификации ДНК не только живого, но и погибшего микроорганизма . При проведении ПЦР-диагностики для контроля эффективности лечения необходимо соблюдать определенные требования. В частности, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1–2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции в организме.
Возможность возникновения перекрестной реакции . Подбор фрагментов ДНК (праймеров) осуществляется на основе знаний о генетическом строении конкретного микроорганизма. Но теоретически такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован. Их присутствие в пробе может привести к ложноположительному результату анализа.
Изменчивость микроорганизмов . Эта способность возбудителей к мутации иногда приводит к тому, что некоторые их штаммы становятся неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Чтобы уменьшить риски, разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

ПЦР-диагностика проводится в специальной лаборатории в несколько этапов.

Забор биоматериала . Процедура, предшествующая непосредственному анализу, которая осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Забор делается с помощью стерильного оборудования только в стерильные пробирки. Материалом для исследования могут быть:
- Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек: из уретры, из цервикального канала, со слизистой дыхательных путей и зева, из конъюнктивы. Забор проводится с помощью специального ершика, при этом недопустимо попадание в материал следов крови.
- Моча . Собираются первые 50 г утренней мочи в стерильную емкость. Материал используется для диагностики мочеполовых инфекций.
- Мокрота . Используется для ПЦР-диагностики туберкулеза и респираторных форм микоплазмоза и хламидиоза. Мокроту собирают в стерильный флакон в количестве 15–20 мг.
- Кровь, сыворотка, плазма . С их помощью диагностируются гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция. Для анализа используется венозная кровь (1–1,5 мл), собранная у пациента натощак в стерильную пробирку. Хранить биоматериал можно не более суток при температуре 4°С. Замораживать кровь категорически запрещается.
- Биологические жидкости . К ним относятся слюна, сок простаты, околоплодная, плевральная, спинномозговая, суставная жидкости. Собираются при помощи пункции с использованием стерильного инструментария в количестве 0,1–1,5 мл в стерильные пробирки.
- Биоптаты , т.е. материалы, полученные путем биопсии. Обычно на анализ отправляют биоптаты двенадцатиперстной кишки или желудка, чтобы выявить хеликобактерную инфекцию. Объем материала 2–3 мм 3 .
Хранение и транспортировка биоматериала . Хранить образцы можно при комнатной температуре не более 2 часов. Если необходимо длительное хранение, то пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток. Допустимо хранение некоторых биоматериалов в течение двух недель в замороженном виде при температуре -20°С. Оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если она необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах с соблюдением всех правил хранения и перевозки биоматериалов.
Выделение ДНК из образца . Способ выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца. Если, например, анализируется соскоб эпителиальных клеток, используется так называемый метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении в образец специального вещества, концентрации ДНК на сорбенте и его многократной отмывке буферным раствором.
Проведение ПЦР . Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку. Туда же добавляется амплификационная смесь, имеющая сложный состав, в объеме 25 мл. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическом режиме проводится амплификация. Время ее проведения зависит от заданной программы и составляет 2–3 часа. Одновременно с опытными пробами проводятся контрольные — положительные , включающие в себя контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя, и отрицательные , не содержащие исследуемую ДНК. Количество циклов амплификации варьирует от 30 до 40, более 40 циклов проводить не рекомендуется, так как это способствует увеличению количества неспецифических продуктов в пробе.
Регистрация результатов . Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества — бромистого этидия. Его соединение с фрагментами ДНК дает светящиеся полосы при облучении ультрафиолетовым излучением. Образец помещают в камеру для электрофореза и в течение 35–40 минут проводят разделение продуктов амплификации. После этого образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие оранжевой светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.
Интерпретация результатов исследования . Результат ПЦР-диагностики может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции, причем именно в данный момент времени. Количественный результат ПЦР-анализа оценить может только врач, они индивидуальны для разных типов инфекций. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Цена ПЦР-диагностики зависит от того, на какую конкретно инфекцию пациент планирует проверяться, от вида анализируемого материала, методики тестирования — качественной или количественной. Цена за определение одной инфекции составляет от 200 до 800 рублей в разных клиниках. Кроме того, к стоимости анализа добавится и плата за забор биоматериала — около 400 рублей. Средняя стоимость ПЦР-диагностики разных видов приведена в таблице 1.

Таблица 1 . Примерные цены на анализы ПЦР в Москве

Название анализа	Цена, руб.
Определение ДНК хламидия	750
Определение ДНК микоплазмы хоминис	540
Определение микоплазмы гениталиум	350
Определение ДНК уреаплазмы	350
Гонококк, определение ДНК	350
Определение ДНК герпеса (разные типы)	350–600
Определение ДНК кандиды	570
Вирус краснухи, определение РНК	800
Дифференцированное определение ДНК ВПЧ (разные типы)	350–1900 [1]

Цены на ПЦР-диагностика инфекций

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из методов диагностики, позволяющих добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе) с использованием фермента ДНК-полимеразы.

Преимущества метода ПЦР:

- высокая чувствительность – выявляет единичные клетки;

- высокая специфичность – определяет уникальный фрагмент ДНК-возбудителя;

- быстрота получения результата и универсальность проведения реакции – ответы выдаются на следующий день после сдачи анализа;

- диагностика любых видов микроорганизмов – культивируемые, некультивируемые, персистирующие формы.

Для исследования используется биологический материал, в котором предполагается обнаружение патогена – соскоб из цервикального канала, уретры, влагалища; сперма, секрет простаты, моча, амниотическая жидкость, биоптат лёгких, печени, бронхоальвеолярный лаваж, кровь, мазок носоглотки, ротоглотки, мокрота, отделяемое конъюнктивы, плевральная жидкость, синовиальная жидкость, слюна, спинномозговая жидкость и др.

Актуальность и обоснованность применения ПЦР-технологии обусловлена тем, что инфекции урогенитального тракта в настоящее время характеризуются отсутствием патогномоничных специфических симптомов, стёртыми клиническими проявлениями, многоочаговостью инфицирования, что представляет значительные трудности для рутинной клинической диагностики и своевременной адекватной терапии.

Наша лаборатория проводит как качественные, так и количественные ПЦР-исследования.

Мы выполняем уникальный анализ ФЕМОФЛОР, который позволяет из одной биопробы выполнить количественную оценку общей бактериальной массы, нормофлоры (лактобациллы, типичные для урогенитального тракта женщин) и комплекса аэробных и анаэробных микроорганизмов, микоплазм, грибов рода Candida, ассоциированных с развитием специфических и неспецифических вульвовагинитов, бактериального вагиноза.

В случае необходимости проведения комплексной качественно-количественной оценки состояния урогенитального тракта женщин рекомендовано исследование ФЕМОФЛОР-СКРИН, которое объединяет тестирование на наличие основных патогенов – возбудителей инфекций, передаваемых половым путём (ИППП) и количественное исследование важнейших показателей состояния микробиоценоза.

Принимая во внимание клиническую и социальную значимость заболеваний мочеполовой системы у мужчин, часто стертого или асимптомного течения, а также важность равноценного обследования обоих половых партнёров при нарушениях репродуктивной функции и наличии заболеваний урогенитального тракта мы выполняем анализ АНДРОФЛОР, который позволяет осуществлять диагностику инфекционно-воспалительных заболеваний мочеполовой системы у мужчин.

Проблема диагностики и лечения заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека (HPV) является актуальной в связи с ростом заболеваемости (ежегодно диагностируется около 500 тыс. новых случаев рака шейки матки), значительной контагиозностью и высоким онкогенным потенциалом возбудителя. В нашей лаборатории выполняется качественный тест – СКИНИНГ Human papillomavirus (HPV) высокого онкогенного риска, и количественный тест Human papillomavirus (HPV) 21 типа - вирусы высокого и низкого онкогенного риска.

- клинические и/или лабораторные признаки воспалительного процесса урогенитального тракта;

- дисбиотические нарушения на фоне различных воздействий, в том числе:

· лечение антибиотиками, гормонами, цитостатиками;

· использование контрацептивов, в том числе внутриматочной спирали;

· смена полового партнёра;

- предстоящие оперативные манипуляции на органах малого таза с высоким риском инфекционных осложнений;

- беременность (во всех триместрах);

- обследование при планировании беременности.

Не рекомендуется сдавать анализ во время менструации.

Не рекомендуется осуществлять спринцевание влагалища в течение суток до сдачи мазка, использовать вагинальные антибактериальные свечи. Для исключения искажений результатов определения состава микрофлоры из-за присутствия в урогенитальном тракте транзиторной микрофлоры в течение 3 дней перед взятием биоматериала рекомендуется половое воздержание или защищённый половой контакт. Рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 3 часов до сдачи мазка. Если предполагается исследование материала со слизистой оболочки ротовой полости, перед обследованием необходимо воздержаться от принятия пищи и жидкости в течение нескольких часов.

Сбор утренней порции мочи проводится в стерильный контейнер.

Спасибо врачу за проведённую операцию, с легкостью легла к к нему на операционный стол и под его поддержку немножко юморной и я уснула, было не страшно , спасибо огромное за выполненную работу. Подробнее

Выражаю огромную благодарность замечательному доктору Титову Дмитрию Алексеевичу за проведенное лечение, за внимательное отношение и профессионализм! Спасибо за позитивный настрой на протяжении всего лечения. Подробнее

Проходила лечение в Отделении в IX/2019-II/2020, хочу выразить огромную благодарность всему коллективу Отделения противоопухолевой лекарственной терапии под руководством замечательного, чуткого доктора Шикиной Валентины Евгеньевны. Благодаря атмосфере, созданной в Отделении очень нелегкое лечение, перенесла морально легко! Спасибо за профессионализм, внимате. Подробнее

Я искренне благодарю очень хорошего врача Павла Юрьевича Орехова. Так сложилось, что мне по разным диагнозам довелось проходить лечение в отделении сосудистой хирургии, а Павел Юрьевич был моим лечащим врачем. Я уверен, что именно его профессиональные действия, назначения и рекомен. Подробнее

Потрясающий доктор. Спасибо ей огромное за всё, очень компентная, внимательная и что сейчас очень редко в нашей медицине, она нацелена на то, чтоб вылечить пациента и помочь ему, а не просто поговорить. Мы с мужем являемся её пациентами и очень рады, что нас судьба свела с таким чудесным доктором. Спасибо . Подробнее

Хочу выразить огромную благодарность Хлопушину Евгению Юрьевичу за профессионализм и необыкновенно чуткое отношение. Врач очень грамотно и комплексно подошел к моей ситуации: провел полную диагностику, в кратчайшие сроки организовал необходимое предоперационное лечение. Он блестяще провел сложную операцию, после которой уже практически через неделю я смогла . Подробнее

Выражаю огромнейшую благодарность хирургу-онкологу,д.м.н.Ищенко Роману Викторовичу за его добрейшее сердце, высочайший профессионализм и чуткое отношение к пациентам. Благодарю судьбу ,что мы узнали об этом замечательном враче по программе ЗдоровЯ. Роман Викторович помог нам справиться с нашей проблемой. Операция, которую он провел моему мужу на лёгком прошл. Подробнее

Огромная благодарность врачу-колопроктологу зиновскому Михаилу Вячеславовичу. Была у него на приёме 11 марта 2020 года. Острая боль, еле дошли с мужем, хотя всего и через дорогу. Сделал все, как мне кажется, возможное. Дал все необходимые рекомендации, и свой номер телефона. Сказал звонить, если будут какие либо вопросы. Звонила и консультировалась с ним у. Подробнее

В феврале 2020г попала в онкологическое отделение, где меня встретила зав отделением Косый Валентина Васильевна. Огромное ей спасибо за профессионализм и чуткое отношение. Здесь же мне была сделана сложнейшая операция Ищенко Романом Викторовичем и Астаховым Дмитрием Анатольевичем. Это мои три ангела-спасителя.
Сейчас я быстро восстанавливаюс. Подробнее

Выражаю огромную благодарность Артуру Робертовичу за его профессионализм и "золотые" руки. Оперировал маму дважды в июне 2019 и в феврале 2020 года и оба раза успешно. Очень внимательный, чуткий и отзывчивый Врач. Очень аккуратный в своей работе и что порадовало "эстет" по части швов))) Он в буквальном смысле спас жизнь моей м. Подробнее

Подайте заявку на госпитализацию или исследование.
Специалисты регистратуры свяжутся с вами и согласуют
удобное для вас время. Или перейдите к форме записи онлайн.

Информация об исследовании

Комплексное исследование мазка из урогенитального тракта на наличие самых распространенных и опасных венерических инфекций: нейссерия гонореи, хламидия трахоматис, микоплазма гениталиум, трихомонас вагиналис. Присутствие данных патогенов в организме требует обязательного лечения.

Исследование проводится методом ПЦР. ПЦР (полимеразная цепная реакция) – самый быстрый и достоверный метод диагностики инфекционных заболеваний. Чаще всего его используют для выявления инфекций, передающихся половым путем (ИППП), ПЦР диагностика эффективна для обнаружения микроорганизмов трудно выявляемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий, внутриклеточных паразитов и микроорганизмов, способных длительно существовать в организме хозяина и вызывать хронические заболевания.

В комплексе проводится исследование следующих патогенных микроорганизмов:

Трихомонада вагиналис– возбудитель урогенитального трихомоноза. Этот анаэробный паразит обитает в мочеполовом тракте мужчин и женщин, причем у женщин влагалищная трихомонада обнаруживается чаще. Мужчины, в основном, являются носителями трихомонадной инфекции. Основное место обитания урогенитальной трихомонады в мужском организме - уретра, предстательная железа и семенные пузырьки, в женском — влагалище, шейка матки и уретра.
Хламидия трахоматис– облигатные внутриклеточные паразиты, передающиеся преимущественно половым путём, и вызывающие хламидиоз (в первую очередь, поражения слизистых оболочек половых путей, конъюнктивиты). Достаточно широко распространённая инфекция, может протекать бессимптомно, часто хронизируется, сопровождается различными осложнениями, которые иногда у женщин являются причиной бесплодия и невынашивания беременности.
Микоплазма гениталиум– патогенный микроорганизм, вызывает заболевания мочеполового тракта. Микоплазмы передаются при половых контактах, могут являться причиной негонококкового уретрита и простатита, воспалительных заболеваний малого таза, патологии беременности и плода, бесплодия у женщин и мужчин.
Нейсерия гонореи– это грамотрицательная бактерия, относящаяся к диплококкам и вызывающая самое распространенное венерическое заболевание - гонорею. Поражает слизистые оболочки мочеполовой системы как у мужчин, так и у женщин. Новорожденные могут заразиться гонореей при прохождении ребёнка через родовые пути (бленнорея новорожденных).

Возможно проведение исследования по урогенитальному мазку, мазку с коньюнктивы глаза, ротовой полости.
Урогенитальный мазок берется у мужчин из мочеиспускательного канала, у женщин из влагалища, уретры, цервикального канала.

В Лаборатории Гемотест по умолчанию взятие мазка производится из цервикального канала.
Мазок с коньюктивы глаза берется профильным специалистом(офтальмологом).

Показания к назначению исследования

Для диагностики и мониторинга лечения урогенитальной инфекции.(особенно вялотекущие заболевания мочеполовой системы)
Профилактические обследования
При планировании беременности (обоим супругам).
При бесплодии или невынашивании беременности.

Подготовка к исследованию

Женщинам рекомендуется сдавать анализ до менструации или через 2 дня после ее окончания.
Мужчинам не следует мочиться в течение 3 часов до анализа.
За 24-48 час исключить -половой контакт, местные(влагалищные) процедуры- введение свечей, спринцевания, УЗИ вагинальное и кольпоскопия
Проводить исследование не ранее чем через 14 дней после применения антибактериальных препаратов.

С этим исследованием сдают

16.1. Гинекологический мазок на флору
16.2. Мазок на флору из уретры
120.4. Посев отделяемого урогенитального тракта на микрофлору
172.0. Посев на уреаплазму уреалитикум и микоплазму хоминис
28.96.1. ПЦР-4 ИППП патогены (анализ мазка) качественный

Результаты исследования

Антибактериальная терапия.
Загрязнение пробы посторонними молекулами ДНК ведет к ложноположительному результату, ингибирование полимеразной цепной реакции компонентами биопроб (гемоглобином, гепарином и т. д.) – к ложноотрицательному.

Положительный результат - обнаружено
В исследуемом образце обнаружены ДНК возбудителя.Выявление ДНК при симптомах воспаления и отсутствии патогенных возбудителей свидетельствует о наличии специфической инфекции.Если ДНК возбудителей выявляется в небольшом количестве у людей без признаков патологии органов мочеполовой системы, это расценивается как носительство

Отрицательный результат - не обнаружено
Не найдено фрагментов ДНК, специфичных для исследуемых возбудителей или концентрация возбудителя в образце ниже границы чувствительности теста.

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
Денатурация
Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
Отжиг
Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами - изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.

Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки.
Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

Читайте также: