Выделение и культивирование вирусов

В . Р . ДАУДЛ и Г . С . ШИЛД (W. R. DOWDLE, G. С . SCHILD)

Burnet (1940) обнаружил, что вирус 'гриппа может размножаться в «летках, выстилающих аллантоисную и амнио-тическую полости куриного эмбриона, что оказалось важным для изучения вирусов гриппа. Появилась возможность избежать неудобств, связанных с работой на лабораторных животных, а также возможность в больших количествах получить вирус гриппа в виде аллантоисной жидкости зараженных эмбрионов. Кроме того, стало 'возможным выделять вирус гриппа непосредственно «а эмбрионах, без предварительной адаптации его к хорькам или мышам, которая могла привести к случайному загрязнению вируса посторонними агентами. Открытие гемагглютинирующих свойств вирусных частиц (Hirst, 1941) также имело большое значение, поскольку обеспечило возможность обнаруживать вирус без необходимости демонстрировать его инфекционные свойства. Следующим шагом, 'Имевшим очевидное значение для изучения репликации вируса гриппа, было культивирование вируса в культурах клеток (Mogabgab et al., 1954). Разработка систем бляшек в однослойных клеточных культурах для определения инфекционное™ вируса в конечном счете обеспечила возможность получения чистых клонов вируса гриппа для экспериментов по генетике.

II. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

А. КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

Введение вирусов гриппа А или В в (Культуру клеток вызывает один из трех эффектов: 1) вирус размножается с различной эффективностью, образуя инфекционное потомство (продуктивная инфекция); 2) вирус проходит неполный цикл репродукции с образованием неполного (вируса на поверхности клеток или неинфекционных вирусных частиц в среде (абортивная инфекция); 3) вирусу не удается инфицировать кленку. Некоторые экспериментальные данные (позволяют полагать, что .можно установить состояние хронической инфекции, при (котором небольшие количества инфекционного вируса выделяются в среду на протяжении длительного времени (иереистентная инфекция).

1. Продуктивная инфекция

Репликативный цикл вирусов гриппа детально описан

в гл. 8. За введением вируса 1938; Haff et al., 1966; Marois et al., 1971). Поскольку это весьма близко напоминает реакцию на заражение у человека, возобновился интерес к удобной модели для изучения иммунитета и методов иммунизации. Potter et al. (1972a, b) и Potter (1973) в серии сообщений описали отсутствие защитного эффекта при внутримышечном введении водной инактивиро-ванной вакцины. Иммунизация с использованием адъюванта обеспечивает некоторую степень защиты и вызывает подъем уровня антигем-агглютининов в сыворотке, но иммунитет при этом не столь выражен, как после перенесенного заболевания. Это в общем соответствует данным, полученным на людях, и позволяет полагать, что отсутствие полного иммунитета при использовании убитой вакцины обусловлено ее неспособностью вызывать появление антител в секрете слизистой оболочки носа. Антитела в смывах из носа постоянно обнаруживаются при естественном заболевании (Haff, 1973).

Белые швейцарские линии мышей использовались как лабораторная (модель для изучения вирусов гриппа человека на протяжении 40 лет (Andrewes et al., 1934; Francis, 1934). Преимущества использования мышей очевидны: малые размеры и низкая стоимость допускают такие лабораторные исследования, которые были бы невозможны при использовании более крупных и дорогих животных, например хорьков.

В отличие от хорьков мыши не обладают высокой восприимчивостью к вирусу гриппа. Интраназалыное введение инфекционного материала от больных людей не вызывает выраженной картины заболевания у мышей, хотя вирус может размножаться в легких, бронхиолах, трахее и, в меньшей степени, тканях носовой полости (Hirst, 1947a; Lida, Bang, 1963; Mulder, Hers, 1972). Поскольку размножение вируса может быть засвидетельствовано лишь посредством титрования in ovo или in vitro, нельзя считать, что выделение (вируса путем заражения мышей имеет какие-либо преимущества.. Однако после адаптации, требующей шести или более пассажей легочного экстракта, вирусы гриппа типа А начинают вызывать ярко выраженные патологические изменения в легких, а также гибель животных уже через 48 ч после интра-назального заражения. Вирусы гриппа типа В труднее адаптировать к легким мыши. Эти выраженные патологические изменения, вызываемые вирусом трилпа А, .являются генетическим признаком, но которому идет отбор, причем этот признак независим от способности вируса размножаться в легких. Высокие титры вируса могут быть получены в легких при заражении неадаптированным штаммом, но размноже-

ние при этом не 'ведет к развитию патологических изменений и гибели (Hirst, 1947a).

Несколько иная картина наблюдается яри адаптации к мышам вируса, выращенного в курином эмбрионе. Первое интраназалыгое заражение обычно вызывает развитие (поражений в леших и гибель животного, в то время как несколько последующих пассажей не вызывают патологических изменений. Это явление можно объяснить токсичностью массивной дозы вируса, который (присутствует в аллантоисной жидкости в высокой концентрации. В организме мышей накапливается при этом очень мало вируса (Sugg, 1950). Специфические поражения легких и гибель мышей отмечаются лишь после 4—10 дополнительных пассажей легочной ткани.

Поражения легких, вызываемые вирусами гриппа у мышей, представляют собой настоящую вирусную пневмонию, похожую во (Многих отношениях на вирусную пневмонию у человека (Loosli, 1949; Mulder, Hers, 1972). Данные, полученные ранее с помощью световой микроскопии и указывавшие на специфическое поражение клеточного покрова альвеол, были подтверждены методом флюоресцирующих антител (Albrecht et al., 1963) и электронной микроскопией (Plum-raer, Stone, 1964). Хотя юсе клетки респираторного тракта чувствительны к 'вирусу, имеются данные о том, что у человека (см. гл. 13) клетки алывеол являются местом первоначального размножения вируса (Albrecht et al., 1963). Этот необычный восходящий путь респираторной инфекции, возможно, является скорее кажущимся, чем реальным. Когда животному под наркозом интраназально вводят вирус, он распределяется по всему респираторному тракту. Размножение вируса может -быть более быстрым в легких, чем в реснитчатом эпителии верхних дыхателыных путей.

При сублетальной инфекции вирус начинает исчезать из легких через 7 дней, что совпадает с появлением гуморальных антител. В процессе выздоровления эпителий альвеол замещается цилиндрическими и кубическими клетками .реснитчатого эпителия бронхиол. Наблюдается также метаплазия с появлением плоского эпителия (Baskerville et a]., 1974).

Поскольку воздушно-капельная передача инфекции от зараженных животных к незараженным происходит >в течение нескольких дней контакта, мыши .представляют собой прекрасную модель для изучения передачи вируса (Schulman, 1969). Мыши широко применялись также для изучения вакцин (Eddy, 1947; Kage et al., 1969), механизмов иммунитета (Schulman et al., 1968) и противовирусных препаратов (Da-vies et al., 1966; Suganuma, Ishida, 1973).

Вирусы гриппа типа А легко размножаются в легких хомяков при минимальных признаках заболевания (Friedewald, Hook, 1948). Те немногие штаммы вируса гриппа В, которые изучались в этом отношении, обладали лишь незначительной патогенностью, «о после адаптации могли вызывать поражения легких (Friedewald, Hook, 1948; Davenport, 1951; Kilbour-ne et al., 1951). В связи с низкой патогенностью вирусов гриппа для хомяков эти животные редко использовались для экспериментальных работ по гриппу. Однако недавно было обнаружено, что хомяки особенно удобны для оценки темпера-турочувствительных штаммов как пригодных для использования в качестве вакцины '(Mills, 'Chanock, 1971). Хомяк — одно из немногих лабораторных животных, имеющих температуру тела 37°С. Как и у хорьков, у хомяков не вырабатываются антитела при введении водной вакцины, если только не было предварительного заражения вирусом гриппа типа А (Potter et al., 1973).

Некоторые другие грызуны также использовались. Stuart-Harris (1937) сообщил, что вирус (гриппа может размножаться в ткани носовых раковин крыс и морских свинок, но не вызывает деструкции эпителия.

В. ПРИМАТЫ (ПОМИМО ЧЕЛОВЕКА)

Использование обезьян в качестве экспериментальной модели для изучения гриппа шло с переменным успехом. Еще в 1937 г. Mclntosh и Selbie пытались вызвать заболевание у макак резусов и зеленых мартышек вирусом H0N1, но безуспешно. Заражение макак резусов и циномольгус вирусом A/FM/1/47 .(.H1N1) дало такой же результат. Клинических проявлений болезни не наблюдалось, но были отмечены характерный некроз и десквамация эпителия (Verlinde, Makste-nieks, 1954).

Saslaw и Carlisle (1965) сообщили, что при заражении аэрозолем удается получить более четкие результаты; этот путь заражения они рассматривали как более естественный, чем интраназальный или интратрахеальный. Они смогли заразить обезьян макак (резусов и циномольгус вирусом типа A/PR8/34 (H0N1). Попытки заразить обезьян штаммами вируса H2N2 и вируса гриппа В были безуспешными. Berendt (1974) тоже использовал аэрозоли с малым размером частиц и сообщил, что у 6 макак резусов, зараженных вирусом типа А/Гонконг/68 (H3N2), наблюдалось выделение вируса во внешнюю среду и (появление антител. Явных клинических проявлений болезни не было. Все животные были иммунны к повторному заражению.

Кенийские павианы (Papio sp.) оказались чувствительными к заражению штаммом H3N2, подобным А/Гонконг/68 (Kalter et al., 1969). Вирус был обнаружен в смывах из глотки; кроме того, у зараженных животных и у животных, со-

державшихся в соседних клетках, появились антитела к вирусу. Клинически выраженного заболевания не было.

Г. ТЕЧЕНИЕ БОЛЕЗНИ В УСЛОВИЯХ ПОДАВЛЕНИЯ ИММУНИТЕТА

Воздействия на системы иммунитета у зараженных гриппом животных могут представлять интерес в аспекте повышения чувствительности к инфекции у экспериментальных животных и приобретения чувствительности у невосприимчивых хозяев. Однако сообщений о таких исследованиях немного и опубликованные данные противоречивы. Сообщалось (Singer et al., 1972), что у мышей, подвергнутых действию циклофосфамида, уменьшалась тяжесть заболевания, вызванного вирусом A/PR8. Наоборот, Virelizier и соавт. (1974) нашли, что мыши, получившие циклофосфамид, намного чувствительнее к летальному действию A/PR8, чем, нормальные линии: титр препарата вируса в LD50 был по крайней мере

в 100 раз выше у .мышей, обработанных циклофосфамидом'. Mayer и соавт. (1973) тоже обнаружили, что иммуносунпрес-сия, вызванная циклофосфамидом, усиливает нейровирулент-ность вируса A/NWS. Результаты этих двух работ позволяют полагать, что гуморальные антитела являются важным фактором в выздоровлении мышей при гриппозной инфекции. Мыши с удлиненной вилочковой железой были несколько чувствительнее к вирусу PR8, чем нормальные мыши (Virelizier et al., 1974). Исследование на курах с удаленной фабри-циевой сумкой показали (Portnoy et al., 1973), что у них повышалась чувствительность к заражению ВЧП; это рассматривалось как указание на роль гуморальных антител в выздоровлении от этой инфекции.

IV. ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА

Пробы для выделения вируса следует брать не позднее чем через 3 дня после начала заболевания. Вероятность выделения вируса быстро снижается после этого срока, но в некоторых случаях вирус можно выделить на 7-й и даже 10-й день болезни. Лучше всего вирус выделяется из носовых смывов. Однако мазки, взятые из глотки и носа, 'более удобны для врача и менее неприятны для больного. Пробы, предназначенные для выделения вируса, следует постоянно держать на холоде и как можно скорее использовать. Если нельзя инокулировать их в течение 48 ч после взятия, следует поместить пробы в закрытый сосуд и .хранить в сухом льду или в рефрижераторе при —70 °С. В летальных случаях при подозрении на гриппозную пневмонию следует пытаться выделить вирус из ткани легких, слизистой трахеи, а также крови. В этих случаях выделение вируса осуществлялось с переменным успехом (iDowdle, Coleman, 1974).

Вирусы гриппа А и В размножаются в куриных эмбрионах и у ряда лабораторных животных. Куриные эмбрионы и культуры клеток точек макак резусов и зеленой мартышки считаются наиболее чувствительными для выделения вируса. Вирус гриппа типа С выделяли только на куриных эмбрионах.

Для максимально успешного выделения вирусов следует заражать 10—11-дневные эмбрионы одновременно в полости амниона и аллантоиса. Эмбрионы инкубируют при 33 °С 3— 4 дня и пробы амниотической и аллантоисной жидкости проверяют на наличие вируса, добавляя эритроциты кур или морских свинок. Эритроциты морской свинки (или группы крови 0 человека) считаются более чувствительными, чем куриные, для обнаружения вирусов H0N1 и H1N1 на ранних пассажах в курином эмбрионе. Это не относится к вирусам,

Для выделения вируса гриппа типа С 7-дневные куриные эмбрионы заражают в полость амниона и инкубируют при 33°С 5 дней. В полости аллантоиса вирус плохо накапливается даже после (многочисленных пассажей на эмбрионах.

Клетки почек зеленых мартышек или макак резусов в мо-нослой'ной культуре в пробирках являются наиболее чувствительной культуральной системой для выделения вирусов гриппа А и В. Неопецифическое (подавление вирусов веществами, содержащимися в сыворотках в культуральной среде, является серьезной проблемой; монослой следует несколько раз промыть средой без сыворотки и использовать такую среду для поддержки культуры после заражения. Вирусы гриппа А хуже растут в культурах клеток, чем вирусы гриппа В. Цитопатический эффект проявляется в виде накопления вакуолизирующихся клеток, которые затем дегенерируют или отделяются от стекла. Цитопатический эффект проявляется в виде накопления вакуолизирующихся клеток, которые затем дегенерируют или отделяются от стекла. Цитопатический эффект слабовыражен, непатогнамоничен, может не выявляться при первых пасса'жах. Присутствие вируса обычно устанавливается гемадсорбцией эритроцитов морской свинки (Vogel, Shelokov, 1957) в течение 3—4 дней после заражения, задолго до развития выраженного цитопатического эффекта.

Большинство выделяемых штаммов вируса гриппа типа В может быть обнаружено гемадсорбцией или тем агглютинацией в течение 3—4 дней после заражения. Цитопатический эффект обычно тоже заметен. Клетки становятся зернистыми, набухают, округляются; позднее развиваются пикноз и фрагментация, слой клеток в конце концов разрушается. Развитие цитолатичесшго действия, и накопление (гемагглютининов могут быть ускорены для вирусов А и В, если поместить пробирки во вращающийся барабан, хотя вероятность выделения вируса от этого не увеличивается.

Следует одновременно культивировать незараженные культуры клеток в пробирках, чтобы исключить возможность случайной контаминации вирусами. Вирус парагриппа типа 2 (SV5), вызывающий гемадсорбцию, является нередким кон-

Трудно оценить количественно эффективность выделения вирусов гриппа А и В в культуре ткани и на эмбрионах. Обилие выделяемых штаммов обоих вирусов сильно варьирует по годам. Вообще говоря, культура клеток почек обезьян имеет преимущество при выделении вирусов В, но степень этого (преимущества варьирует. Вирус А еще более вариабелен и для него куриные эмбрионы чувствительнее клеточных культур. |По этой причине, а также в связи со значительной биологической (как и антигенной) изменчивостью вирусов гриппа не всегда можно сказать заранее, какой метод выделения окажется более эффективным. Заражение первичных культур почек макак резусов или зеленых мартышек одновременно с заражением куриных эмбрионов в полость аллан-. тоиса и амниона рекомендуется для выделения максимального количества штаммов вирусов гриппа А и 'В.

Albrecht P., Blaskovic D., Styk В ., Roller M. Acta virol. (Prague), 1963

Andrewes С . Н ., Laidlaw P. P., Smith W. Lancet, 1934, v. 2, p. 859. Barber W. H., Small P. A. Infect. Immunity, 1974, v. 9, p. 530. Basarab O., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1969, v. 50, p. 612. Basarab 0., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1970, v. 51, p. 1. Baskerville A., Thomas G., Wood M., Harris W. J. Brit. J. exp. Path., 1974,v. 55, p. 130.

Beare A. S., Keast K. A. J. gen. Virol., 1974, v. 22, p. 347

Becht И . J. gen. Virol, 1969, v. 4, p. 215.

Berendt R. F. Infec. Immunity, 1974,

Bernkoff H. Proc. Soc. exp. Biol., 1949, v. 72, p. 680. Boveridge W. I. В ., Burnet F. M. Med. res. Counc. (Gt. Brit.). Spec. Rep. Ser.,

J946, v. 256. Blaskovic P., Rhodes A. J., Labzoffsky N. A. Arch. ges. Virusforsch., 1972

Blaskovic P., Rhodes A. J., Labzoffsky N. A. Arch. ges. Virusforsch., 1972b,

Burnet F. M. Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1940, v. 18, p. 353. Burnet F. M., Bull D. «.Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1943, v. 21, p. 55. Came P. E., Pascale A., Shimonaski G. Arch. ges. Virusforsch., 1968, Bd 23

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ , комплекс методов исследования, позволяющих распознать этиологию вирусного заболевания и изучить его возбудителя.

Осн. этапами В. и. являются выделение вируса от больных и павших животных (взятие, консервирование, пересылка и подготовка материала, заражение им животных, куриных эмбрионов, культуры клеток); титрование вирусов для определения их кол-ва в исследуемых материалах; культивирование вирусов на восприимчивых домашних и лабораторных животных, особенно на развивающихся куриных эмбрионах и культурах тканей (гл. обр. первичнотрипсинизированных).

С помощью морфологич. методов выявляют элементарные тельца, внутриклеточные включения (напр., Бабеша — Негри при бешенстве, Боллингера при оспе птиц). Иммунохимич. методы (гл. обр. метод флуоресцирующих антител) позволяют определить специфич. вирусный антиген в заражённых [зараженных] клетках тканевой культуры или органов и тканей инфицир. животных. С помощью серологич. методов проводят видовую и группоспецифич. идентификацию вируса и антител в сыворотках переболевших животных. С этой целью используют реакции нейтрализации, РСК, реакцию гемагглютинации, задержки гемагглютинации, диффузионной преципитации, торможения гемадсорбции. Реакция нейтрализации позволяет улавливать антигенные различия сходных между собой вирусов даже в пределах одноимённой [одноименной] группы. РСК применяют для обнаружения вирусных антигенов в материалах от больных и павших животных, идентификации выделенного вируса, изучения антигенных связей между различными вирусами и определения антител у переболевших животных. Реакции гемагглютинации и задержки гемагглютинации широко применяют в В. и. для диагностич. целей и типирования возбудителей болезни Ньюкасла, гриппа птиц, парагриппа и нек-рых аденовирусов; непрямую реакцию гемагглютинации используют для выявления адено- и миксовирусов, хламидий. Реакцией прицепитации в агаре изучают антигенную структуру вирусов, выявляют антитела в сыворотке и антигены в исследуемом материале. Реакцию гемадсорбции применяют для предварительной индикации и титрования вирусов в культуре клеток, особенно тех, к-рые не вызывают цитопатич. действия. Гемадсорбция наступает раньше проявления цитопатогенного действия, поэтому её [ее] используют как ранний метод предварительной индикации вирусов. Гемадсорбция островковая (адсорбция эритроцитов на отдельных участках монослоя клеток) типична для гриппа свиней, эпидемич. паротита; диффузная (адсорбция эритроцитов на клетках всего монослоя)— для классич. чумы кур, болезни Ньюкасла, афр. чумы свиней и др. Методы очистки и концентрации вирусов используют при изучении физич., химич. и морфологич. свойств вирусов. Фазовые системы, образованные полимерами, используют для концентрации вирусов из больших объёмов [объемов] вируссодержащих жидкостей, выделения нуклеиновых к-т вирусов. Радиобиологич. методы применяют в В. и. для изучения распределения и локализации вирусов (антител) в организме и особенно для изучения процессов онтогенеза вирусов. С помощью электронной микроскопии обнаруживают вирионы в исследуемом материале и специфич. конгломераты вирусов и антител (иммунная электронная микроскопия). Иммуноэлектроосмофорез обусловлен одновременным встречным движением в геле агара антигена и антитела в результате разной величины электрич. заряда с образованием комплекса антиген — антитело в виде линии преципитации и последующей его денатурацией. Метод применяют при изучении антигенной структуры вируса. Изоэлектрич. фокусирование основано на способности белков переходить в инертное (в отношении электрофоретич. подвижности), а затем агрегированное состояние в изоэлектрич. точке. Метод применяют для изучения белков вирусов. При иммуноферментативном методе происходит присоединение фермента к антителам с последующим образованием комплекса фермент — антитело — антиген, к-рый выявляют в клетке с помощью цитохимич. реакции на фермент (пероксидазу, щелочную и кислую фосфотазу, глюкозооксидазу). Метод используют с диагностич. целью для выявления вирусных антигенов в культурах клеток, мазках-отпечатках, криостатных срезах, а также для изучения тонкой структуры антигенов вируса, патогенеза вирусных болезней и др. См. также Вирусоскопия .

Лит.: Тихоненко Т. И., Методические основы биохимии вирусов, М., 1973, с. 152—58; Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, пер. с англ., ред. Э. Леннет и Н. Шмидт, М., 1974.

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Жилин Евгений Сергеевич, Русанова Анастасия Михайловна, Червякова Ольга Викторовна, Зайцев Валентин Лукьянович, Кошеметов Жумагали Каукарбаевич

В статье представлены результаты экспериментов по выделению, идентификации и изучению некоторых биологических свойств вируса оспы мышей . Установлена возможность репродукции вируса оспы мышей с проявлением выраженного цитопатического действия в первичной культуре клеток почек ягненка. Инфицирование культуральными суспензиями инициировало у мышей развитие оспоподобных поражений, некроза конечностей и гибель животных. Вирус 20-кратно пассированный в культуре клеток почек ягненка, сохранил свои патогенные свойства для белых мышей. Установлено антигенное родство выделенного изолята вируса оспы мышей с вирусами оспы коров, овец, коз, кур.

Isolation, Identification and Study of Some Biological Properties of the Mousepox Virus

The given article presents the results of experiments on the isolation, identification and study of some biological properties of the mousepox virus . The possibility of reproduction of mousepox virus with expressed cytopathic effect in primary cell culture of lamb kidney had been established. Infection of mice with culture suspensions initiated development of varioloid lesions, necrosis of extremities and death of animals. 20-fold passed virus in cell culture of lamb kidney kept its pathogenicity for white mice. The antigenic similarity of isolates of the mousepox virus with viruses of cowpox, sheep-pox, goat-pox and chicken-pox had been established.

Ключевые слова: вирус, оспа мышей, культура клеток, пассаж, реакция диффузионной преципитации

Key words: virus, mousepox, cell culture, passage, diffusion precipitation reaction

Жилин Е. С., Русанова А. М., Червякова О. В., Зайцев В. Л., Кошеметов Ж. К., Булатов Е. А.

ВЫДЕЛЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСА ОСПЫ МЫШЕЙ

ISOLATION, IDENTIFICATION AND STUDY OF SOME BIOLOGICAL PROPERTIES

OF THE MOUSEPOX VIRUS

РГП Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности (НИИПББ) КН МОН РК Адрес: 080409, Республика Казахстан, Жамбылская область, Кордайский район, пгт. Гвардейский

RGE Research Institute for Biological Safety Problems (RIBSP) SC ME&S RK Address: 080409, Republic of Kazakhstan, Zhambylskaya oblast, Kordaiskiy region, pgt. Gvardeiskiy

Zhilin Evgeniy S., Head of the Laboratory "Biopreparations preservation methods and technology" Русанова Анастасия Михайловна, к. б. н., ст. научн. сотрудник Rusanova AnastasiaM., Ph.D., Ph.D., Senior Staff Scientist Червякова Ольга Викторовна, к. б. н., ст. научн. сотрудник

Аннотация. В статье представлены результаты экспериментов по выделению, идентификации и изучению некоторых биологических свойств вируса оспы мышей. Установлена возможность репродукции вируса оспы мышей с проявлением выраженного цитопатического действия в первичной культуре клеток почек ягненка. Инфицирование культуральными суспензиями инициировало у мышей развитие оспоподобных поражений, некроза конечностей и гибель животных. Вирус 20-кратно пассированный в культуре клеток почек ягненка, сохранил свои патогенные свойства для белых мышей. Установлено антигенное родство выделенного изолята вируса оспы мышей с вирусами оспы коров, овец, коз, кур.

Summary. The given article presents the results of experiments on the isolation, identification and study of some biological properties of the mousepox virus. The possibility of reproduction of mousepox virus with expressed cytopathic effect in primary cell culture of lamb kidney had been established. Infection of mice with culture suspensions initiated development of varioloid lesions, necrosis of extremities and death of animals. 20-fold passed virus in cell culture of lamb kidney kept its pathogenicity for white mice. The antigenic similarity of isolates of the mousepox virus with viruses ofcowpox, sheep-pox, goat-pox and chicken-pox had been established.

Оспа мышей (variola murina, инфекционная эктромелия) - инфекционная вирусная болезнь мышей и крыс. Патогенез оспы мышей сходен с патогенезом натуральной оспы человека, который предполагает быструю репликацию вируса в первоначальном месте проникновения, как правило, кожи, а также быстрым распространением вируса кровью во внутренние органы, вторичной репликацией вируса в селезенке и печени и, наконец, распространением на кожу, что сопровожда-

ется типичной сыпью, характерной для других вирусов рода Orthopoxvirus [5].

При острой форме течения болезни животные погибают без видимых признаков болезни через 5-14 сут. Смертность, в зависимости от вирулентности штамма, достигает 50-100 %. Для хронической формы характерны поражения кожи и мышц конечностей, результатом которых являются отеки и гнойничковые высыпания, из которых выделяется серозная жидкость, образующая после подсыхания корочки, напоминающие

оспины у людей. Часто возникает некроз, гангрена, отпадение конечностей с образованием округлой культи. Кроме конечностей поражаются хвост, уши, мордочка и различные участки кожи [3].

Диагноз ставят на основании эпизоото-логических, клинических, патологоанатоми-ческих данных и результатов лабораторного исследования [6]. Антигены вируса оспы мышей имеют родственные связи с антигенами вирусов оспы коров, осповакцины, оспы обезьян [7]. Лечение не разработано. Для профилактики обязательно карантини-рование вновь завозимых животных.

Оспа мышей - широко распространенное заболевание в питомниках многих стран, где разводят лабораторных животных. Заболевание протекает спорадически, но часто поражаются все животные в эпизоотическом очаге. Эктромелия может приводить к контаминации вакцинных и вирулентных штаммов вирусов, пассируемых на белых мышах.

Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности по роду своей деятельности занимается изоляцией и поддержанием различных вакцинных и вирулентных штаммов вирусов. Для исследований ряда вирусных агентов в качестве чувствительной модели используются лабораторные мыши, что не исключает контаминацию материалов вирусом оспы мышей. Так, при проведении серии экспериментов по освежению вакцинного вируса бешенства на мышах был получен биоматериал из мозга, в препаратах которого методом электронной микроскопии обнаружены вирионы, морфологически сходные с вирусами рода Orthopoxvirus. Для идентификации вирусного агента были проведены исследования по его изоляции на чувствительных системах.

Материалы и методы

В качестве исходной суспензии использовали 20%-ю мозговую суспензию мыши, в препаратах которой при электроно-микро-скопических исследованиях были обнаружены вирионы, морфологически сходные c вирусами рода Orthopoxvirus.

Для изоляции вирусного агента использовали беспородных мышей и культуру клеток

почек ягнят (ПЯ) (Банк первичных и перевиваемых культур клеток НИИПЬБ).

Для заражения культур клеток 20%-ю суспензию мозга мыши подвергали центрифугированию при 3000 об./мин, 20 мин. Надо-садок в объеме 0,1 см3 вносили в пробирку с монослоем клеток ПЯ и инкубировали в течение 60 мин. Удаляли вирусный материал и вносили пристеночную полусинтетическую среду (1,0 % глютамина, 2,0 % инактивиро-ванной сыворотки крупного рогатого скота, 100 МЕ сульфата гентамицина). Культивирование вируса осуществляли при 37 °С. Контроль репродукции вируса проводили визуально по цитопатическому действию (ЦПД) вируса на клетки. Инфекционную активность вируса определяли по ЦПД в культуре клеток ПЯ. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча в модификации Ашмари-на и выражали в ^ ТЦД50/см3 [1].

Тканевыми и культуральными суспензиями вируса заражали мышей интрацере-брально в дозе 0,03 см3, внутрибрюшинно -0,5 см3, внутрикожно - 0,1 см3. Наблюдение за животными проводили в течение 21 суток.

Контроль наличия вируса в культураль-ных суспензиях и патологических материалах проводили электронной микроскопией методом негативного контрастирования. Культуральные и тканевые антигены исследовали в реакции преципитации со специфическими сыворотками при оспе коров, овец, коз, кур, контагиозной эктиме овец, хлами-диозе, болезни Ауески, катаральной лихорадке овец, чуме мелких жвачных животных (коммерческие препараты, изготавливаемые в НИИПЬБ). В качестве контроля использовали нормальную сыворотку овцы. Постановка реакции преципитации осуществлялась по методу ОисЫ;ег1опу [9].

Результаты и обсуждение

С целью выделения вирусного агента использовали белых мышей и культуру клеток ПЯ. Интрацеребральное и внутрибрюшин-ное заражение мышей мозговой суспензией вируса приводило к их гибели через 7-10 суток после заражения без клинических проявлений заболевания животных. Внутрикож-ное введение вирусного материала и исполь-

Рис. 1. Световая микроскопия инфицированной и неинфицированной культуры клеток ПЯ (Инстр. ув. х200): а - деструктивные изменения культуры клеток ПЯ, 5 сутки после инфицирования; б - незараженная культура клеток ПЯ, 5 сутки инкубирования.

Рис. 3. Клинические признаки заболевания у инфицированных мышей: а - конъюнктивит глаз, б - отеки конечностей, в - пустулезная сыпь, г - некроз тканей конечностей, отсутствие фаланг пальцев.

зование для последующих 4 пассажей на мышах мозговых суспензий павших мышей при различных способах введения не приводило к заболеванию и гибели животных в течение всего срока наблюдения.

При инфицировании культуры клеток ПЯ на втором пассажном уровне на 3 сутки культивирования обнаружены деструктивные изменения клеточного монослоя, проявлявшиеся в виде небольшого разрежения монослоя, окруженного округлыми светопреломляющими клетками. Количество очагов и площадь деструктивного поражения клеток увеличивались к 10 пассажному уровню, наблюдалось 80-90%-е поражение клеточного монослоя (рис. 1а). Начало поражения клеток выявлялось на 2 сутки, максимальное поражение клеточного монослоя установлено на 5 сутки. В монослое незараженных клеток подобных изменений не отмечали (рис. 1б).

При электронно-микроскопическом исследовании препаратов культуральной суспензии 10 пассажного уровня были обнаружены единичные вирусные частицы и скопления вирионов. Вирионы имели морфологическую характеристику, типичную (кирпичеобразную) для рода Orthopoxvirus (рис. 2а). Диаметр вирусных частиц варьировал в пределах 200-250 нм, длина составляла 250-300 нм. Многослойная оболочка вируса толщиной 20-25 нм была покрыта многочисленными полыми трубкообразны-ми структурами диаметром 5-7 нм и длиной 18-20 нм (рис. 2б).

Суспензией 10-пассажного уровня были инфицированы 3 группы животных по 10 мышей в каждой. В результате проведенного опыта было установлено, что интраце-ребральное и внутрибрюшинное введение культуральной суспензии вызывало гибель всех животных (1, 2 группа животных) на 5-10 сутки после заражения. Клинических симптомов заболевания при этом не отмечали. При внутрикожном введении вируса в область хвоста на 7 сутки отмечено появление конъюнктивита глаз (рис. 3 а) и отеков конечностей (рис. 3б) с последующим появлением на 10 сутки пустулезной сыпи, из которой происходило выделение серозного экссудата (рис. 3в). После спадания отеков на месте

пустул образовывались язвочки и корочки. Через 15 суток после заражения наблюдали некроз тканей конечностей с последующим отпадением фаланг пальцев и конечностей с образованием культи (рис. 3г). Все вышеописанные симптомы соответствовали клиническому течению и поражениям, развивающимся при оспе мышей, приведенным в литературе [2, 8].

Мыши, павшие после заражения, были подвергнуты патологоанатомическому вскрытию. В результате вскрытия установлено наличие кровоизлияний в верхнем отделе кишечника и легких, увеличение печени и селезенки, при гистологическом исследовании найдены цитоплазматические включения в клетках эпидермиса кожи и печени, что также соответствует патогенезу оспы мышей [3, 4, 5].

Пробы органов (мозг, печень, селезенка, легкие, кишечник в виде 20%-х суспензий) павших мышей, а также антигены, полученные из инфицированных клеток 10 пассажного уровня, были исследованы в реакции преципитации со специфическими сыворотками при оспе коров, овец, коз, кур, контагиозной эктиме овец, хламидиозном аборте овец, болезни Ауески, катаральной лихорадке овец и нормальной овечьей сыворотке.

Результаты исследований отражены в таблице. Из таблицы видно, что антигены, полученные из инфицированных клеток ПЯ и печени павших животных, реагировали положительно со специфическими сыворотками при оспе коров, овец, коз, кур при отрицательных результатах с другими гете-рологичными сыворотками, что свидетельствует о наличии антигенных связей с вирусами рода Orthopoxvirus и Capripoxvirus.

При проведении дальнейшего пассирования вируса (10 пассажей) в культуре клеток ПЯ наблюдалось сохранение выраженного цитопатогенного действия вируса на клеточный монослой. В вирусных материалах выборочных пассажей определена инфекционная активность вируса. В результате установлено, что при выбранных условиях культивирования титры вируса в культуральных суспензиях 11-20 пассажного уровня составляли 5,5^6,26 lg ТЦД50/см3. Независимо

Результаты исследований тканевых и культуральных проб в реакции диффузионной преципитации

№ п/п Наименование исследуемых проб Контрольные сыворотки

СС оспы коз СС ОО СС оспы коров СС оспы кур СС КЭО СС ХАО * о ^ и i СС КЛО СС Ауе-ски К О

6 АгС оспа мышей на ПЯ (100 раз концентрированный) + + + +

Читайте также: