Иммуноферментный метод диагностики клещевого энцефалита

Методические рекомендации "Ранняя диагностика клещевого энцефалита иммуноферментным методом
(определение IgM антител)"
(утв. Министерством здравоохранения СССР 11 августа 1986 г. N 4136-86)

Для серологической диагностики клещевого энцефалита используют реакции торможения гемагглютинации и связывания комплемента. Лабораторный диагноз ставят на основании прироста титров антител в парных сыворотках крови (взятых в начале болезни и в период реконвалесценции). Обнаружение в сыворотке крови ранних специфических антител (класса IgM) дает возможность диагностировать клещевой энцефалит в конце первой недели заболевания.

Техническая простота выполнения, возможность исследования большого числа проб без их предварительной обработки, надежность и экономичность метода позволяют использовать его в любых лабораториях для проведения диагностических исследований при клещевом энцефалите.

1. Сокращения, применяемые в тексте:

ИФМ - иммуноферментный метод

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ФСБ-С - фосфатно-солевой буфер с сорбиталем

ФСБ-СС - фосфатно-солевой буфер с сорбиталем и сывороткой.

КББ - карбонатно-бикарбонатный буфер

2. Лабораторное оборудование, реактивы, материалы

2.1. Спецификация оборудования

1. Планшеты для иммунологических реакций из полистирола с круглым или плоским дном Ленинградского завода медицинских полимеров, ТУ 64-2-278-79.

2. Пробирки для микропроб объемом 0,5 и 1,5 , Ленинградского завода медицинских полимеров.

3. Дозаторы пипеточные, ПЛ-01.

4. Центрифуга лабораторная типа ОПН-8.

5. РН-метр любой марки.

6. Холодильники бытовой и на -20° любой марки.

7. Термостат на 37° любой марки.

8. Весы торсионные ВТ-500.

9. Лабораторная стеклянная посуда: пробирки, пипетки градуированные и пастеровские, колбы, мерные цилиндры.

1. Натрий углекислый , хч, ГОСТ 83-79

2. Натрий двууглекислый , хч, ГОСТ 4201-79

3. Натрий хлористый (NaCI), хч, ГОСТ 4233-77

4. Натрий фосфат однозамещённый , чда, ГОСТ 245-76

5. Натрий фосфат двузамещённый , чда, ГОСТ 11773-76

6. Лимонная кислота , хч, ГОСТ 3652-69

7. Орто-фенилендиамин , ч, ТУ 6-09-08-1127-76

8. Перекись водорода , 30%, хч, ГОСТ 10929-76

9. Кислота серная , хч, ГОСТ 4204-77

10. Альбумин бычий сывороточный сухой, ТУ 10П-34-62

11. Телячья сыворотка (производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва) или нормальная бычья сыворотка*(1).

12. Сорбиталь С-20, ГОСТ 0105-113-63.

13. Вода дистиллированная, требования ГФ-Х, стр. 107

1. Иммуноглобулин специфический против IgM человека*(2).

2. Диагностикум вируса клещевого энцефалита пероксидазный*(3).

3. Антиген вируса клещевого энцефалита для РТГА и РСК*(4).

4. Контрольная положительная сыворотка человека*(5).

5. Контрольная отрицательная сыворотка человека*(5).

3. Взятие крови для исследования

Кровь для исследования берут из пальца в количестве 0,1-0,2 мл в пробирку для микропроб. При необходимости проведения других исследований (РТГА, РСК, выделение вируса), кровь берут из вены в количестве 3-5 мл в стерильную пробирку. Пробы оставляют на 1-2 часа при комнатной температуре для образования сгустка и его ретракции, а затем помещают в холодильник при температуре 4°С. Транспортировка пробы осуществляется в термосе со льдом.

В лаборатории образцы крови центрифугируют при 1000-1500 об/мин в течение 10 минут, тонко оттянутой пастеровской пипеткой отсасывают сыворотку в несколько пробирок и хранят до исследования при -20°. Хранение сывороток в нескольких порциях позволяет избежать их повторного замораживания-оттаивания при проведении последующих исследований. При отрицательном результате анализа исследование повторяют через 3-5 дней. Ранние специфические антитела обнаруживаются в крови на 5-6 день болезни и достигают максимального титра к концу второй недели заболевания. Обнаружение специфических антител класса IgM является достоверным критерием, подтверждающим диагноз заболевания.

4. Методика выполнения иммуноферментного метода

4.1. Сенсибилизация планшетов (твердая фаза)

В лунки полистиролового планшета вносят по 0,1 мл иммуноглобулина, полученного из гипериммунной сыворотки против IgM человека, в концентрации 100 мкг/мл в КББ, рН 9,6. Планшеты оставляют во влажной камере на 2 часа при 37°С. Неадсорбированные иммуноглобулины отмывают 3 раза 0,01М ФСБ, рН 7,4 с 0,05% сорбиталя (ФСБ-С). После промывки планшеты подсушивают постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге (с двух сторон), заворачивают в фольгу или в полиэтиленовую пленку и хранят до использования при 4°С. Срок хранения не более 3-4 недель.

4.2. Ход исследования

При исследовании нескольких проб от одного больного целесообразно проводить титрование сывороток крови для выявления динамики накопления специфических IgM антител. Для этого перед исследованием делают разведения сывороток начиная с 1:1000 (достаточно приготовить 6-7 разведений с коэффициентом 10).

Исследуемые образцы сывороток крови и контрольные положительную и отрицательную сыворотки разводят 1:1000 в 0,01М ФСБ, рН 7,4 с 10% телячьей или бычьей сыворотки и 2% сорбиталя (ФСБ-СС). Пробы вносят в лунки сенсибилизированных планшетов по 0,05 мл. Планшеты помещают во влажную камеру на 2 часа при 37°С. Несвязавшиеся компоненты сывороток удаляют из лунок и промывают трехкратно ФСБ-С.

Антиген вируса клещевого энцефалита разводят 1:20 в 0,01М ФСБ и вносят в лунки планшета по 0,05 мл в каждую. Планшеты оставляют для инкубации на 12-18 часов при 4°С. Несвязавшийся антиген удаляют вытряхиванием, лунки планшета промывают 3 раза (см. п. 4.1.).

Пероксидазный диагностикум вируса клещевого энцефалита разводят до рабочего разведения (указано на этикетке) в ФСБ-СС и вносят по 0,1 мл в каждую лунку планшета, который помещают во влажную камеру на 1,5-2 часа при 37°С. Планшет промывают (см. п. 4.1.).

В лунки планшета вносят по 0,1 мл субстрат-индикаторного раствора и оставляют при комнатной температуре в темном месте. Через 15-20 минут ферментную реакцию останавливают добавлением в лунки по 0,05 мл 2Н раствора серной кислоты и учитывают реакцию.

4.3. Учет результатов реакции

Учет ИФМ проводят визуально. Положительная контрольная сыворотка должна иметь титр, указанный на этикетке, отрицательная контрольная сыворотка не должна окрашивать субстрат-индикаторный раствор.

Результат реакции считают положительным, если в лунках выявляется заметная глазом желто-коричневая окраска. Если пробы исследуют только в одном разведении (1:1000), результат оценивают качественно ("да" - "нет"). При исследовании проб в разведениях результат оценивают титром сыворотки. Титром сыворотки считают последнее ее разведение, в котором еще можно различить желтое окрашивание субстрат-индикаторного раствора.

На каждом планшете необходимо исследовать контрольную положительную сыворотку в разведениях, контрольная отрицательная сыворотка исследуется только в разведении 1:1000.

6. Противоэпидемический режим

Постановка метода и работа с инфекционным материалом проводится в строгом соответствии с "Правилами устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лаборатории (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР", утв. МЗ СССР 20.10.81 г., N 2455.

*(1) предварительно проверяют на отсутствие антител к вирусу клещевого энцефалита

*(2) производство ЧССР . Готовится к выпуску НИИВС имени Мечникова.

*(3) готовится к выпуску Томским НИИВС

*(4) выпускается Томским НИИВС

*(5) Обеспечение заинтересованных лабораторий проводится Омским НИИПИ

И.о. начальника Главного
санитарно-эпидемиологического
управления Минздрава СССР

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Методические рекомендации "Ранняя диагностика клещевого энцефалита иммуноферментным методом (определение IgM антител)" (утв. Министерством здравоохранения СССР 11 августа 1986 г. N 4136-86)

Текст методических рекомендаций приводится по изданию Министерства здравоохранения СССР (Москва, 1986 г.)

Методические рекомендации разработаны Омским НИИ природноочаговых инфекций (О.В. Наволокин, Л.С. Субботина), Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР (С.Я. Гайдамович, Н.А. Лаврова)

Рекомендации предназначены для врачей-вирусологов СЭС и сотрудников НИИ, занимающихся изучением клещевого энцефалита

Комплексное исследование, направленное на диагностику инфицирования и оценку эффективности вакцинации против клещевого энцефалита, а также на диагностику системного клещевого боррелиоза.

Клещевой энцефалит; системный клещевой боррелиоз (болезнь Лайма); комплексная серологическая диагностика.

Синонимы английские

Тick-borne encephalitis; tick-borne borreliosis (Lyme borreliosis); comprehensive serological diagnostics.

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Клещевой энцефалит – это вирусное природно-очаговое трансмиссивное заболевание, характеризующееся преимущественным поражением центральной нервной системы. Возбудителем является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Flavivirus семейства Togaviridae, группа Arboviruses. Инфекция носит сезонный (весенне-летний) характер и передается преимущественно с укусом клещей, также возможен алиментарный путь передачи через инфицированное сырое молоко коров и коз. Инкубационный период заболевания длится от 3 до 21 дней, в среднем 10-14 дней. Клинические проявления носят разнообразный характер. В зависимости от выраженности неврологических расстройств выделяют следующие формы заболевания: лихорадочную, менингеальную, менингоэнцефалитическую, менингоэнцефалополиомиелитическую и полирадикулоневритическую, двухволновый менингоэнцефалит. По степени тяжести инфекция может протекать в легкой, средней или тяжелой форме, что влияет на длительность заболевания, выраженности клинической симптоматики и варианты исхода болезни. Возможно длительное вирусоносительство в виде латентной, персистентной или хронической инфекции.

Диагностика клещевого энцефалита основана на комплексе эпидемиологических, клинических данных, результатах изменений в лабораторных параметрах. В клиническом анализе крови в острый период заболевания может отмечаться лейкоцитоз с абсолютным и относительным увеличением количества нейтрофилов. Также увеличивается скорость оседания эритроцитов, в анализе мочи может наблюдаться транзиторная протеинурия.

В серологической лабораторной диагностике данного заболевания, главным образом, применяется выявление специфических антител к вирусу клещевого энцефалита. В настоящее время для определения антител классов IgM и IgG используется метод твердофазного иммуноферментного анализа. Данные специфические иммуноглобулины вырабатываются иммунной системой в ответ на инфицирование вирусом клещевого энцефалита или на вакцинацию против данного возбудителя. Важным в серологической диагностике является определение нарастания титра специфических антител в парных сыворотках крови, взятых в первые дни болезни и через две-три недели от ее начала. Антитела класса IgM появляются одновременно с первыми симптомами заболевания, достигая максимального уровня через 3,5-4,5 недели с момента инфицирования, затем постепенно снижаясь в течение нескольких месяцев. Специфические антитела класса IgG возникают в крови спустя неделю после появления первых симптомов, достигают максимума через 1,5-2,5 месяца с момента инфицирования и сохраняются на протяжении всей жизни, обеспечивая стойкий иммунитет.

Системный клещевой боррелиоз, или болезнь Лайма, - природно-очаговое трансмиссивное заболевание, возбудителем которого является грамотрицательная подвижная бактерия Borrelia burgdorferi семейства Spirochaetaceae. Заражение человека может происходить после укусов иксодовых клещей, инокуляции боррелий со слюной клеща, возможна трансплацентарная передача возбудителя от матери к плоду. Чаще всего заражение происходит в весенне-летний период активности клещей. Инкубационный период заболевания может длиться от 3 до 32 дней, по данным некоторых авторов - до 60 дней. Клещевой боррелиоз имеет разнообразные клинические проявления: лихорадка, интоксикация, головные боли, распространенная "мигрирующая" эритема на месте контакта клеща с кожей больного, регионарный лимфаденит. При прогрессировании заболевания, его осложнении и несвоевременном применении лечения могут развиться нарушения в виде менингита, менингоэнцефалита, энцефалита и энцефаломиелита, поражение сердца, глаз, рецидивирующие и/или хронические артриты.

Диагностика заболевания основывается на данных эпидемиологического анамнеза, специфических клинических проявлениях и на оценке лабораторных данных. Особую роль играет специфическая лабораторная диагностика при нетипичной картине протекающей инфекции и безэритемных формах заболевания. В данном случае применяется метод полимеразной цепной реакции для выявления ДНК возбудителя Borrelia burgdorferi и серологическая диагностика.

Серологическая диагностика в настоящее время имеет широкое распространение и направлена на определение наличия и концентрации специфических антител классов IgM и IgG к возбудителю системного клещевого боррелиоза. При применении метода твердофазного иммуноферментного анализа диагностическое значение имеет нарастание титра специфических антител в парных сыворотках. Следует отметить, что антитела класса IgM появляются при первых симптомах заболевания, но их количество нарастает сравнительно медленно, достигая максимума через 2-3 недели, а далее снижаясь. Антитела класса IgG выявляются через несколько недель после инфицирования, максимального уровня достигают через 4-6 месяцев. Таким образом, антитела IgM указывают на недавнее заражение, а IgG подходят для более поздней диагностики. Также определение уровня IgG антител применяется при контроле эффективности проводимой терапии против клещевого боррелиоза.

Для чего используется исследование?

Для комплексной лабораторной диагностики клещевого энцефалита и клещевого боррелиоза;
для подтверждения текущего или перенесенного клещевого энцефалита;
для оценки эффективности вакцинации против клещевого энцефалита;
для установления и подтверждения диагноза "клещевой боррелиоз";
для оценки эффективности проводимой терапии против клещевого боррелиоза;
для дифференциальной диагностики поражений центральной нервной системы.

Когда назначается исследование?

При клинических проявлениях и подозрении на клещевой энцефалит;
при подозрении на текущий или перенесенный клещевой энцефалит, при проведении вакцинации против клещевого энцефалита;
при клинических проявлениях и подозрении на клещевой боррелиоз (болезнь Лайма);
при выявлении или при подозрении на укус клеща, в комплексном обследовании в инфекционном стационаре.

Что означают результаты?

КП (коэффициент позитивности): 0 - 0,89.

Концентрация: 0 - 100 Ед/мл.

текущее или перенесенное заболевание клещевым энцефалитом или клешевым боррелиозом;
антитела класса IgM против возбудителя клещевого энцефалита: ранние стадии клещевого энцефалита (при этом IgG к вирусу клещевого энцефалита не выявляются); текущий или недавно перенесенный клещевой энцефалит (в сочетании с положительным тестом на IgG к вирусу клещевого энцефалита) при условии, что не проводилась вакцинация против клещевого энцефалита; недавно проведенная вакцинация против клещевого энцефалита;
антитела класса IgG против возбудителя клещевого энцефалита: наличие активного иммунитета вследствие ранее перенесенной инфекции или вакцинации (если тест на IgM к вирусу клещевого энцефалита отрицательный); текущий или недавно перенесенный клещевой энцефалит (в сочетании с положительным тестом на IgM к вирусу клещевого энцефалита) при условии, что не проводилась вакцинация; проведенная вакцинация против вируса клещевого энцефалита.
антитела класса IgM против возбудителя клещевого боррелиоза: возможное наличие инфекции, вызванной Borrelia burgdorferi;
антитела класса IgG против возбудителя клещевого боррелиоза: наличие недавнего инфицирования Borrelia burgdorferi; контроль эффективности проводимой терапии против клещевого боррелиоза.

Причины отрицательного результата / понижения:

отсутствие клещевого энцефалита, клещевого боррелиоза;
отсутствие или снижение иммунного ответа;
ранние сроки инфицирования возбудителем;
неэффективно проведенная вакцинация против клещевого энцефалита;
снижение иммунологического ответа после вакцинации;
ложноотрицательные результаты.

Что может влиять на результат?

Клинический период заболевания;
предшествующая вакцинация;
наличие перекрестно-реагирующих антител к другим возбудителям рода Flavivirus (для клещевого энцефалита);
для клещевого боррелиоза: инфекции, способные приводить к ложноположительному результату (сифилис, лептоспироз, возвратный тиф, вирус иммунодефицита человека, инфекционный мононуклеоз) и аутоиммунные расстройства;
особенности иммунного ответа.

При интерпретации результатов обследования необходимо учитывать длительность от момента инфицирования, предшествующую вакцинации;
для комплексной оценки полученных результатов их необходимо сопоставлять с эпидемиологическими, клиническими и другими лабораторными данными.

91 Вирус клещевого энцефалита, антиген (в ликворе)

22 Белок общий в ликворе

59 Глюкоза в ликворе

27 Borrelia burgdorferi s.l., ДНК [ПЦР]

Кто назначает исследование?

Инфекционист, кардиолог, невролог, офтальмолог, ревматолог, акушер-гинеколог, терапевт, врач общей практики, гастроэнтеролог, нефролог.

Литература

Покровский В.И., Творогова М.Г., Шипулин Г.А. Лабораторная диагностика инфекционных болезней. Справочник / М. : БИНОМ. – 2013.
Шувалова Е.П. Инфекционные болезни / М.: Медицина. – 2005. – 696 с.
Fauci, Braunwald, Kasper, Hauser, Longo, Jameson, Loscalzo Harrison’s principles of internal medicine, 17th edition, 2009.
Paillard L, Jones KL, Evans AL, Berret J, Jacquet M, Lienhard R, Bouzelboudjen M, Arnemo JM, Swenson JE, Voordouw MJSerological signature of tick-borne pathogens in Scandinavian brown bears over two decades / Parasit Vectors. // 2015 Jul 28;8:398.
Pancewicz SA, Garlicki AM, Moniuszko-Malinowska A, Zajkowska J, Kondrusik M, Grygorczuk S, Czupryna P, Dunaj J Diagnosis and treatment of tick-borne diseases recommendations of the Polish Society of Epidemiology and Infectious Diseases. Polish Society of Epidemiology and Infectious Diseases / Przegl Epidemiol. // 2015;69(2):309-16, 421-8.

Стоимость услуги:

2385 руб.* Заказать

Срок исполнения: 4 - 7 к.д. Заказать Указанный срок не включает день взятия биоматериала

Не менее 3 часов после последнего приема пищи. Можно пить воду без газа.

Метод исследования: Иммуночип, иммуноферментный анализ (ИФА).

Диагностика ИКБ выполняется с помощью уникальной диагностической тест-системы в формате иммуночипа с флуоресцентной детекцией. Это значительно повышает эффективность диагностики и информативность результатов исследования в сравнении с данными, полученными с применением метода иммуноферментного анализа (ИФА). Тест позволяет одновременно определять в исследуемом образце антитела к 8 группам диагностически значимых антигенов боррелий видов Borrelia afzelii и Borrelia garinii (p100 В.garinii, p100 В. B.afzelii, VlsE B.garinii, VlsE B.afzelii, p39 B.afzelii, p41 B.garinii, p41 B.afzelii, p58 B.afzelii, BBK32 B.garinii, BBK32 B.afzelii, OspC B.garinii, OspC B.afzelii, p17 B.garinii, p17 B.afzelii), наиболее распространенных в РФ, и одновременно дифференцировать их по классам антител: IgM и IgG. Использование комбинации из нескольких рекомбинантных белков разных видов боррелий позволяет повысить чувствительность и специфичность теста.

Антитела класса IgM при ИКБ начинают обнаруживаться на 10-14-й дни болезни. Образование специфических антител IgM у инфицированных лиц обычно предшествует появлению антител IgG. Однако у некоторых больных синтез антител IgM может задерживаться или отсутствовать вообще. При раннем боррелиозе с целью установления сероконверсии важно исследовать парные сыворотки, полученные от пациентов с интервалом в 20–30 дней. Наличие антител IgМ к антигенам боррелий в сыворотке крови больных Лайм-боррелиозом, как правило, указывает на раннюю стадию инфекции. В некоторых случаях антитела IgM могут выявляться в течение 1–2 лет и более. Антитела класса IgG появляются на 14-21-й дни болезни и в более поздние сроки. Важно отметить: специфические антитела IgG могут выявляться в течение длительного периода времени (несколько лет). Долго они сохраняются также и после успешно проведенной антибиотикотерапии. Наличие специфических антител IgG к возбудителям ИКБ не исключает повторного заражения инфекцией.

Диагностика КЭ выполняется методом иммуноферментного анализа – определение антител к вирусу КЭ используется для подтверждения клинического диагноза, а также проведения дифференциальной диагностики с другими инфекционными заболеваниями (гриппом, лептоспирозом и т.д.). Антитела класса IgМ к вирусу КЭ можно обнаружить на 4-5 день от начала заболевания, антитела класса IgG – на 10-14-й дни болезни. Доказательством свежей инфекции служит одновременное определение специфических антител IgM и IgG или нарастание титра специфических IgG в парных сыворотках, взятых у пациента с интервалом 10-14 дней. После перенесенного клещевого энцефалита вырабатывается стойкий иммунитет. Однако, самый эффективный способ защиты от клещевого энцефалита – это вакцинопрофилактика (плановая, либо экстренная). После проведения вакцинации вырабатываются специфические антитела IgG, которые могут либо полностью защитить от заболевания КЭ, либо болезнь будет протекать в более легкой форме.

ПОКАЗАНИЯ К ИССЛЕДОВАНИЮ:

Диагностика клещевых инфекций – клещевого боррелиоза (болезни Лайма) и/ или клещевого энцефалита.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ:

" ["serv_cost"]=> string(4) "2385" ["cito_price"]=> NULL ["parent"]=> string(3) "323" [10]=> string(1) "1" ["limit"]=> NULL ["bmats"]=> array(1) < [0]=>array(3) < ["cito"]=>string(1) "N" ["own_bmat"]=> string(2) "12" ["name"]=> string(31) "Кровь (сыворотка)" > > >

Биоматериал и доступные способы взятия:

Тип	В офисе
Кровь (сыворотка)

Перечень исследований:

Вирус клещевого энцефалита (Tick-borne encephalitis Virus, TBEV, ВКЭ), количественное определение антител класса IgG
Вирус клещевого энцефалита (Tick-borne encephalitis Virus, TBEV, ВКЭ), полуколичественное определение антител класса IgM
Серологическая диагностика боррелиоза

Подготовка к исследованию:

Не менее 3 часов после последнего приема пищи. Можно пить воду без газа.

Метод исследования: Иммуночип, иммуноферментный анализ (ИФА).

ПОКАЗАНИЯ К ИССЛЕДОВАНИЮ:

Диагностика клещевых инфекций – клещевого боррелиоза (болезни Лайма) и/ или клещевого энцефалита.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ:

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Набор реагентов ИФА ТС АГ ВКЭ Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса клещевого энцефалита (Комплект № 1) включает следующие реагенты для проведения прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА):
ИГ - иммуносорбент – иммуноглобулин класса G (крысиный) против вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) – аморфный порошок белого цвета, после растворения – прозрачная или слабоопалесцирующая бесцветная жидкость.
КА+ - контрольный положительный образец – антиген ВКЭ, экстрагированный из ткани мозга мышей, инфицированных ВКЭ, инактивированный бетапропиолактоном -аморфный порошок кремового цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесци-рующая светло-желтого цвета жидкость.
КА– - контрольный отрицательный образец – антиген из ткани мозга неинфицированных мышей, аморфный порошок кремового цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесцирующая светло-желтого цвета жидкость.
Конъюгат (концентрат) – иммуноглобулин класса G против ВКЭ (крысиный), конъюгированный с пероксидазой хрена, аморфный порошок белого цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесцирующая бесцветная жидкость.
КББ×20 - 20-кратный концентрат карбонатно-бикарбонатного буферного раствора для разведения ИГ – прозрачная бесцветная жидкость.
ФСБ-Т×25 – 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином, раствор для промывания планшетов и приготовления раствора РР – прозрачная или слабо опалесцирующая бесцветная жидкость, в которой допускается выпадение кристаллов бело-го цвета, растворимых в течение 20-30 мин при температуре 37 ºС.
БСА - бычий сывороточный альбумин – стабилизатор – аморфный порошок от белого до светло-желтого цвета, после растворения в ФСБ-Т – прозрачная или слабо опалесциру-ющая светло-желтого цвета жидкость.
ЦБР - буферный раствор с перекисью водорода – раствор для разведения ТМБ – про-зрачная бесцветная жидкость.
ТМБ - концентрат тетраметилбензидина – хромоген – прозрачная бесцветная жид-кость.
Планшеты полистироловые 96-луночные монолитные для ИФА.

Комплект № 1 рассчитан на одновременное проведение 192 определений, включая контрольные.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
Оборудование, материалы и реагенты (не включенные в состав набора), необ-ходимые для проведения анализа:
- многоканальный спектрофотометр, позволяющий измерять оптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны 450 нм;
- термостат, поддерживающий температуру (37±1) ºС;
- холодильник бытовой;
- промыватель для микропланшет, ручной или полуавтоматический;
- дозаторы (пипетки) переменного объема (механические или электронные): 8- или
12-канальные с объемом дозирования от 50 до 300 мкл и 1- канальные с объемом до-зирования от 10 до 100 мкл, от 100 до 1000 мкл и от 500 до 5000 мкл;
- наконечники для дозаторов соответствующей вместимости;
- шейкер (встряхиватель лабораторный медицинский V-3 типа вортекс);
- часы;
- бумага фильтровальная;
- перчатки резиновые хирургические;
- стаканы химические мерные или колбы мерные вместимостью 50 мл и 500 мл;
- цилиндры мерные вместимостью 25 мл, 100 мл, 500 мл;
- вода дистиллированная или вода очищенная;
- кислота серная концентрированная.
Вся посуда, используемая для постановки реакции, должна быть химически чистой и не содержать ионов тяжелых металлов. Следует избегать непосредственной близости с хлорсодержащими дезинфектантами, особенно на этапах приготовления ТМБ. Для отбора исследуемых образцов и реагентов тест-системы необходимо использовать автоматические пипетки с погрешностью измерения объёмов не более 5 %. Отбор реагентов следует произ-водить чистыми наконечниками для автоматических пипеток.

Подготовка исследуемого материала.

Обработка клещей.
Для испытания в ИФА пригодны лишь неповрежденные клещи. Клещей однократно промывают 70 % спиртом этиловым и 2-3 раза 0,9 % раствором натрия хлорида. Каждого клеща помещают в пробирку для микропроб вместимостью 0,5-1,5 мл, маркируют и хранят до исследования при температуре не выше минус 20 ºС не более 2 недель. Перед испытани-ем в ИФА готовят 10 % суспензию клеща: его растирают металлическим стержнем в той же пробирке, добавляют 0,2 мл РР (см. п. 4.4). Клеща, насосавшегося крови, растирают, добавляя РР в количестве, равном его объёму. Для ИФА берут 0,1 мл суспензии, остаток пробы хранят в той же пробирке и тех же условиях, что и клещей не более 2 недель.

Подготовка крови.
Кровь забирают из вены шприцем в количестве 2-5 мл, переносят в стерильную про-бирку, выдерживают 30-50 мин при температуре 37 оС или 1-2 ч при температуре 18-25 ºС для образования сгустка, затем центрифугируют 15-20 мин при 1500-2000 об/мин. Сыво-ротку отсасывают и помещают в стерильную пробирку, сгусток крови растирают в асепти-ческих условиях, добавляя равное ему по объёму количество РР. Затем центрифугируют при том же режиме, что и кровь. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробир-ку.
Приготовленные пробы маркируют и хранят до исследования при температуре от 2 до 8 оС не более 1 недели или при температуре не выше минус 20 ºС не более 3 мес. В зависимости от цели исследования в ИФА могут быть испытаны как неразведенные пробы сывороток и сгустков крови, так и в разведениях (например, от 1:2 до 1:8).

Подготовка мозговой суспензии.
Для исследования мозга инфицированных животных (или мозговой ткани людей, взятой в случае летального исхода) необходимо приготовить 1 % мозговую суспензию на РР. Суспензию центрифугируют при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин, надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку, маркируют и хранят до исследования также как пробы крови. В ИФА проверяют как неразведенную суспензию, так и в разведении 1:10 и выше.

Подготовка культуральной жидкости.
Культуральную жидкость зараженных клеточных культур перед испытанием в ИФА освобождают от клеток центрифугированием при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин. В ИФА исследуют как неразведенные пробы, так и в разведении 1:2 и более.
Подготовка растворов и реагентов (для проведения анализа на одном планшете).

Набор перед использованием необходимо выдержать не менее 30 мин при температу-ре от 18 до 25 °C.

Раствор для разведения ИГ (КББ).
0,5 мл КББ×20 разводят в 9,5 мл воды очищенной или дистиллированной (далее воды). Хранение: неиспользованный концентрат КББ×20 хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 7 сут.

Иммуносорбент (ИГ).
Рабочее разведение ИГ указано на ампуле.
Содержимое ампулы с ИГ растворяют в 1 мл воды (время растворения 1,5 мин при температуре 20-25 оС), затем разводят в КББ (см. п. 4.1) до разведения, указанного на ампу-ле (например: 1:20 – 0,5 мл ИГ и 9,5 мл КББ).
Хранение: неиспользованный растворенный ИГ хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 оС не более 7 сут.

Раствор для промывания планшетов и приготовления РР (ФСБ-Т).
Содержимое флакона с концентратом ФСБ-Т×25 разводят в 480 мл воды. В случае вы-падения осадка концентрат ФСБ-Т×25 предварительно прогревают в течение 20-30 мин при температуре 37 ºС до полного растворения осадка.
Хранение: при температуре от 2 до 8 ºС не более 2 сут или при температуре не выше минус 10 оС не более 14 сут.

Рабочий раствор (РР) для разведения образцов, конъюгата, КА+, КА–.
В 50 мл ФСБ-Т (см. п. 4.3) растворяют навеску 0,5 г стабилизатора БСА (время рас-творения 20 мин при помешивании при температуре 20-25 ºС).
Хранение: при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 7 сут.

Подготовка контрольных образцов.
Содержимое ампул с КА+ и КА– растворяют в 0,5 мл воды (время растворения 1,5 мин при температуре 20-25 ºС), затем готовят рабочее разведение каждого контрольного образ-ца в РР (см. п. 4.4) так, как указано на ампуле (например: 1:200 – 0,01 мл антигена и 2 мл РР).
Хранение: неиспользованные растворенные контрольные образцы хранят при темпе-ратуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 14 сут (рекомендуется разлить на аликвоты в микропробирки для исключения повторного замораживания-оттаивания).

Рабочее разведение конъюгата.
Содержимое ампулы с конъюгатом растворяют в 0,5 мл воды (время растворения
1,5 мин при температуре 20-25 ºС), затем разводят на РР (см. п. 4.4) так, как указано на ам-пуле (например: 1:40 – 0,25 мл конъюгата и 9,75 мл РР). Рабочее разведение конъюгата го-товят не ранее чем за 30 мин до использования.
Хранение: оставшийся не использованным растворенный конъюгат хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 14 сут.

Подготовка рабочего раствора ТМБ.
Рабочий раствор хромогена готовят непосредственно перед использованием, соединяя 2,5 мл концентрата ТМБ и 10 мл ЦБР (разведение 1:5), тщательно перемешивают. Смесь готовят в чистой посуде, избегая контакта раствора с металлом, воздействия интенсивного источника света и близости с хлорсодержащими веществами.
Хранение: при температуре 18-25 ºС не более 15 мин в защищенном от света месте.
4.8. Стоп-реагент (кислота серная концентрации 2 моль/л) в набор не включен, гото-вится дополнительно: к 9 мл воды добавляют 1,2 мл концентрированной кислоты серной.

Проведение иммуноферментного анализа.

Внесение контрольных и исследуемых образцов.
В две лунки планшета вносят по 100 мкл КА+ (в рабочем разведении), в три лунки – КА– (в рабочем разведении), в две лунки – по 100 мкл раствора РР – контроль конъюгата.
В остальные лунки планшета (кроме 12А) вносят по 100 мкл исследуемых образцов. Планшет закрывают и помещают на 1-2 ч при температуре (37±1) ºС или на 18-25 ч при температуре от 2 до 8 ºС, после чего планшеты промывают (см. п.5.1).

Внесение конъюгата.
В каждую лунку планшета, кроме 12А, вносят по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении. Планшет закрывают и помещают на 45-60 мин при температуре (37±1) ºС, затем отмывают 5 раз, остатки влаги удаляют (см. п.5.1).

Внесение хромогена и стоп-реагента.
Во все лунки планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора ТМБ. Планшет выдерживают в защищенном от света месте при температуре 18-25 ºС в течение 5-7 мин до появления интенсивного голубого окрашивания в лунке с КА+, после чего в лунки вносят по 50 мкл стоп-реагента (п. 4.8).

Читайте также: