Методы лабораторной диагностики риккетсиозов

ВОЗБУДИТЕЛЬ И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА РИККЕТСИОЗОВ СОБАК

Риккетсиоз собак является зооантропонозным заболеванием, что обуславливает актуальность выбранной мной темы. Клещевой риккетсиоз описан в Восточной Сибири и на Дальнем Востоке (Приморский, Хабаровский, Красноярский края, Читинская и Иркутская области, Бурятия и Тува), в Западной Сибири (Кемеровская, Томская, Новосибирская, Омская, Тюменская, Курганская области, Алтайский край), Азербайджане, Казахстане, Туркмении, Таджикистане, Кыргызстане и Армении, в Монгольской Народной Республике и Пакистане. В Европейской части России (Тульская и Харьковская области, Башкирия) установлена циркуляция возбудителя в антропургических очагах, заболевания людей не описаны.

Цель исследования: изучить возбудителя и лабораторную диагностику риккетсиоза собак.

Характеристика заболевания. Риккетсиоз собак – острое лихорадочное заболевание собак и других видов животных семейства Canidae с генерализованным поражением лимфоидной системы, сопровождающаяся резким обезвоживанием, рвотой, депрессией, полным отсутствием аппетита, иногда сыпью в области живота, абортами. Летальность достигает 90%.

Клинические признаки: острый энтерит, диарея, рвота, отсутствие аппетита, увеличение лимфатических узлов, высока температура тела, иногда ринит, аборты, бесплодие, пневмония, сыпь на животе (рисунок 1) /1, 8/.

Рисунок 1 Сыпь на животе собак

Характеристика возбудителя.

Исследования этой группы микроорганизмов были начаты в 1906 Х. Риккетсом (рисунок 2) в Чикагском университете.

Морфология возбудителя.

Вид Neorickettsia helminthoeca

Строение риккетсий аналогично строению прочих бактерий. Риккетсии полиморфны. Все многообразие их форм может быть сведено к четырем основным морфологическим типам:

Тип а. Кокковидные риккетсии, это наиболее патогенный тип.

Тип в. Палочковидные, биполярные.

Тип с. Бациллярные, удлиненные, обычно изогнутой формы, выделяются в начальном периоде болезни.

Тип d. Нитевидные, полизернистые риккетсии имеют вид длинных причудливо прогнутых нитей.

Рисунок 2 Риккетс Ховард Тейлор

Риккетсии окрашиваются грамотрицательно (рисунок 3).

Рисунок 3 Окраска риккетсий по Граму

Лабораторная диагностика заболевания. Особенности взятия и пересылки материала. При риккетсиозах у животного берту 5 мл венозной крови и дефибринируют, также берут мочу, мокроту, смывы с объектов внешней среды. Собирают вшей и отправляют их в лабораторию в закрытой пробирке, заклеенной лейкопластырем /2/. Бактериологическая диагностика. Большое значение для морфологического их изучения имеют специальные методы окраски риккетсии, среди которых отличается своей информативностью метод Д.Л. Романовского с использованием красящего раствора Гимзы. Этот метод позволяет обнаружить все виды и формы вне- и внутриклеточных риккетсии, а также выявить их микроструктуру. Кроме метода Романовского, используют методы импрегнации серебром по М.А. Морозову, окраску по Маккиавелло в модификации П.Ф. Здродовского и др.

Результат окраски по Романовскому-Гимзе: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток — в голубой, ядра — в красный (рисунок 4).

Рисунок 4 Микроскопическая картина риккетсий, окрашенных по Романовскому-Гимзе

По Здродовскому риккетсии окрашиваются в рубиново-красный цвет, клеточные элементы – в голубой (протоплазмы) или синий (ядро) цвет. По Макиавелло риккетсии окрашиваются в красный цвет на синем фоне /4/.

Культуральные свойства. Патогенным риккетсиям свойственен внутриклеточный паразитизм. Риккетсии не культивируются на обычных питательных средах. Их репродуцируют на развивающихся куриных эмбрионах (рисунок 5), в культуре клеток или в организме лабораторных животных /3,6,7/.

Рисунок 5 Электронная фотография риккетсий, выращенных в желточном мешке куриного эмбриона

В настоящее время для накопления риккетсии широко используется метод культуры тканей. Оптимальная реакция среды рН 7,4-7,8. Обильное размножение риккетсии происходит в аэробных условиях при 35-37 °С /10/.

Биохимические и токсигенные свойства возбудителя. Риккетсии - аэробы, поглощают О² и выделяют СО², образуют гемолизины, активно окисляют глутаминовую кислоту, выделяя углекислый газ, но индифферентны к глюкозе, образуют эндотоксины /8,9/. Антигенное строение возбудителя. Бактерии имеют группоспецифический К-антиген, видоспецифический корпускулярный О-антиген /8/. Серологическая диагностика. В клинической практике применяют реакцию агглютинации, реакцию связывания комплемента, реакцию гемагглютинации. В лабораторной диагностике риккетсиозов важное место занимают люминесцентная микроскопия и люминисцентно-серологичский метод, а также электронная микроскопия /2,3/. Биопроба. Внутрибрюшинное или интратестикулярное (в толщу яичек) заражение исследуемым материалом морских свинок самцов, куриных эмбрионов в желточный мешок. Обнаружение риккетсий осуществляется в мазках-отпечатках внутренних органов, окрашенных по Романовскому-Гимзе или Здродовскому /1/.

Устойчивость возбудителя.Риккетсии являются малоустойчивыми к разным условиям окружающей среды: при нагревании до 50°С они погибают уже спустя 10 минут, а до 80°С — спустя 1 минуту.

При воздействии на риккетсий различных дезинфицирующих средств в обычных концентрациях их гибель наступает через 5 мин.

Риккетсии чувствительны к тетрациклину, дибиомицину, синтомицину, левомицетину и сульфаниламидам /3,6/.

Особенности специфической профилактики и иммунитет. Лечение антибиотиками тетрациклинового ряда.

Профилактика сводится к истреблению переносчиков инфекции - насекомых и грызунов, специфическая профилактика разработана только для нескольких видов риккетсий - живая сыпнотифозная вакцина.

У переболевших риккетсиозами животных развивается стойкий антитоксический, антибактериальный и перекрестный иммунитет к другим возбудителям риккетсиозов /5/.

Заключение

Риккетсиоз собак относится к природно-очаговым зоонозам. Основной источник инфекции – грызуны, собаки и другие животные, а переносчиками являются кровососущие членистоногие. Риккетсиозы – широко распространенные заболевания, регистрируемые на всех континентах. В развивающихся странах они составляют 15-25% всех лихорадочных заболеваний неясной этиологии. У собак при злокачественном течении риккетсиоза при отсутствии полноценно лечения летальность может достигать 90%. Для людей настоящее время риккетсиозы не представляют большой опасности, так как при своевременном лечении в подавляющем большинстве случаев наступает полное выздоровление.

Библиографический список

Аркадьева-Берлин, Н. Г. Лечение собак : справочник / Н. Г. Аркадьева-Берлин. – М.: Агропромиздат, 2005, 188 с.

Бессарабов, Б. Ф. Инфекционные болезни животных : учебник / Б. Ф. Бессарабов, Е. С. Воронин. – М.: КолосС, 2007. – 671 с.

Воробьев, А. А. Медицинская и санитарная микробиология : учеб. пособие / А. А. Воробьев, Ю. С. Кривошеин, В. П. Широкобоков. – М.: Медицина, 2003. – 487 с.

Данилов, А. Д. Болезни собак : справочник / А. Д. Данилов. – М.: Агропроимздат, 2000. – 368 с.

Еремеева, М. Е. Современные подходы к лабораторной диагностике риккетсиозов [Текст] / М. Е. Еремеева, С. Н. Шпынов, Н. К. Токаревич // Инфекция и иммунитет. – 2014. - №2. – С. 17.

Красинкова, Л. В. Микробиология : учеб. пособие / Л. В. Красинкова. – 3-е изд. – М.: Медицина, 2012. – 262 с.

Масимов, Н. А. Инфекционные болезни собак и кошек : учебник / Н. А. Масимов, С. С. Лебедько. – М.: Лань, 2009. – 128 с.

Рэмси, Я. К. Инфекционные болезни собак: практ. Руководство / Я. К. Рэмси, Д. Эдди, Б. Теннат. – М.: Аквариум-Принт, 2015. – 304 с.

Сутер, П. Болезни собак : учебник / П. Сутер, Б. Кон. – М.: Аквариум-Принт, 2008. – 816 с.

Шуляк, Б. Ф Руководство по бактериальным инфекциям собак. Грамотрицательные бактерии : учеб. пособие / Б. Ф. Шуляк. - 2-й том. – М.: ОЛИТА, 2003. – 608 с.

Полный текст:

1. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Гранитов В.М., Арсеньева И.В., Тарасевич И.В., Fournier P.-E. и др. Выявление альфа1-протеобактерий в иксодовых клещах и образцах от больных в России. Омский научный вестник. 2006; 3 (37): 32 - 37.

2. Mediannikov O.Yu., Sidel’nikov Yu., Ivanov L., Mokretsova E., Fournier P.-E., Tarasevich I. Acute tick-borne rickettsiosis caused by Rickettsia heilongjiangensis in Russian Far East. Emerg. Infect. Dis. 2004; 10 (5): 810 - 817.

3. Гранитов В.М., Арсеньева И.В., Бесхлебова О.В., Дедков В.Г., Карань Л.С., Васильева О.А., Шпынов С.Н. Первый клинический случай клещевого риккетсиоза, вызванного Rickettsia heilongjiangensis, на территории Сибири. Инфекционные болезни. 2014; 12 (3): 91 - 94.

5. Jia N., Jiang J.F., Huo Q.B., Jiang B.G., Cao W.C. Rickettsia sibirica subspecies BJ-90 as a cause of human disease. N. Engl. J. Med. 2014; 369 (12): 1176 - 1178.

6. Рудаков Н.В., Шпынов С.Н., Решетникова Т.А., Пеньевская Н.А., Абрамова Н.В., Кумпан Л.В. Новые данные о патогенности Rickettsia sibirica subsp. BJ-90. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014; 5: 10 - 13.

8. Shpynov S.N., Fournier R-E., Rudakov N.V., Samoylenko I.E., Reshetnikova T.A., Yastrebov V.K. et al. Molecular identification of a collection of spotted fever group rickettsiae obtained from patients and ticks from Russia. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2006; 74 (3): 440 - 443.

9. Еремеева М.Е., Шпынов С.Н., Токаревич Н.К. Современные подходы к лабораторной диагностике риккетсиозов. Инфекция и иммунитет. 2014; 4 (2): 113 - 34.

10. Рудакова С.А., Коломеец А.Н., Самойленко И.Е., Кузьминов А.М., Рудаков Н.В. Экспресс-индикация трансмиссивных патогенов как основа дифференцированного подхода к профилактике инфекций, передающихся иксодовыми клещами. Бюллетень СО РАМН. 2007; 4: 116 - 119.

11. Методические рекомендации. Эпидемиологический надзор за клещевым риккетсиозом. Иммунодиагностика заболевания и методы выявления возбудителя, утв. Минздравом СССР 22.10.91.

13. Brouqui R, Bacellar F., Baranton G., Birtles R.J., Bjodorff A., Blanco J.R. et al. Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10: 1108 - 1132.

14. Абрамова Н.В., Рудаков Н.В., Пеньевская Н.А., Седых Н.Н., Кумпан Л.В., Самойленко И.Е. и др. Апробация иммуноферментного анализа для серологической диагностики инфекций, вызываемых риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2010; 1 (50): 17 - 22.

15. Рудаков Н.В., Абрамова Н.В., Пеньевская Н.А., Самойленко И.Е., Шпынов С.Н., Решетникова Т.А. Способ лабораторной диагностики клещевого риккетсиоза с использованием иммуноферментного анализа для определения антител к антигену Rickettsia sibirica. Патент РФ № 2477860 от 20.03.2013 г.

16. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Тарасов В.А., Rarola R, Raoult D. Генотипирование риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки в клещах рода Dermacentor на территориях Омской и Новосибирской областей. Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: Материалы 2-й Регион. научно-практ. конф., посвящ. 80-летию ОГМА. Омск; 2001: 290 - 294.

17. Иголкина Я.П., Фоменко Н.В., Ливанова Н.Н., Астанин В.Б., Гостеева Л.А., Черноусова Н.Я., Рар В.А. Выявление различных видов риккетсий у иксодовых клещей, в крови людей и мелких млекопитающих на юге Западной Сибири и на Урале. Бюллетень сибирской медицины. 2006; 5 (1): 121 - 125.

18. Пуховская Н.М., Рар В.А., Иванов Л.И., Высочина Н.П., Иголкина Я.П., Фоменко Н.В. и др. Выявление методом ПЦР возбудителей природно-очаговых инфекций, переносимых клещами, на полуострове Камчатка. Мед. паразитол. и паразит. болезни. 2010; 4: 36 - 39.

19. Григорьева Я.Е., Карань Л.С., Рудакова С.А., Федорова М.В., Журенкова О.Б., Скрынник С.М. и др. Разработка набора реагентов для дифференциальной детекции патогенных риккетсий РРВ-ПЦР. Молекулярная диагностика. 2014; 1: 518, 519.

20. Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Ковалевский Ю.В., Горелова И.Б., Воробьева И.Н. Микроорганизмы порядка Rickettsiales у таежного клеща

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

Лабораторные методы исследования являются большим подспорьем в распознавании заболевания. Серологическая диагностика проводится с антигеном из риккетсий Бернета в реакции агглютинации и реакции связывания комплемента.

Реакция агглютинации часто бывает положительной уже к концу 1-й педели и почти всегда к концу 2-й недели заболевания. Реакция связывания комплемента становится положительной с 5—9-го дня заболевания или несколько позже. Обе реакции наиболее выражены на 3—5-й неделе заболевания, затем титр их снижается, по ой и продолжают оставаться положительными до 6—12 мес, иногда и дольше. У больных, леченных антибиотиками, антитела появляются и крови в более поздние сроки и в более низких титрах.

Метод серодиагностики является довольно простым и повсеместно доступным. Наиболее специфичной считается реакция связывания комплемента. Безусловно достоверным считается титр 1:80. При более низких первоначальных титрах следует учитывать динамику их нарастания.

Вместе с тем в ряде случаев при безусловной клинической и эпидемиологической диагностике Ку-лихорадки титр реакции связывания комплемента остается низким в течение всей болезни, а иногда она оказывается даже отрицательной (до 5% случаев).

Общепризнано, что серологические реакции при Ку-лихорадке (в противоположность другим риккетсиозам) бывают отрицательными со всеми типами протея (реакция Вейля—Феликса) и с возбудителями других риккетсиозов.

Антиген для реакции связывания комплемента выпускается в сухом виде и перед постановкой реакции его разводят в физиологическом растворе из расчета 50 млн. риккетсий на 1 мл.

При отдаленности лаборатории доставка материала возможна также в виде сухой капли сыворотки на бумаге. Для постановки внутрикожной аллергической пробы аллерген вводят на внутреннюю поверхность предплечья в дозе 0,1 мл, в разведении 1:10 — 1:5. Реакция считается положительной, если через 6—8 ч появляется гиперемия, затем отечность. Через 20-24 ч в центре гиперемии отмечается небольшой инфильтрат.

По данным как отечественных, так и зарубежных авторов, аллергическая проба еще более специфична, чем реакция связывания комплемента. Положительная реакция у больных выявляется на 3—8—10-й день заболевания и сохраняется в прослеженных случаях до 4 лет. Возможность более длительного сохранения реакции не исключена. Поэтому аллергическая проба при Ку-лихорадке имеет лишь вспомогательное значение, так как с ее помощью невозможно отличить текущее заболевание от имевшего место в прошлом. В эпидемиологической практике метод аллергической пробы может найти применение для ретроспективной диагностики.

Бактериологическая диагностика Ку-лихорадки является наиболее достоверным методом, однако проведение таких исследований требует специально оборудованной лаборатории и подготовленного персонала.

Для выделения возбудителя можно пользоваться кровью, спинномозговой жидкостью, мочой и мокротой (при легочной форме) больного; взятых в разгар заболевания. Материал в объеме 5 мл вводят внутрибрюшинно морской свинке весом 300—400 г, у которой затем ежедневно измеряют ректальную температуру. Если температура повышается более 39,5°, то производят дальнейшие пассажи здоровым морским свинкам 10% взвесью печени и селезенки больной морской свинки, так как в ряде случаев при первых пассажах обнаружить возбудителя не удается.

Возбудитель идентифицируется по обнаружению риккетсий в окрашенных мазках из тканей инфицированных животных, по результатам опытов перекрестного иммунитета, по наличию в сыворотке выздоравливающих морских свинок специфических комплементсвязывающих антител.

Более быстрым методом лабораторной диагностики является введение 0,25 мл 10% взвеси крови или селезенки в яичко здоровой морской свинки. При этом уже в первом пассаже можно обнаружить риккетсии в зараженном яичке на 7—10-й день заболевания.

Культивирование выделенных штаммов возможно также на 7-дневных куриных эмбрионах, которых заражают 0,5 мл 10% взвеси селезенки пассажной морской свинки.

При посылке материала в лабораторию рекомендуется (для сохранения возбудителя) помещать сгустки крови в химически чистый глицерин. Материал забирают в стерильных условиях.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Диагностика инфекций (infectio – перевод с латинского – заражение). Инфекционные заболевания человека представляют собой группу болезней, вызываемых специфическими болезнетворными возбудителями, которые могут передаваться от зараженного человека здоровому. Нередки и случаи передачи патогенных агентов человеку от носителей инфекций или заболевших животных (зоонозные заболевания). Следует отметить, что большинство зоонозных инфекционных заболеваний не передается от человека к человеку. У человека и животных (домашних и диких плотоядных) насчитывают более 300 общих инфекционных возбудителей, из которых более 80 заболеваний вызываются бактериями, свыше 100 – вирусами, около 20 - грибами, 80 заболеваний связано с заражением гельминтами и около 20 - простейшими.

Известны инфекционные болезни, вызываемые, так называемыми арбовирусами – вирусами, передающимися людям через укусы насекомых, например клещей, комаров, блох и др., которые инфицируются от домашних или диких животных. Самая распространенная известная арбовирусная инфекция – клещевой энцефалит. Вирус геморрагической лихорадки также передается клещами. Как известно, клещи являются переносчиками и бактериальных инфекций, например клещевого боррелиоза (болезнь Лайма) или туляремии, хотя туляремию относят к зоонозным заболеваниям, передающимся человеку при непосредственном контакте с больными животными (грызунами), а также при употреблении зараженных продуктов или воды (алиментарный путь заражения). Таким образом, для каждой инфекции у человека характерен свой возбудитель и определенный путь передачи. Возбудителями инфекций могут быть бактерии, вирусы, риккетсии (микроорганизмы, сочетающие в себе особенности бактерий и вирусов), спирохеты, грибки, протозойные (паразитирующие простейшие, одноклеточные), глисты, которые выводятся из организма больного человека или животного при выдохе, мочеиспускании, дефекации, кашле, рвоте, и когда при определенных условиях этот биологический патологический материал становится источником заражения здорового человека.

Согласно литературным данным в настоящее время известно 1415 возбудителей инфекционных и паразитарных болезней. Наиболее обширную группу составляют болезни, вызываемые бактериями и риккетсиями (538 нозологий). Второе место принадлежит паразитарным болезням - 353 нозологии. Вирусные инфекции составляют 217 нозологий. Постоянно возникают новые или впервые выявленные инфекционные заболевания. Так, начиная, с 1970-х голов ежегодно регистрируется, по крайней мере, одно инфекционное заболевание. За последние годы стали известны более 30 инфекционных заболевании, это и ВИЧ, легионеллез, эпидемический ротавирусный гастроэнтерит и ряд африканских лихорадок (например лихорадка Эбола).

В настоящее время существенную роль в распространении инфекционных болезней играет развитие туризма, а также миграционные процессы.

Классификация инфекционных заболеваний

Что касается классификации основных инфекционных болезней человека, то существуют разные системы группировки инфекционных заболеваний. В нашей стране одной из наиболее распространенных является классификация Л.В. Громашевского, построенная в зависимости от локализации возбудителя в организме и механизме его передачи, таких групп насчитывается 5:

• кишечные инфекции;
• инфекции дыхательных путей;
• кровяные инфекции;
• инфекции наружных покровов;
• инфекции с различными механизмами передачи, например передающиеся половым путем, воздушно-капельным путем (один из самых распространенных), фекально-оральный, контактный, трансмиссионный, вертикальный от матери к плоду, от матери к новорожденному в родовом акте, внесенные при операциях, инъекциях и т.п.)

Кроме того в РФ принята также международная более многоступенчатая классификация инфекционных заболеваний:

• кишечные инфекции;
• туберкулез;
• бактериальные зоонозы;
• другие бактериальные заболевания;
• полиомиелит и энтеровирусные болезни центрально нервной системы;
• вирусные заболевания, сопровождающиеся высыпаниями;
• вирусные заболевания,которые передаются членистоногими;
• другие вирусные заболевания;
• риккетсиозы и другие инфекции, передаваемые членистоногими;
• сифилис и другие венерические инфекции;
• заболевания. которые вызываются спирохетами;
• грибковые заболевания (микозы);
• гельминтозы;
• другие инфекции и паразитарные заболевания.

Инфекционные заболевания вызывают у пациента значительные изменения в картине крови, при многих инфекционных болезнях изменяется функция различных внутренних органов – печени, сердца, легких, мозга, почек, кишечника, практически все инфекционные заболевания протекают с изменениями широкого спектра биохимических параметров, отражающих различные стороны патогенеза. Установлено также, что, к примеру, вирусы краснухи, герпеса, коксаки, полиомиелита, цитомегаловирус и эховирусы (род энтеровирусов) могут вызывать серьезные нарушения в развитии плода и новорожденного. Кроме того в настоящее время есть основания считать, что некоторые группы вирусов могут быть виновниками возникновения диабета первого типа, к ним относят вирус Коксаки, вирус краснухи, реовирус 3 типа, вирус энцефаломиокардита, вирус эпидемического паротита, цитомегаловирус, вирус гепатита А.

Диагностика инфекций

Диагноз инфекционного заболевания основывается на анамнезе больного, эпидемиологическом анамнезе, включает инструментальные методы обследования и, как правило, диагностика инфекционных заболеваний не обходится без использования комплекса лабораторных методов. Диагностика инфекционного заболевания начинается с базовых лабораторных методов исследования: это – клинический анализ крови. Известно, например, что в клиническом анализе крови лейкоцитоз чаще всего выявляется в результате инфекционного заболевания, что многие вирусные, бактериальные и рикетсиозные болезни приводят к нейтропении (снижение нейтрофилов), а частой причиной лимфоцитоза и/или моноцитоза является инфекционный мононуклеоз.

Такой показатель крови, как скорость оседания эритрорцитотв (СОЭ), не являясь самостоятельным диагностическим показателем в силу своей неспецифичности, является индикатором общего неблагополучия и продолжает активно использоваться в медицинской практике для выявления и мониторирования инфекционных и воспалительных заболеваний различного происхождения.

Общий анализ мочи является лабораторным тестом, который часто используется при исследования инфекционных заболеваний не только почек, но и инфекций другой локализации.

Так некоторые инфекционные заболевания сопровождаются протеинурией нефротического типа (количество белка в моче не менее 3г/л). Например хронические инфекционные заболевания могут стать причиной нефротического синдрома. Развитие протеинурии нефротического типа могут вызвать, например, бактериальный эндокардит, туберкулез, сифилис, лепра, гепатит В и С, мононуклеоз, цитомегаловирусная инфекция, ветряная оспа, малярия, токсоплазмоз, шистосомиаз. Появление в моче бактерий и возникновение воспаления указывает на наличие инфекционного заболевания мочеполовой системы.

Достаточно эффективным при инфекционных заболеваниях является использование комплекса биохимических тестов, поскольку количественные и качественные изменения биохимических показателей в крови происходящие во время болезни, отражают происходящие при заболевании биохимические нарушения и позволяют следить за динамикой патологического процесса и адекватностью лечения.

К таким эффективным биохимическим параметрам, которые исследуются при инфекционных и воспалительных заболеваниях другого происхождения, например, относится – спектр белков сыворотки крови (белки острой фазы), ферменты и некоторые другие биохимические показатели. Использованием специфических лабораторных методов, например, при диагностике причин лихорадки неясного генеза, хронических инфекций выполняют ис.

В практической медицине часто требуется более глубокое лабораторное исследование с следования мазков из горла, посевы крови, мочи и других жидкостей и выделений организма для выявления бактерий, грибков, иногда, при изменениях характера стула, назначают исследования кала на яйца глист.

В настоящее время в лабораторной диагностике для выявления инфекционных возбудителей широко используются следующие специфические лабораторные методы:

• микроскопические методы, позволяющие идентифицировать инфекционного возбудителя в биологическом патологическом материале с помощью разнообразных типов микроскопов после приготовления окрашенных или нативных мазков.
• Культуральный (бактериологический) метод, который заключается в выделении чистой культуры возбудителя из патологического материала, с дальнейшей его идентификацией по морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным, токсикогенным (применяя специфические методы) свойствам и определение его чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам. Эти исследования часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания.
• Серологические исследования, в основе которых лежит специфическое взаимодействие антигена и направленных к нему антител. Эти исследования позволяют с диагностической целью определять (качественно и количественно) как антигены так и антитела к ним. Использование в лабораторной практике таких серологических методов как: ИФА(иммунофементный анализ), иммунофлюоресцентный, иммунофлюоресцентныф анализ - позволяет определять в крови больного антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (ИГ А, ИГ М, ИГ Ж). Существование определенной закономерности в динамике выработки специфических антител различных классов при инфекционном заболевании позволяет судить как о стадии так и об интенсивности инфекционного процесса.
• Молекулярно-биологические методы, к которым относится полимеразная цепная реакция (ПЦР-метод).

В основе ПЦР-диагностики лежит молекулярно-биологический метод амплификации (многократное копирование) малых фрагментов нуклеиновых кислот бактерий, вирусов, хламидий, микоплазменных и др. с помощью фермента ДНК- полимереразы. ПЦР-диагностика позволяет провести прямую идентификацию нуклеиновых кислот(РНК или ДНК), то есть генетического материала, инфекционного агента в различном биологическом материале.

Задача изобретения - повышение точности и упрощение технологии лабораторной диагностики КР путем выявления антител методом иммуноферментного анализа, позволяющего с высокой специфичностью и чувствительностью выявлять антитела к R. sibirica в сыворотке (плазме) крови человека в ранние сроки заболевания.

Сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что выявление антител в сыворотке (плазме) к возбудителю КР R. sibirica проводят при помощи непрямого иммуноферментного анализа на твердофазном носителе с использованием коммерческого диагностикума риккетсиозного Сибирика сухого для РСК. Данный диагностикум представляет собой лиофилизированные антигенные комплексы, выделенные методом эфирной обработки из R. sibirica, выращенных в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов и инактивированных фенолом. Применение одной схемы ИФА с двумя различными коньюгатами Polyclonal Rabbit Anti-Human IgM/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup и Polyclonal Rabbit Anti-Human IgG/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup, представляющими собой поликлональные иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена, позволяет выявлять иммуноглобулины классов М и G, т.е. проводить как раннюю, так и ретроспективную диагностику КР.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение иммуноглобулинов класса М к R. sibirica методом иммуноферментного анализа.

Для постановки ИФА используют следующее.

2. Раствор хлорида натрия 0,9% для разведения диагностикума риккетсиозного Сибирика.

3. Сыворотка лошадиная нормальная.

4. В качестве коньюгата - поликлональные иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов М человека, меченные пероксидазой хрена (Polyclonal Rabbit Anti-Human IgM/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup).

5. Субстратный буферный раствор - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин - в качестве хромогена, прозрачная бесцветная жидкость.

6. Фосфатно-солевой pH 7,3 (или карбонатно-бикарбонатный pH 9,6) буферный раствор для разведения образцов.

7. Фосфатно-солевой буферный раствор с твином 20 для отмывки.

8. Стоп-реагент - раствор серной кислоты 0,75 моль/л, прозрачная бесцветная жидкость.

9. Исследуемая сыворотка (плазма) крови.

10. Положительный контрольный образец, инактивированный, слегка опалесцирующая жидкость, полученная путем смешивания 5 положительных в РСК сывороток больных клещевым риккетсиозом людей.

11. Отрицательный контрольный образец, инактивированный, слегка опалесцирующая жидкость, полученная путем смешивания 10 сывороток здоровых людей (доноров).

Процедура выполнения ИФА.

Для сенсибилизации полистерола поверхностей лунок планшета используют диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК в разведении 1:4 в объеме 50 мкл в каждую лунку. Закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 18 часов при температуре +4°C или в условиях влажной камеры в течение 2 часов при температуре 37°C. Содержимое лунок удаляют без промывания планшета. Затем в лунки планшета вносят исследуемые сыворотки в объеме 50 мкл в разведениях от 1:10 до 1:50, приготовленных на 0,05 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH 7,3, содержащем 10% цельной лошадиной сыворотки. После внесения разведений сывороток закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 1 часа при температуре 37°C. Далее содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и лунки планшета промывают 3 раза рабочим промывочным раствором (фосфатно-солевой буфер) в объеме 350 мкл. Во все лунки планшета вносят по 50 мкл конъюгата - Polyclonal Rabbit Anti-Human лунки планшета вносят по 50 мкл конъюгата - Polyclonal Rabbit Anti-Human IgM/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup в разведении 1:1000. Для получения нужного разведения конъюгата используют 0,05М ФСБ pH 7,3, содержащий 10% цельной лошадиной сыворотки. После внесения конъюгата закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 1 часа при температуре 37°C. Далее, содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и лунки планшета промывают 5 раз рабочим промывочным раствором (фосфатно-солевой буфер) в объеме 350 мкл. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл субстратного буферного раствора (раствор тетраметилбензидина) и выдерживают 15 мин в защищенном от света месте при температуре 20°±2°C. Реакцию останавливают добавлением во все лунки планшета по 50 мкл стоп-реагента (0,75 моль/л раствор серной кислоты).

Пример 2. Определение иммуноглобулинов класса G к R. sibirica методом иммуноферментного анализа.

Для выполнения ИФА используют следующее.

2. Раствор хлорида натрия 0,9% для разведения диагностикума риккетсиозного Сибирика.

3. Сыворотка лошадиная нормальная.

4. В качестве конъюгата - поликлональные иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов G человека, меченные пероксидазой хрена (Polyclonal Rabbit Anti-Human IgG/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup).

5. Субстратный буферный раствор - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин - в качестве хромогена, прозрачная бесцветная жидкость.

6. Фосфатно-солевой буферный раствор pH 7,3 для разведения образцов.

7. Фосфатно-солевой буферный раствор с твином 20 для отмывки.

8. Стоп-реагент - раствор серной кислоты 0,75 моль/л, прозрачная бесцветная жидкость.

9. Исследуемая сыворотка (плазма) крови.

10. Положительный контрольный образец, инактивированный, слегка опалесцирующая жидкость, полученная путем смешивания 5 положительных в РСК сывороток больных клещевым риккетсиозом людей.

11. Отрицательный контрольный образец, инактивированный, слегка опалесцирующая жидкость, полученная путем смешивания 10 сывороток здоровых людей (доноров).

Процедура выполнения ИФА.

Для сенсибилизации полистерола поверхностей лунок планшета используют диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК в разведении 1:4 в объеме 50 мкл в каждую лунку. Закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 18 часов при температуре +4°C или в условиях влажной камеры в течение 2 часов при температуре 37°C. Содержимое лунок удаляют без промывания планшета. Затем в лунки планшета вносят исследуемые сыворотки в объеме 50 мкл в разведениях от 1:10 до 1:50, приготовленных на 0,05М ФСБ pH 7,3, содержащем 10% цельной лошадиной сыворотки. После внесения разведений сывороток закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 1 часа при температуре 37°C. Далее содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и лунки планшета промывают 3 раза рабочим промывочным раствором (фосфатно-солевой буфер) в объеме 350 мкл. Во все лунки планшета вносят по 50 мкл конъюгата - Polyclonal Rabbit Anti-Human IgG/HRP, Dako Denmark A/S Produktionsvei 42 Denmark DK-2600 Glostrup в разведении 1:1000. Для получения нужного разведения конъюгата используют 0,05М ФСБ pH 7,3, содержащий 10% цельной лошадиной сыворотки. После внесения конъюгата закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 1 часа при температуре 37°C. Далее, содержимое лунок удаляют в емкость для сбора инфицированного материала и лунки планшета промывают 5 раз рабочим промывочным раствором (фосфатно-солевой буфер) в объеме 350 мкл. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл субстратного буферного раствора (раствор тетраметилбензидина) и выдерживают 15 мин в защищенном от света месте при температуре 20°±2°C. Реакцию останавливают добавлением во все лунки планшета по 50 мкл стоп-реагента (0,75 моль/л раствор серной кислоты).

Пример 3. Оценка эффективности предлагаемого способа определения антител к R. sibirica.

- прогностическая ценность позитивного результата ПЦП+=а/(а+b);

- прогностическая ценность негативного результата ПЦН-=d/(с+d),

'b' - число положительных проб сывороток крови в группе клинически здоровых лиц;

'd' - число отрицательных проб сывороток крови в группе клинически здоровых лиц.

Показано, что у большинства больных (77,8%) для подтверждения диагноза КР достаточно исследовать в ИФА только первую сыворотку крови на наличие IgM к R. sibirica. Исследование парных сывороток на наличие IgM и IgG повышает подтверждаемость диагноза до 100%.

Сравнительная оценка РСК и ИФА показывает, что оба метода обладают высокой специфичностью, однако, РСК значительно уступает ИФА в чувствительности, особенно при исследовании парных сывороток (52,9% и 91,7% соответственно), что имеет важное диагностическое значение.

Способ лабораторной диагностики клещевого риккетсиоза, заключающийся в определении иммуноглобулинов классов М и G к возбудителю клещевого риккетсиоза (Rickettsia sibirica) в сыворотке крови пациентов методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием диагностического антигена и оценку результатов по оптической плотности, отличающийся тем, что в качестве антигена для сенсибилизации полистирола лунок планшета используют диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК, в случае определения иммуноглобулинов М в качестве конъюгата применяют поликлональные иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена, в случае определения иммуноглобулинов G в качестве конъюгата используют поликлональные иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов G человека, меченные пероксидазой хрена, а расчет результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 450 нм, при этом проба считается положительной, если оптическая плотность анализируемой сыворотки выше значения рассчитанного по формуле:(ОП+ОП)/2+0,2,где 0,2 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки,ОП - оптическая плотность контроля конъюгата,ОП - оптическая плотность отрицательного контроля.