Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота диссертация

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Распространение, особенности проявления и усовершенствование схем специфической профилактики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в Свердловской области

На правах рукописи

КУШНИР НАТАЛЬЯ ИВАНОВНА

РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СХЕМ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В СВЕРДЛОВСКОЙ ОБЛАСТИ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, икология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Работа выполнена в ГУ Свердловская научно-исследовательская ветеринарная станция

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Глотов Александр Гаврилович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Колосов Александр Алексеевич,

кандидат биологических наук Шестопалов Александр Михайлович

Ведущая организация: Краснодарский научно-исследовательский

диссертационного совета Д.006.045.01. в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН

Ученый секретарь диссертационного совета

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время меняется стратегия ведения животноводства. В этой связи очевидны изменения в проявлении болезней животных, в том числе и вирусных респираторных. С ликвидацией крупных промышленных комплексов по откорму молодняка крупного рогатого скота (КРС) теряют значение и остроту проявления многие вирусные заболевания. В настоящее время актуальным является изучение проявления вирусных болезней в племенных, товарных хозяйствах молочного направления, частных подворьях и др.

Часто наряду с респираторными болезнями молодняка и взрослых животных незаразного происхождения во многих хозяйствах регистрируют вирусные заболевания: инфекционный ринотрахеит-пустулезный вульвовагинит (ИРТ КРС), вирусная диарея-болезнь слизистых (ВД КРС), парагрипп-3 (ПГ-ЗКРС) и другие. Они могут протекать смешанно и вызываться несколькими возбудителями вирусной природы в различных сочетаниях, а также с участием пастерелл, сальмонелл, диплококков, микоплазм и других микроорганизмов (W.D.G. Yates, 1984; RW. Fulton et al., 2004).

Многие исследователи отводят первичную этиологическую роль в развитии респираторных болезней вирусам, среди которых вирус ИРТ КРС является ведущим патогеном (Н.Н. Крюков и соавт., 1984; К.П. Юров и соавт., 2001; А.Г. Шипицын., 2001; В .А. Мищенко и соавт., 2001; Н.Ю. Басова, 2002; W.D.G. Yates, 1984; K.W.T Jericho et al., 1986; V. Moening et al., 2000; O.C. Stroub, 2001).

ИРТ КРС регистрируется во многих областях Российской Федерации и странах СНГ (П.А. Красочко, 1991; П.Н. Пыталев, 1996; А.И. Салимов, 1997; О.Г. Петрова и соавт., 1999; А.Г. Высокопоясный и соавт., 2000; Н.И. Закутский, 2000).

Значительную роль в распространении инфекции играют животные-вирусоносители, у которых заболевание протекает в латентной форме. Феномен латенции при ИРТ КРС приводит к неконтролируемому распространению возбудителя во внешней среде. Особенно опасны в этом плане быки-производители (Е.А. Андреев, 1984; Г.Э. Фарботко и соавт., 1994; V. Bitsch, 1984; Al de Gee et al., 1996; G. Van Shchaik, 1998; O.C. Stroub, 2001).

В связи с этим изучение особенностей распространения и течения ИРТ КРС имеет большое значение при планировании оздоровительно-профилактических мероприятий (А.Г. Глотов и соавт., 2001).

Борьба с заболеванием представляет сложную проблему, эффективность которой во многом зависит от наличия средств специфической профилактики (Н.Н.Крюков, 1980). В настоящее время вакцинопрофилактика является единственным специфическим средством борьбы с ИРТ КРС (В. А. Мищенко и соавт, 1999; O.C.Stroub, 2001; S. Trapp et al., 2003; В. Gehrmann et al., 2003; R.W. Fulton et al., 2004).

Доказано, что вакцинация латентно инфицированных быков-производителей инактивированными вакцинами по общепринятой схеме не предотвращает скрытое носительство полевого штамма, однако может снижать частоту выделения вируса со

Збиблиотска С.Пстгр$ OS

В практических условиях при проведении оздоровительных мероприятий большое значение имеет не только тип вакцин, но и рациональные схемы их использования (О.Г. Петрова, 2002; Н.Ю. Басова, 2002; V. Moening et al., 2000; S. Trapp et al., 2003; RW. Fulton et al., 2004).

При этом большое значение имеет способ введения антигенов. Показано, что эффективность трансфекции в коже выше, чем в мышцах (S. Van Drunen Little Vad-Den Hurk et al., 1998; RR.Uwiera et al., 2001). В последние годы трансдермальный маршрут введения вакцин, привлекает к себе большое внимание исследователей (Babiuk S et al., 2000).

Разработанные и усовершенствованные на этой основе схемы специфической профилактики инфекционных болезней обеспечивают формирование однородного иммунного ответа у разных возрастных групп крупного рогатого скота путем их вакцинации в определенные физиологические и возрастные периоды.

Цель и задачи исследований. Изучить распространение и особенности проявления ИРТ КРС и сопутствующих вирусных болезней в Свердловской области и усовершенствовать схемы специфической профилактики заболевания.

Для достижения указанной цели, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение ИРТ КРС в Свердловской области, установить роль быков-производителей в эпизоотологии заболевания и роль вируса ИРТ КРС в этиологии массовых респираторных и гинекологических заболеваний КРС;

2. Усовершенствовать и изучить противоэпизоотическую эффективность схемы специфической профилактики ИРТ КРС и сопутствующих вирусных заболеваний, основанной на сочетанном применении аттенуированной и инактивированной вакцин;

3. Разработать схему иммунизации инфицированных быков-производителей против ИРТ КРС и изучить ее эффективность в контролируемом опыте.

1. Доказано широкое распространение ИРТ КРС на территории Свердловской области, подтверждены роль быков-вирусоносителей в эпизоотологии заболевания и ведущая роль вируса ИРТ КРС в этиологии массовых респираторных болезней телят.

2. В контролируемых опытах доказана противоэпизоотическая эффективность усовершенствованной схемы специфической профилактики ИРТ КРС и сопутствующих вирусных болезней, основанной на сочетанном применении аттенуированной и инактивированной вакцин.

3. Впервые разработана схема иммунизации инфицированных быков-производителей, предусматривающая внутрикожное введение инактивированной вакцины, способствующая снижению частоты выделения вируса, ИРТ КРС со спермой и в контролируемом опыте изучена ее эффективность.

Практическая значимость работы. Материалы диссертации использованы при составлении:

Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, дают возможность расширить научные знания относительно роли и места специфической профилактики в системе мероприятий против ИРТ КРС и сопутствующих вирусных инфекций и могут быть использованы при дальнейшем изучении эпизоотологии заболевания.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 8 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 17 таблицами. Список литературы включает 207 источников, в том числе 133 зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Особенности распространения и проявления ИРТ КРС в Свердловской области.

2. Противоэпизоотическая эффективность усовершенствованной схемы специфической профилактики ИРТ КРС и сопутствующих вирусных болезней, основанной на сочетанном применении аттенуированной и инактивированной вакцин.

3. Эффективность усовершенствованной схемы иммунизации быков-производителей, инфицированных вирусом ИРТ КРС.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Культура клеток. Освежение, пассирование, титрование и наработку вирусов ИРТ и ВД КРС проводили в перевиваемой линии культуры клеток MDBK (почка телёнка), которую получали из лаборатории культур клеток и питательных сред ВИЭВ.

Пробы сыворотки крови. Для ретроспективной диагностики ИРТ КРС и других вирусных инфекций пробы сыворотки от подозреваемых в инфицировании животных отбирали однократно, а от больных - двукратно с интервалом 20-23 дня для установления сероконверсии (4-х и более кратного прироста тиров специфических антител). От животных, находящихся в опыте, пробы сыворотки отбирали по схемам, приведенным в соответствующих разделах диссертации. Пробы хранили при - 20°С и исследовали одновременно.

Выявление антигемагглютинирующих антител к вирусу ПГ-3 КРС проводили в реакции торможения гемагглютинации по общепринятой методике с эритроцитами морской свинки с использованием коммерческих диагностических наборов.

В процессе работы исследовали 25089 проб сыворотки крови от быков, коров-матерей, телок, телят.

Для бактериологических исследований, которые проводили по общепринятым методикам, использовали МПА, МПБ, тиогликолевую и дифференциально-диагностические среды: Сабуро, Олькеницкого, Левина, ВСА.

При изучении эпизоотической ситуации на племпредприятиях использовали следующий принцип отбора проб спермы: от выявленных нами в качестве инфицированных рабочих быков серии спермы, полученные в течение месяца, объединяли и исследовали как одну пробу. При отборе проб исходили из остатка запасов спермы, хранящейся на племпредприятиях на момент проведения исследований.

Всего методом молекулярной гибридизации исследовали 1342 пробы семени быков - производителей и 419 проб биоматериала от коров, телок и телят.

Пробы биоматериала поступали из 81 хозяйства, где регистрировали вспышки острых респираторных заболеваний крупного рогатого скота.

В опытах на инфицированных быках-производителях использовали коммерческую инактивированную вакцину против ИРТ КРС.

Критерием для применения аттенуированной вакцины в племенных и товарных хозяйствах служило их неблагополучие по ИРТ КРС и другим вирусным инфекциям, установленное в серологических реакциях. Кроме того вакцины начинали использовать только в случае установления диагноза лабораторными методами, включающими выявление вируса и выявление 4-х и более кратного прироста титров специфических антител в соответствующих серологических реакциях.

В эксперименты по отработке эффективности схем иммунизации при ИРТ КРС было включено 41 хозяйство Свердловской области, среди них 16 племенных.

При изучении эпизоотологии заболевания анализировали данные, полученные отделом эпизоотологии ГУ СНИВС и непосредственно автором во время эпизоотологических исследований в неблагополучных по острым респираторным инфекциям хозяйствах, данные ветеринарной отчетности за 2000-2003 гг.

При разработке схем иммунизации животных использовали результаты собственного ретроспективного анализа эпизоотической ситуации, проведенных экспериментов, а также производственных опытов и наблюдений, и литературных данных многих авторов.

Математические расчеты. Достоверность результатов подтверждали путем статистической обработки и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р 0,05).

Таблица 11. Частота выделения вируса ИРТ КРС со спермой быков-

производителей до введения инактивированной вакцины по _усовершенствованной схеме_

№ Кол-во Средний тир Инфицированност

группы исследованных вируснейтрализующих ь серий спермы, %

серий спермы антител по группе, (М±м)

1 84 2,6±0,4 36,8+1,5

2 84 1,4±0,8 30,2+0,1

3 72 1,5±0,4 52,7+0,4

4 84 1,6±0,4 35,0+0,5

В среднем по группам 2.7±1,2 38,4+0,1

Таблица 12. Частота выделения вируса ИРТ КРС со спермой быков-производителей после введения инактивированной вакцины по _усовершенствованной схеме_

№ группы Кол-во исследованных серий спермы Средний тир вируснейтрализующих антител по группе (М±м) Ь Инфицированность серий спермы, %

1 84 2,4±0,4 17,5+0,6

3 72 2,25±0,5 11,4+2,6

В среднем по группам 2,71 ±0,5 7,8+1,0

У животных 2 группы до вакцинации выявили ДНК вируса ИРТ КРС в 30,2 % исследованных проб, а после введения вакцины вирус не обнаруживали вообще, т.е. выявление ДНК вируса уменьшилось в 30,2 раза. Такой низкий процент выявления вируса, видимо, связан с тем, что частота выделения вируса у этих быков до вакцинации была низкой (1-2 раза в месяц). Средние значения титров вируснейтрализующих антител у быков этой группы повысились на 2,2 ±0,28

У быков 3 группы до вакцинации выявили ДНК вируса ИРТ КРС в 52,7% полученных проб, а после цикла иммунизации его обнаруживали в 11,4 % исследованных проб, т.е. выявление ДНК вируса уменьшилось в 4,6 раз. Средние значения титров вируснейтрализующих антител у животных этой группы также повысились за период наблюдения незначительно (Р>0,05).

Быки четвертой группы до вакцинации ДНК ИРТ КРС выделяли вирус в 35,0% всех полученных проб спермы, а после нее процент инфицированности спермы у животных этой группы составил 2,4 % т.е. частота выделения вируса уменьшилась в 14,6 раз. Средние значения титров вируснейтрализующих антител у животных этой группы также повысились за период наблюдения незначительно (Р>0,05).

Полученные результаты позволили сделать заключение, что схемы, предусматривающие введение инактивированной вакцины внутрикожно в дозе 0,4 мл один раз в месяц и подкожно 1 раз в 4 месяца являются наиболее эффективными и позволяют контролировать процесс выделения вируса со спермой у латентно инфицированных быков-производителей.

Таким образом, комплекс мероприятий, основанный на применении современной диагностической тест-системы и усовершенствованной схемы специфической профилактики ИРТ КРС, апробированный и рекомендуемый нами для племпредприятий, племенных и товарных хозяйств по производству мясомолочной продукции, позволяет контролировать эпизоотическую ситуацию в них и значительно снизить экономический ущерб от ИРТ КРС, а также других вирусных респираторных инфекций.

2. ИРТ КРС широко распространен в племенных, товарных и частных хозяйствах Свердловской области. Инфицированность животных по данным 2000 года составляла в среднем 88,5%. Наибольшее распространение заболевание (до 100%) имело в восточных и юго-восточных районах области. Это связано с интенсивностью ведения животноводства, наличием импортированного скота и широким охватом искусственным осеменением животных. На юге незначительное распространение заболевания (до 40-60%) было связано с небольшим количеством животноводческих ферм, а также слабым охватом животных искусственным осеменением.

3. ИРТ КРС в хозяйствах Свердловской области протекал в ассоциации вирусными и бактериальными инфекциями. Встречаются ассоциации: ИРТ, ВД -БС, ПГ - 3 КРС (33,8 % обследованных хозяйств); ИРТ, ПГ - 3, хламидиоз (9,5 %) и другие. Наличие диагностического прироста титров вируснейтрализующих антител выявляемое у больных животных к вирусу ИРТ КРС, а также наиболее частое его выделение от больных животных (59%) свидетельствует о его ведущей роли в данных ассоциациях. В качестве осложняющего этиологического агента выделялись сальмонеллы (до 60%), диплококки (27%) и пастереллы с пониженной вирулентностью (до 30%).

1. Характеристика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС).

1.1. Эпизоотология ИРТ КРС.

2. Латентная форма ИРТ КРС, её влияние на специфическую профилактику, эпизоотологическое значение и роль быков — производителей в эпизоотологии ИРТ КРС.

3. Применение ДНК-зондов для диагностики ИРТ КРС.

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

240 руб. | 75 грн. | 3,75 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Глотова Татьяна Ивановна. Инфекционный ринотрахеит и вирусная диарея крупного рогатого скота : 16.00.03, 16.00.04 Глотова, Татьяна Ивановна Инфекционный ринотрахеит и вирусная диарея крупного рогатого скота (диагностика, молекулярно-биологические свойства возбудителей, эффективность противовирусных препар: дис. . д-ра биол. наук : 16.00.03, 16.00.04 Новосибирск, 2006 364 с. РГБ ОД, 71:06-3/285

Содержание к диссертации

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 17

1. Характеристика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

2. Латентная форма инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, ее влияние на диагностику, специфическую профилактику заболевания и эпизоотологическое значение

3. Структура и функционирование генома вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

4. Методы молекулярной биологии и их использование в диагностике и молекулярной эпизоотологии инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

4.1. Рестрикционное картирование 26

4.2. Исследования по молекулярной эпизоотологии инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

4.3. Конструирование молекулярных зондов для выявления нуклеотидных последовательностей вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и их применение для диагностики болезни

4.4. Разработка и применение полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого

4.5. Методы оценки полиморфизма ДНК 37

5. Иммунный ответ на инфекцию вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

6. Экспериментальные инфекции, вызванные вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

7. Характеристика вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота

8. Особенности клинического проявления вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота

9. Особенности патогенеза вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота

10. Серологическая диагностика вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота

11. Экспериментальные инфекции, вызванные вирусом вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота

12. Иммунология вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота

12.1. Иммуносупрессивное действие нецитопатогенных и цитопатогенных биотипов вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота

12.2. Подавление врожденного иммунитета с последующим установлением персистентной инфекции

13. Роль вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых в развитии респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота

13.1. Влияние вирусов на клетки эпителия респираторных путей

13.2. Влияние вирусов на иммунные механизмы 67

14. Применение противовирусных препаратов при инфекционном ринотрахеите и вирусной диарее болезни слизистых крупного рогатого скота

15. Заключение по обзору литературы 80

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 84

1. Материалы и методы 84

2. Результаты исследований 100

2.1. Усовершенствование методики постановки реакции нейтрализации для серологической диагностики вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота

2.2. Распространение инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота в хозяйствах Сибири

2.3. Спектр возбудителей инфекционных заболеваний, выделенных от больных телят, в неблагополучных по инфекционному ринотрахеиту крупного рогатого скота хозяйствах

2.4. Выделение и характеризация изолятов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота от животных в Сибири

2.5. Выделение и характеризация изолятов вируса вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота от животных в Сибири

2.6. Разработка диагностической ПЦР для выявления вируса ИРТКРС

2.7. Сравнительная эффективность полимеразной цепной реакции, молекулярной гибридизации и метода выделения вируса в культуре клеток в диагностике ИРТКРС

2.8. Типирование Российских штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС при помощи ГЩР-ПДРФ-анализа

2.9. Сравнительное изучение патогенности штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС на естественно восприимчивых животных

2.10. Патогенность изолятов вируса вирусной диареи- болезни слизистых крупного рогатого скота для естественно восприимчивых животных в зависимости от их интерферон индуцирующей активности

2.11. Смешанная экспериментальная инфекция телят, вызванная вирусами инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота

2.12. Противовирусная активность препаратов различных классов в опытах in vitro в отношении вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота

2.13. Лечебно-профилактическая эффективность препарата 1-фенил-2,3-диметил-4-йодпиразолон в опытах на животных с использованием экспериментального заражения вирусами инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 223

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 256

Введение к работе

Актуальность проблемы. Среди многообразия вирусных агентов, вызывающих патологию у крупного рогатого скота (КРС), вирусы инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС) занимают особое место в связи с многообразием клинических проявлений и тяжестью течения болезней, вызываемых ими (Н.Н. Крюков и соавт. 1984; К.П. Юров и соавт., 2003; W.D.G. Yates, 1984; D. Deregt et al, 1995; A.L.E. Lindberg, 2003).

Многие исследователи отводят первичную этиологическую роль в возникновении массовых респираторных болезней молодняка КРС этим вирусам, т.к. инфицированные ими животные становятся восприимчивыми к развитию секундарной микрофлоры и осложнению инфекционного процесса (Н.Н. Крюков и соавт, 1984; Е.В. Андреев, 1984; W.D.G. Yates, 1984; L.A. Babiuk et al, 1991; RW. Fulton et al, 2004). Роль вирусов заключается в разрушении клеток эпителия респираторных путей (V.Fainstein et al, 1980), понижении активности бактериостатических механизмов в легких, воздействии на макрофаги и полиморфно-ядерные нейтрофилы, лейкоциты и Т4+-лимфоциты и изменении их функций (G. J. Jakab, 1983; Н. B.Ohmann et al, 1985; L.A. Babiuk et al, 1988; M. T. Winkler, 1999).

ИРТ и ВД-БС КРС регистрируются во многих регионах РФ и странах СНГ и причиняют значительный экономический ущерб мясному и молочному скотоводству (П.А. Красочко, 1991; О.Г. Петрова и соавт, 1999; А.Г. Высокопоясный и соавт, 2000; Н.И. Закутский, 2000; В.А. Мищенко и соавт, 2001; Н.Ю. Басова, 2002; К.П. Юров и соавт, 2003).

Латентная и персистентная формы у этих болезней осложняют проведение профилактических мероприятий, т.к. приводят к неконтролируемому распространению возбудителя во внешней среде, где немаловажную роль играют животные-вирусоносители (Е.А. Андреев, 1984; А.Г. Глотов, 1999; G. Van Shchaik, 1998). Учитывая длительную персистенцию возбудителя на уровне популяции крупного рогатого скота, определение вирулентности изолятов вирусов вызывает большой научно-практический интерес исследователей всего мира (М. Ackennann, 2001).

В настоящее время необходима разработка и внедрение простых, высокочувствительных и специфичных методов, выявляющих возбудителя на любой стадии заболевания, основанных на определении в биоматериале нуклеиновых кислот (молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) становится одним из важных диагностических тестов в ветеринарной вирусологии (S.Belak. et al.,1993). Метод имеет явные преимущества в скорости и чувствительности по сравнению с традиционными вирусологическими методиками, а при высокой специфичности его значение для ветеринарной практики возрастает.

В научной литературе есть сообщения о разработке и использовании ПЦР для выявления ДНК вируса ИРТ КРС в сперме быков (M.Wiedmann,1993; R.S.Kataria,1997; J. Rola et al, 1999), культуральной жидкости (B.P. Sreenivasa et al., 1996), полевых изолятах (S.Moore et al., 2000).

В качестве мишеней амплификации выбирались гены гликопротеинов (М. Fuchs et al., 1999; С. Ros et al, 1999), тимидинкиназы (S. Moore et al., 2000), использовалась или стратегия гнездовой ПЦР, или ПЦР в комбинации с блот-гибридизацией (F.S. Kibenge et al., 1993; R.S.Kataria, 1997).

С введением в практику ветеринарной вирусологии метода рестрикционного анализа появилась возможность дифференцировать вирус ИРТ КРС (BHV-1) на подтипы (1.1, 1.2 а/в и 1.3), различающиеся по вирулентности (М. Engels et. al., 1981; A. Metzler, et. al., 1985). Впоследствии штаммы BHV-1.3, были реклассифицированы в отдельный тип BHV-5 (В. Roizman et al., 1995). Метод имеет ограниченное диагностическое значение, но успешно используется при эпизоотологических исследованиях. К сожалению, он обладает некоторыми недостатками, главным из которых является необходимость наработки большого количества вирусной ДНК.

Существование геномных вариантов вируса необходимо учитывать при разработке диагностических ПЦР-тест-систем (C.Ros, S.Belak, 1999). Для дифференциации между вариантами различных вирусов широко используются методы оценки полиморфизма ДНК, в частности, ПЦР-ПДРФ анализ (С. Херрингтон и соавт, 1999).

Актуальным в настоящее время представляется изучение возможности использования противовирусных препаратов различных классов для профилактики и лечения больных животных (М.М. Зубаиров, 1998).

Противовирусные препараты с успехом используются при лечении герпесвирусных инфекций человека (И.Ф. Баринский и соавт., 1986, Е. De Clerq, 2001). Данных о применении их для профилактики и терапии ИРТ и, особенно, ВД-БС у крупного рогатого скота недостаточно.

Возбудитель ВД-БС КРС представлен 2 биотипами, цитопатогенным и нецитопатогенным (A.L.E. Lindberg, 2003). Клинические проявления болезни у КРС зависят от биотипа вируса и определяются наличием интерферона (ИФН) 1 типа и его активности. Формирование персистентной формы болезни у плода происходит в период его внутриутробного развития до 150 дней нецитопатогенным вариантом вируса за счет ингибирования синтеза этого белка (М. Schweizer et al., 1999; N. Grandvaux et al., 2002). Цитопатогенные штаммы вируса, напротив, индуцируют выработку интерферона в организме животных в высоких титрах, что, по мнению C.R. Rinaldo et al. (1976) и SJ.Skidmore (1987), является косвенным свидетельством их патогенности.

Цель и задачи исследований. Цель работы: разработка способов диагностики, изучение молекулярно-биологических свойств возбудителей и научное обоснование применения противовирусных препаратов при инфекционном ринотрахеите и вирусной диарее крупного рогатого скота. Для достижения указанной цели были поставлены задачи: 1 .Усовершенствовать методику постановки реакции нейтрализации в культуре клеток микрометодом для ретроспективной серологической диагностики ВД-БС КРС. Изучить распространение ИРТ и ВД-БС КРС в Сибири, установить роль вирусов в этиологии массовых респираторных болезней молодняка КРС и выявить ассоциации вирусов, возникающие при вспышках массовых респираторных болезней;

2. Разработать ПЦР для выявления вируса ИРТ КРС и изучить ее сравнительную диагностическую эффективность, а также способ типирования и дифференциации штаммов и изолятов вируса при помощи ПЦР-ПДРФ-анализа;

3. Изучить некоторые молекулярно-биологические свойства штаммов и изолятов вирусов, выделенных от больных и инфицированных животных. В условиях контролируемых экспериментов определить их сравнительную патогенность для естественно восприимчивых животных в зависимости от генотипа и интерфероногенной активности, а также воспроизвести острую смешанную бронхопневмонию вирусной этиологии и изучить ее клинические проявления;

4. Изучить противовирусную активность препаратов различных классов, а также экзогенного интерферона в отношении вирусов ИРТ и ВД-БС КРС в опытах in vitro, а наиболее эффективных из них в экспериментах in vivo.

1. Усовершенствована методика постановки реакции нейтрализации в культуре клеток микрометодом для ретроспективной серологической диагностики ВД-БС КРС. Установлено широкое распространение ИРТ и ВД-БС КРС в Сибири и подтверждена ведущая роль вирусов в возникновении массовых респираторных болезней телят вирусной этиологии в крупных хозяйствах племенного и молочного направления. Установлена взаимосвязь между концентрацией поголовья, серопозитивностью и частотой выделения вирусов от больных животных. Изучены ассоциации вирусов, возникающие при массовых вспышках респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота.

2. Разработана ПЦР для выявления вируса ИРТ КРС и изучена ее сравнительная диагностическая эффективность, а также способ типирования и дифференциации вируса при помощи ПЦР-ПДРФ-анализа. Проведено типирование штаммов и изолятов вируса, разработан способ дифференциации аттенуированного вакцинного штамма ТК-А от полевых штаммов и изолятов вируса.

3. Изучены некоторые молекулярно-биологические свойства изолятов вирусов ИРТ и ВД-БС КРС, выделенных от больных и инфицированных животных. В условиях контролируемых экспериментов показана взаимосвязь генотипа вируса ИРТ КРС и интерфероногенной активности вируса ВД-БС КРС с их патогенностью для естественно восприимчивых животных, а также воспроизведена острая смешанная вирусная болезнь и показано усиление патогенных свойств вируса ИРТ КРС на фоне размножения вируса ВД-БС КРС.

4. Установлена противовирусная активность препаратов различных классов в отношении вирусов ИРТ и ВД-БС КРС в опытах in vitro. Показана профилактическая эффективность 1-фенил-2,3-диметил-4 йодпиразолона в контролируемых опытах на экспериментально зараженных телятах 4-6-месячного возраста.

Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации использованы при составлении:

Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, создают перспективы использования ПНР не только в диагностике ИРТ КРС, но и в молекулярной эпизоотологии болезни и могут быть использованы для оптимизации противоэпизоотических мероприятий с целью дифференциации аттенуированного вакцинного штамма от полевых штаммов и изолятов вируса. Полученные данные также дают возможность расширить научные знания относительно роли вирусов в возникновении массовых респираторных болезней телят и могут быть использованы при дальнейшем изучении иммунологии и патогенеза инфекций, вызванных герпес- и пестивирусами. Результаты исследований открывают перспективы применения противовирусных препаратов для профилактики вирусных инфекций и могут быть использованы в практике при разработке оздоровительно-профилактических мероприятий.

Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены Подсекцией инфекционной патологии при ИЭВСиДВ (прот. № 5, 20.10.2005) и Ученым Советом ГНУ ИЭВСиДВ (прот. № 9, 20.10.2005).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 320 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 20 таблицами. Список литературы включает 515 источников, в том числе 364 зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Модифицированный метод серологической диагностики ВД-БС КРС, распространение и особенности эпизоотической ситуации при ИРТ и ВД-БС КРС в Сибири;

- Молекулярно-биологические свойства изолятов вирусов ИРТ и ВД- БС КРС, выделенных от больных и инфицированных вирусами животных и их сравнительная патогенность для естественно восприимчивых животных в зависимости от генотипа и интерфероногенной активности;

- Противовирусная активность препаратов различных классов в отношении вирусов ИРТ и ВД-БС КРС в опытах in vitro и in vivo.

Теоретический анализ, обобщение результатов, экспериментальные исследования выполнены автором самостоятельно.