Вирусы папиллом человека геном

Вирусы папилломы (papilloma viruses) заражают клетки кожи и слизистых оболочек — кератиноциты, которые служат основным механическим барьером между внешней средой и внутренней средой организма. Эта группа вирусов очень разнообразна, и многие ее представители не вызывают никаких симптомов. Однако патогенные представители могут приводить не только к образованию папиллом и бородавок, но и к злокачественным опухолям.

История и распространенность ВПЧ

Бородавки и кожные заболевания упоминаются и описываются начиная с самых древних литературных источников. Первые подробные описания кожных новообразований составил древнеримский естествоиспытатель и врач Авл Корнелий Цельс, живший на рубеже старой и новой эры [7]. Предположения о том, что некоторые бородавки могут передаваться инфекционными агентами возникло еще раньше. Показать, что этими агентами являются вирусы удалось в начале ХХвека (обзорная информация по ссылке 4). Первый вирус папилломы был выделен в 1933 Ричардом Шоупом [8], американским вирусологом, который также впервые выделил и вирус гриппа [9].

Папилломавирусы втречаются у млекопитающих и существенно менее распространены среди птиц. Эволюционная история папилломавирусов началась тогда, когда появились первые высшие позвоночные (амниоты, к которым относятся пресмыкающиеся, птицы и млекопитающие) [10]. Более подходящими хозяевами для этой группы вирусов, в виду строения кожного покрова, оказались млекопитающие, у которых они представлены множеством подсемейств и родов [11]. Родство вирусов папилломы с другими семействами ДНК-вирусов (например,полиомавирусами) пока не продемонстрировано достаточно убедительно [12].

Человека могут заражать более 100 штаммов папилломавирусов, которые делят на штаммы с высоким либо низким риском возникновения рака. При этом низкопатогенных разновидностей существенно больше.

К злокачественным новообразованиям (в это касается рака шейки матки и аногенитальной зоны) приводят всего 18 штаммов. Передаются вирусы папилломы человека(ВПЧ) в основном половым путем и при контакте слизистых.

Считается, что ВПЧ низкого риска продуцируют больше вирионов, лучше распространяются, хотя и элиминируются из организма за один-два года, или даже быстрее [13]. По сравнению с ними, штаммы высокого риска заражают меньшее количество людей, но и иммунной системе с ними справиться сложнее [14]. Самыми канцерогенными являются штаммы ВПЧ 16 и ВПЧ 18, а за возникновение бородавок в аногенитальной зоне в 90% случаев ответственны штаммы ВПЧ 6 и ВПЧ 11 [15]. Именно эти представители папилломавирусов привлекают наибольшее внимание исследователей [16] [17].

Строение и биология вируса

Папилломавирусы имеют сравнительно маленькие вирионы, лишенные мембранной оболочки. Их диаметр около 30 нм. Это примерно в четыре раза меньше диаметра ВИЧ или гриппа, имеющих мембранную оболочку, происходящую из мембраны зараженной клетки. Геном папилломавирусов представлен кольцевой двуцепочечной молекулой ДНК, которая упакована при помощи гистонов — клеточных белков, участвующих в компактизации ДНК в ядре. Геном папилломавирусов кодирует два типа белков. Ранние белки (early proteins, E-proteins) осуществляют регуляторные функции, обеспечивают размножение вируса и, в ряде случаев, ответственны за злокачественное перерождение клеток. Поздние белки (late proteins, L-proteins) выполняют структурную функцию, формируя капсид вирионов.

Папилломавирусы непросто культивировать в лабораторных условиях, так как нативные частицы образуются либо в живых организмах, либо в сложных органотипических клеточных культурах, в которых клетки проходят стадии дифференцировки, аналогичные существующим в живом организме [18, 19 и 20].

Жизненный цикл вирусов папилломы привязан к стадиям развития кератиноцитов. Кератиноциты — это клетки, из которых в основном состоят эпидермис, верхний слой кожи, и слоистый эпителий слизистых оболочек.

Активно делящиеся молодые кератиноциты выстилают базальную мембрану, находящуюся под верхними слоями эпидермиса, а по мере созревания и дифференцировки кератиноциты вытесняются к поверхности кожи. Вирусные частицы заражают еще не дифференциированные клетки, а новые частицы образуются в кератиноцитах, достигших терминальной стадии дифференцировки.

Ранние белки папилломавирусов обеспечивают нужное содержание ДНК вируса в ядре клетки и координируют экспрессию его генов. Белки E1 и E2 образуют комплекс с ДНК вируса, привлекая клеточные системы репликации. За канцерогенный эффект у штаммов ВПЧ высокого риска ответственны ранние белки E6 и E7. E6 способен связываться с опухолевым супрессором р53, провоцируя его убиквитинизацию и уничтожение [21]. E7 у таких штаммов связывается и влияет на работу целого ряда белков, среди которых регуляторные белки и опухолевые супрессоры, такие как ретинобластомный фактор. Активность E6 и E7 приводит к неконтролируемому клеточному делению [22 и 18].

Поздние белки ВПЧ нужны для образования капсида и упаковки ДНК вируса. Основным структурным компонентом капсида папилломавирусов является белок L1, который образует пентамеры [23]. В состав одного капсида входит 72 пентамера. Капсид папилломавирусов имеет сферическую форму, однако в действительности он представляет собой икосаэдр с триангуляционным числом равным семи. Сферическая структура образуется не из комбинации гексамеров и пентамеров (как, например, в футбольном мяче), а из двух типов пентамеров. 60 пентамеров капсида ВПЧ образуют по 6 связей с соседними пентамерами, а 12 из них — по пять [2, глава 3]. Интересно, что строение L1 напоминает строение клеточных белков нуклеоплазминов, регулирующих упаковку нуклеосом [24]. На данный момент нет точного понимания, имеют ли L1 и нуклеоплазмины общего предка, или их схожесть результат конвергентной эволюции.

Минорный белок L2 также является структурным компонентом вирусной частицы. Один L2 приходится на один пентамер L1 [4]. По всей видимости, это белок важен для привлечения вирусных ДНК к собирающимся частицам. Существует гипотеза, что L1 и L2 могут взаимодействовать не непосредственно с нуклеиновой кислотой вируса, а с гистонами, которые ее компактизуют [4].

Каким конкретно образом ДНК уложена внутри вирсуной частицы, тоже не описано окончательно. Известно что в вирусоподобные частицы ВПЧ может быть упакована любая ДНК короче 8 тысяч пар нуклеотидов, что открывет перспективы для использовния ВПЧ в качестве трансформационных векторов. Интересно, что в распаковке капсида папилломавирусов участвует циклофилин — клеточный белок, также способствующий распаковке капсида, например ВИЧ [25].

Вакцины против ВПЧ

В настоящее время активно разрабатываются и внедряются вакцины против папилломавирусов. В основном они создаются против наиболее распространенных канцерогенных штаммов ВПЧ 16 и ВПЧ 18, а зтакже против ВПЧ 6 и ВПЧ 11, основной причины появления бородавок.

Доктор Кристофер Бак. Национальный института рака, США

Интерес к разработке вакцин был подогрет тем, что исследование связи папилломовирусов с раком шейки матки в 2008 году было удостоено Нобелевской премии в области физиологии и медицины. Немецкий ученый Харальд зур Хаузен (Harald zur Hausen) показал, что папилломавирусы являются причиной практически всех случаев рака шейки матки, второго по распространенности рака у женщин [1].

Сейчас часто начали диагностировать у пациентов вирус папилломы человека (ВПЧ) и после этого стал возникать извечный вопрос, что делать?

Для начала, хотелось бы немного рассказать о нем: определение вируса папилломы человека.

Если обобщить, то ВПЧ – инфекция может находиться в следующих формах:

Как проявляется ВПЧ – инфекция?

Основным симптомом инфекции вызванной вирусом папилломы человека является образование так называемых остроконечных кондилом.

Внешне остроконечные кондиломы похожи на обычные бородавки. Они могут иметь небольшие размеры (от нескольких миллиметров до сантиметра), розоватую или телесного цвета окраску, гладкую или слегка бугристую поверхность.

Чаще всего остроконечные кондиломы образуются в области наружных половых органов.

У женщин остроконечные кондиломы могут возникать вблизи клитора, на малых и больших половых губах, во влагалище и на шейке матки. В случае раздражения кондилом, располагающихся близко к входу во влагалище, возможно появление зуда и незначительного кровотечения во время полового акта.

У мужчин остроконечные кондиломы образуются на половом члене и мошонке.

Как правило, остроконечные кондиломы безболезненны. В некоторых случаях в области кондилом ощущается легкий зуд и дискомфорт.

Когда нужно обратиться к врачу?

Обязательно обратитесь к врачу, если вы заметили у себя на коже образования (бородавки, выросты) похожие на остроконечные кондиломы. Врач назначит вам необходимые обследования, которые помогут установить точную причину болезни и исключить другие заболевания, передающиеся половым путем.

Диагностика ВПЧ?

Для подтверждения диагноза папилломавирусной инфекции используется метод ПЦР (полимеразной цепной реакции), который позволяет определить ДНК вируса и точно установить, каким типом вируса заражен человек.

В современных диагностических лабораториях определяется тип вируса, его количество (вирусная нагрузка) и интеграция вируса в геном. В начале статьи приведена информация, которая показывает, что наиболее опасны ВПЧ высокого онкогенного риска (ВОР). Имеет значение кроме типа вируса, определение и его количества. От этого зависит тактика лечения. Интеграция вируса в геном клетки, к сожалению, в наших лабораториях не определяется. Этот анализ важен в ранней диагностике дисплазии эпителия шейки матки и неинвазивной карциномы.

Очень важно, чтобы все поняли, даже если ПЦР анализ выявит у вас онкогенные формы ВПЧ, это не означает, что у вас уже есть рак шейки матки или что вы неминуемо заболеете им в ближайшее время, так как, далеко не во всех случаях ВПЧ приводит к развитию рака. От момента заражения до появления предрака могут пройти годы.

Для того чтобы определить вызвал ли ВПЧ изменение клеток шейки матки и есть ли риск развития рака нужно обязательно пройти тщательное гинекологическое обследование, которое включает в себя обязательно :

• Кольпоскопию (осмотр шейки матки аппаратом, напоминающим микроскоп и позволяющий осматривать под увеличением от 8 до 20 крат).
• Цитологический мазок (ПАП тест), который используется для определения диспластических изменений в клетках шейки матки.
• Бактериоскопическое исследование выделений из влагалища. Часто ВПЧ-инфекция сочетается с другими инфекциями передающимися половым путем (примерно в 20% случаев), поэтому может быть необходимо дополнительное дообследование для определения хламидиоза, микоплазмоза, уреаплазмоза и трихомониаза.
• Прицельная биопсия – взятие кусочка ткани шейки матки в случаи наличия дисплазии или подозрения на злокачественную опухоль шейки матки.

Лечение ВПЧ

Поскольку полного излечения от папилломавирусной инфекции в настоящее время достичь невозможно (наряду с этим часто наблюдается спонтанное, самопроизвольное излечение), лечат проявления ВПЧ, а не присутствие вируса в организме. При этом эффективность различных методов лечения составляет 50-70 %, а в четверти случаев заболевание вновь проявляет себя уже спустя несколько месяцев после окончания лечения. Вопрос о целесообразности лечения каждой пациентки решается врачом индивидуально. При этом необходимо избегать факторов, снижающих иммунитет (переохлаждение, сильные эмоциональные стрессы, хроническое переутомление, авитаминоз). Существуют исследования, которые говорят о профилактическом эффекте ретиноидов (бета-каротин и витамин А), витамина С и микроэлементов, таких как фолаты, в отношении заболеваний, вызванных ВПЧ.

Среди методов лечения проявлений ВПЧ инфекции (остроконечных кондилом и папиллом) чаще всего используются:

1. Деструктивные методы - это местное лечение, направленное на удаление кондилом. Различают физические (криодеструкция, лазеротерапия, диатермокоагуляция, электрохирургическое иссечение) и химические (трихлоруксусная кислота, ферезол, солкодерм) деструктивные методы, а также хирургическое удаление кондилом. Цитотоксические препараты - подофиллин, подофиллотоксин (кондилин), 5-фторурацил. Женщинам детородного возраста на время лечения рекомендуют надежную контрацепцию или отказ от половой жизни.
2. Имунологические методы Наиболее часто для лечения ВПЧ-инфекции используются интерфероны (лаферон, лаферобион, альфарекин, реаферон, виферон). Они представляют собой семейство белков, которые вырабатываются клетками иммунной системы в ответ на стимуляцию вирусами. Отдельно стоит препарат Алокин-альфа, который стимулирует выработку собственного интерферона и активирует клеточный иммунитет.
3. Специфические противовирусные препараты (цидофовир, панавир, алпиразин). Известный противовирусный препарат ацикловир (зовиракс) не оказывает действие на ВПЧ. Из местных (влагалищных) препаратов противовирусным действием обладает Эпиген интим спрей и Бетадин.

Профилактика ВПЧ

Может быть неспецифическая и специфическая.

Неспецифическая включает предотвращение заражения ВПЧ половым путем, здоровый образ жизни с целью укрепления работы иммунной системы и сбалансированное питание включающее в себя бета-каротин, витамин А, витамина С и фолиевую кислоту.

Специфическая профилактика – вакцинация.

Вакцины для профилактики ВПЧ содержат органические вещества, структура которых похожа на структуру живых вирусов ВПЧ. Эти вещества ни в коем случае не могут вызвать болезнь.

После введения вакцины в организме человека начинают вырабатываться клетки иммунной системы, которые препятствуют внедрению ВПЧ в организм.

В настоящее время существует два типа вакцин против ВПЧ: квадривалентная Гардасил (Gardasil) и бивалентная Церварикс (Cervarix).

Церварикс предотвращает заражения ВПЧ 16 и 18, которые вызывают 70% всех случаев рака шейки матки и рака заднего прохода.

Гардасил, кроме защиты от ВПЧ 16 и 18 типов, предоставляет защиту ещё и от ВПЧ 6 и 11 типов, вызывающих 90% случаев бородавок на половых органах.

Гардасил и Церварикс защищают от заражения людей, которые еще не заражены ВПЧ соответствующего типа. Они не могут устранить вирус из организма человека, если он уже проник в него и не могут вылечить болезни (например, остроконечные кондиломы или дисплазию шейки матки) которые вирус уже успел спровоцировать. Именно по этой причине, прививки против ВПЧ рекомендуется делать в детском и подростковом возрасте, до начала половой жизни.

Таким образом, вакцина Гардасил защищает от заражения ВПЧ 6, 11, 16 и 18 типов и рекомендуется для профилактики рака и дисплазии шейки матки, рака влагалища и наружных половых органов у женщин, а также для профилактики рака заднего прохода и остроконечных кондилом у мужчин и женщин. Вакцина Церварикс защищает от заражения ВПЧ 16 и 18 типов и рекомендуется для профилактики рака и дисплазии шейки матки у женщин и рака заднего прохода у мужчин и женщин.

По состоянию на 2013 год вакцины зарегистрирована более, чем в 125 странах мира, почти в 20 странах входят в национальные календари прививок, в мире распространено 111 миллионов доз препарата.

Текст научной работы по медицине, диссертация 1998 года, Лаасри Мажид

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи ЛААСРИ МАЖИД

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ МУТАНТНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ Е6 И Е7 ВИРУСА ПАПИЛЛОМ

ЧЕЛОВЕКА тип 18.

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

доктор биологических наук профессор Киселев ФЛ.

Глава 1. Введение 1

Глава 2, Обзор литературы: Вирусы папилломы человека как модель 9

изучения молекулярных механизмов канцерогенеза.

2Л, Генетическая структура вирусов папиллом и их роль в канцерогенезе 9 V человека

2,2 Регуляция транскрипции вирусных генов 15

2.3.Трансформирующие гены вирусов папиллом 19 2.3,1, Ген Еб 19 23.2. Ген Е7 23

2.4. Функциональная кооперация онкобелжов Е-6 и Е7 29

Глава 3. Материалы и методы 31

3.1, Список использованных растворов и сред 3!

3 ^-Молекулярное клонирование 33

3.2 Л -Ферменты 3 3

3,2.2-Бактериальные штаммы и плазмиды 33

32.3-Трансформация бактерий Е.еоН. плазмидной ДНК 35

а). Получение компетентных клеток 35

б). Введение в клетки шгазмидной ДНК 35

3.2.4, Выделение плазмидной ДНК 36

3.2.5, Рестрикция и яигирование 37 3 2,6. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов 37

3.2.7. Секвенирование 38

3.2.8. Эяектрофоретическое разделение продуктов ееквенирования 38 в денатурирующем полиакрнламндном геле (ПААГ)

3.2.9. Амплификация ДНК 3 9

3.2.10. Клонирование генов Е6 и Е7 НРУ18 40

3.2.11. Сайт-направленный мутагенез 44

3.3. Получение и анализ культур клеток млекопитающих 46

3.3.1. Плазмиды и векторы 46

3.3.2. Клеточные линии 46 3.3,3 Трансфекция клеток млекопитающих 46

3.3.4. Выделение РНК и ДНК с помощью гуанидин изотиоцианата 47

3.3.5. Препаративное выделение специфических фрагментов 48 ДНК и:? агарозных гелей

3.3.6. Препаративный электрофорез ДНК в агарозных гелях. 49

3.3.7. Г ибридизация 49 3.3.7.1. Перенос ДНК из геля на нейлоновый фильтр (НуЬош! М+) 49

3.3.7.2. Получение молекулярных ДНК-зондов 50

3.3.7.3. Гибридизация ДНК, иммобилизованной на фильтрах 50

3.3.7.4. Авторадиография j I

3.3.7.5. Пробы для гибридизации 5 i 3.3.8. RT-PCR 51 3.33, Биологические свойства 53

3.3 3 ■. 1, Рост клонов 53

3.3.9.2. Измерение времени удвоения и насыщения плотности 53

3.3.9.3. Культивирование клеток в полужидкой среде 53

3.3.9.4. Введение клеток в сингенны крыс (линия Фишер) 54

Глава 4. Результаты исследования 55

4 2, Молекулярное клонирование 57

4.2.1, Анализ последовательностей вставки в шхазмиде рС7 57

4.2.2, Субкяонировшгае генов Бб и Б? 62

4.2.3, Получение и клонирование новых мутантных вариантов гена Е7 68 HPV тип 18.

4.3. Исследование биологической активности клонированных генов 73

4,3 Л, Трансфекция чувствительных клеток 73

4.3.2, Идентификация последовательностей трансфицированных генов 74

4.3.2.1. Саузерн б лот гибридизация 74

4.3.2.2. Полимер азная цепная реакция (PCR) 78 43. Экспрессия генов Еб и Е7 в трансфицированных клетках 81

4.3.4. Характеристики роста полученных клонов 85

4.3.5. Анализ морфологии клеток 89

4.3.6. Субстратная зависимость размножения клеток 89

4.3.7. Анализ туморогенности полученных клонов 90 Глава 5. Обсуждение результатов 93 Глава 6. Выводы 98 Глава 1, Список литературы J 01

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

HPV вирус папиллом человека

EMBI, - Европейский Банк данных молекулярной биологии

€Ш - интразпителиальная днеплазия

URR -регуляторный район HPV

pRB -белковый продукт гена ретинобластом ы

н.п. - нуклеотидная пара

тл.я. -тысяча иуклеотидных пар

ФНГ1 -фланкирующая последовательность

CR -консервативный район

ND •• анализ не проводился.

pRB bdg - сайт связывания ретинобластомы бедка

/ ловя 1* Введение

В силу этого целью настоящего исследования было изучение биологического потенциала генов Еб и Е7 HPV 18 типа, т.к. существует предположение о том, что HPV именно этого типа обнаруживается в более агрессивных опухолях шейки матки. Тема настоящей работы является

актуальной как в теоретическом, так и в практическом плане, т.е. получение любого генетического маркера, обладающего биологическим эффектом на грансфицированные им клетки, является необходимым для дальнейшего прогресса биологии, медицины и онкологии в частности. Для выполнения этой задачи были использование экспериментальные модели, полученные в лаборатории молекулярной биологии вирусов ранее: иммортализованые клетки крыс IE5 и плазмида рС7, содержащая гены Её и Е7, обладающая трансформирующим эффектом на эти клетки. Гены Еб и Б? HPV (В были субклонированны и установлено, что эти гены в дополнение к нескольким бессмысленным мутациям, содержат по одной точечной мутации в С концевой области. С помощью сайт - направленного мутагенеза было получено еще 2 варианта гена Е7 по доменам CR1 и CR2 и показано, что точечная мутация по кодону 24 (CR2 домен) элиминирует трансформирующий потенциал вируса. Таким образом, полученные нами клоны генов Е6 и Е7 дополняют коллекцию существующих вариантов этих генов и получение результаты нереданы в Европейский Банк Молекулярной Биологии (EMB L).

1 шва 2. Обзор шжершпуры Вирусы попито мы человека как модель изучения молекулярных механизмов канцер о генз а,

2.1. Генетическая структура вирусов папиллом и их роль в канцерогенезе у человека.

За последние десятилетие особый интерес к изучению вирусов папиллом вполне объясним. После того как в середине 70-х годов было высказано предположение [1], что вирусы папиллом человека (HPV) являются этиологическим агентом рака шейки, эта область вирусологии и онкологии подучила стремительное развитие. С одной стороны, это привело к твердым доказательствам этнологической роли HPV при данной формы рака, что окончательно подтверждено в Бюллетене Всемирной Организации Здравоохранение [2], а с другой -способствовало стремительному прогрессу в анализе не только вирусов этой группы, но и механизмов превращения нормальной клетки в опухолевую под действием этих вирусов,

В настоящем обзоре мы не ставили своей задачей представление всех данных по доказательству роли HPV в возникновении раки шейки матки, таких как частота встречаемости вирусной ДНК в опухолях, экспрессия этой ДНК. форма ее персистентнии. эпидемиологические данные (об этом

подробно см. раздел 2.3), а хотели бы акцентировать особое внимание на тех вирусных генах, которые играют ключевую роль в процессах злокачественной трансформации клеток.

Известно более 100 типов вирусов папиллом человека [3]. Одной из наиболее характерных особенностей вирусов этой группы является отсутствие адекватной чувствительной клеточной модели для их размножения, поэтому подавляющее большинство вирусов этой группы идентифицированы на основании выявления в зараженных клетках вирусной ДНК, последующего ее клонирования и секвенирования.

Фактически все HPV можно условно разделить на две большие группы, которые ассоциируются либо с поражениями кожей, либо поражениями слизистых ободочек. Наиболее типичными проявлениями инфекции кожи являются доброкачественные бородавки, а слизистых - предраковые и раковые поражения шейки матки [4].

Все HPV имеют весьма сходную структуру. Они содержат ДНК в 8.000 пар оснований, содержащую 9 открытых рамок считывания, причем две из них (LI и L2) кодируют структурные белки вириона, остальные 7 (El - Е?) относятся к так называемым "ранним" вирусным генам, контролирующим функции, необходимые для репродукции и проявления патогенного потенциала [5].

Среди всех известных HPV лишь сравнительно небольшое количество связано с различными злокачественными поражениями. К числу "кожных" вариантов HPV, относятся те, которые были обнаружены при бородавчатой эшщермодисшгазии, заболевании, при котором пноскокпеточные

карциномы возникают ш папиллом в результате воздействия солнечной радиации [6]. Наиболее часто при этом заболевании выявляется HPV 5 типа, а существенно реже HPV других типов (типы 8,14,17,20) [7], и поскольку отсутствуют какие-либо клеточные модели этого заболевания о механизмах (Ьункниониоования вирусов (этих типов) практически ничего неизвестно,

Наиболее серьезные данные о связи HPV с канцерогенезом у человека были получены для вирусов, выявляемых в слизистых оболочках прежде всего при раке шейки матки. Пионерские исследования группы zur Hansen Н, [8-!1| в середине 80-х годов убедительно показали, что как миниум 2 типа HPV: 16 и 18 типов выявляются при раках шейки матки, в то время как при доброкачественных поражениях были обнаружены в основном HPV 6 и 1! типов. В дальнейших исследованиях еще несколько типов HPV было обнаружено как при раках шейки матки, так и при других злокачественных поражениях аногенитальной области у женщин, и у мужчин (типы 31, 33, 35, 39,45, 51, 52,56, 58, 59, 66, 70), в то же время количество новых типов HPV, которые были выделены из папиллом (доброкачественных поражений) этой области, и папиллом ротовой полости было существенно меньше (типы 3,

! ? 'i > Ч ? ч Г i - Vi

К настоящему времени сложилась ситуация, что при использовании соответствующих чувствительных методов исследований, ДНК HPV различных типов выявляются более, чем в 90% опухолей шейки матки. Это

является важным аргументом в пользу того, что присутствие вирусного генетического материала необходимый фактор для превращения

нормальных клеток в опухолевые.

На основании вышеизложенных данных все HPV, выделенные при доброкачественных и злокачественных неоплазиях, были разделены на так называемые HPV "низкого" и "высокого" риска. Анализ этих 2 классов HPV не выявил принципиальных структурных отличий в генетической структуре - и те и другие содержат по 2 структурных гена (L1 и L2) и 7 функциональных генов (El - Е7) (рис.1). Кроме того, в составе всех HPV была идентифицирована регуляторная область (URR - upstream regulatory region), локализующаяся непосредственно перед генами Е6 и Е7. В URR было выявлено значительное количество сайтов, способных взаимодействовать как с позитивными, так и негативными факторами транскрипции. Необходимость такого взаимодействия очевидна, исходя из того, что инфекция HPY для плоскоклеточного и слизистого эпителия является персистентной и вызывает ускоренную пролиферацию зараженных клеток. Для достижения такой инфекции вирус должен инфицировать банальные клетки, поскольку только эти клетки эпителия способны к размножению. Эти клетки активируют все остальные клетки вышележащих слоев, которые в процессе дефференцировкн теряют способность к размножению и отслаиваются от поверхности. Репликация вирусной ДНК, экспрессия поздних генов и сборка вирионов тесно связаны со стадией дифференцировки и происходят только в верхн ел ежащих клеточных слоях.

На разных стадиях инфекции после проникновения вирусной ДНК в клеточное ядро транскрипция генов НРУ зависит в основном от клеточных транскрипционных факторов. На более поздних стадиях в регуляции

экспрессии как ранних, так и поздних вирусных функций принимают участие и вирусные факторы.

Вирусный геном в зараженных кллетках может персистировать как в эписомальной, так я в интегрированной формах [13] и первые данные свидетельствовали и том, что на ранних стадиях опухолевого процесса ( интраэпителиальной днсплазии - CIN) эписомальная форма является превалирующей, в то время как в карциномах основная масса вирусной ДНК интегрирована в клеточный геном [14]. Однако, в настоящее время столь однозначная трактовка этих результатов вряд ли справедлива. По-видимому, в опухолевых линиях, подученных из карцином шейки матки, в подавляющем большинстве случаев вирусная ДНК интегрирована в клеточную ДНК, в то время как в опухоли (где выявляется высокая гетерогенность клеточной популяции) возможно выявление обеих типов персистенции вирусной ДНК [15], Б какой степени, интеграция является определяющим фактором для поддержания опухолевого статуса клетки, остается неясным, поскольку отсутствует полная информация о том, какие типы РНК считываются с интегрированного и эписомального вирусного генома.

неэкспрессирующийся при интеграции

Рис.1 Структура генома папиллом человека 16 тала

1Л* Регуляция транскрипции вирусных генов.

Из представленных выше данных с очевидностью следует, что поддержание трансформированного фенотипа контролируется вирусными генами. В настоящее время можно считать установленным, что основными трансформирующими генами вирусов папиллом человека являются гены Е6 и Е7, экспрессия которых модулируется областью URB.. Размер этой области составляет от 800 до 1000 пар оснований для HPV различных типов и условно может оыть разделена на 3 участка - 5' область, центральный сегмент, и V- область, которая расположена непосредственно перед двумя вышеуказанными генами. За генами Е6 и Е7 локализуются гены Е! и Е2, причем последний перекрывает ген Е4, и ген Е5, который также возможно является трансформирующим геном. Сигнальная терминирующая последовательность для поли А локализуется на 3'-конце ранней области, Транскрипция РНК начинается с промотора в У - области URR, непосредственно перед началом гена Е6. Этот промотор получил обозначение Р97 для HPV 16 и PÍ05 для HPV 18. Промотор содержит 1АТА бокс и сайт инициации транскрипции, которые регулируются различными знхансерными элементами, локализованными в центральном и V = сегментах ORR. Именно они и узнаются клеточными факторами. 3f - область URR содержит также 2 сайта для вирусного траскрипционного фактора Е2, сайты связывания для клеточных транскрипционных факторов Spl и YYÍ и ориджины репликации с сайтом связывания для вирусного белка Ei,

Центральный сегмент URR содержит конститутивный энхансер, наиболее активный в эпителиальных клетках и зависящий только от клеточных факторов 16. В этом участке идентифицированы сайты связывают для различных клеточных факторов, включая API, NF1, Octl, TEF1, TEF2, YY1, рецепторы стероидных гормонов. Все эти факторы являются убнквнтарными и могут функционировать в клетках различных типов. 5' -участок URR содержит сигналы для терминации и полиаденилирования поздних вирусных транскриптов [18].

Среди многочисленных факторов, способных взаимодействовать с участком URR. имеется лишь один фактор вирусной природы (продукт гена Е2), активность которого может иметь существенное значение для функционирования трансформирующих генов HPV. URR HPV содержит 4 В2 - связующих сайта. Данные по действию Е2 на транскрипцию генов Е-6 и Е7 носят противоречивый характер. С одной стороны, белки-продукты гена Е2 могут функционировать в качестве репрессоров для промотора HPV 18 типа [20], а мутации по гену Е2 увеличивает уровень иммортализации под действием генов Е6 и Е? [21]. С другой стороны - имеются данные о том, что белки Е2 HPV 16 и 18 типов активируют промотор в URR [22]. По-видимому эти различия обусловлены синтезом различно сплайсированных aiРНК данного гена, приводящих к образованием белков Е2 меньшего размера. Именно белок Е2, утерявшей N-концевой, трансакхнвирующий домен, может интерферировать с активирующими потенциями полноразмерного белка Е2 [22]. Таким образом, регуляция активности генов Е6 и Е7 под действием продукта вирусного гена Е2 является достаточно

сложной, т.к. этот белок обладает двойной функцией - активатора и репрессора.

Среди многочисленных клеточных факторов, способных взаимодействовать с участком URR, отметим лишь некоторые из них, значимость которых для проявления функций генов Е6 и Е7 представляется очевидной, Это прежде всего фактор АР!, представляющий собой димерный белковый комплекс, содержащий по одному из представителей двух семейств генов Jim н fos. URR HPV 16 и 18 типов содержат соответственно 3 и 2 АР1 - связывающих сайтов. По-видимому, основная функция АР!-сайта - участие в определении специфичности транскрипта и уровня дифференцировки на транскрипционную активность ÜRR [23]. Другим важным регулятором Ö RR является фактор YY1, причем в данной системе он может функционировать как активатор и как репрессор транскрипции в зависимости от типа вируса, ти