Вирусвакцина сухая культуральная внивип против вирусного энтерита гусей

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Михайлов Александр Олегович. Иммунобиологические свойства инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей : диссертация . кандидата ветеринарных наук : 06.02.02 / Михайлов Александр Олегович; [Место защиты: С.-Петерб. гос. акад. вет. медицины].- Санкт-Петербург, 2010.- 109 с.: ил. РГБ ОД, 61 10-16/103

Введение к работе

Серьезным препятствием на пути развития промышленного гусеводства наряду с факторами нарушения технологического режима выращивания являются различные инфекционные болезни молодняка, среди которых особое место занимает вирусный энтерит (парвовирусная инфекция) гусей. Это заболевание до настоящего времени имеет широкое распространение среди молодняка 1-30-суточного возраста, протекает остро и характеризуется высокой смертностью,достигая до 90-100% (В.В. Малушко, 1982; Л.М. Контримавичус, 1983; Б.Б. Трефилов, 2000; А. Белецкая, 2003; Б.Б. Трефилов с соавт, 2009; Derzsy D. et al., 1966; Varga J., 2000).

С профилактической и терапевтической целью при вирусном энтерите гусей применяют цитратную кровь и сыворотку крови гусей - реконвалесцентов (Л.М. Контримавичус, 1984; B.C. Фадин, 1975; Б.Б. Трефилов, 2009; Coudert М. et al, 1973), гипериммунную сыворотку млекопитающих ( В.В. Малушко с соавт, 1980; А.Ф. Бондаренко, 1982) и гипериммунную гусиную сыворотку крови ( Б.Б. Трефилов, 2008; Derzsy D., 1970; Bernath S., Szalai R, 1970).

Однако в комплексе мероприятий по предупреждению и ликвидации вирусного энтерита гусей (ВЭГ) важная роль отведена вакцинопрофилактике.

Несмотря на широкое применение вирусвакцины ВНИВИП сухой культуральной против ВЭГ в Российской Федерации и странах СНГ, проблема борьбы с этой болезнью остается весьма актуальной.

Исходя из изложенного, разработка высокоэффективной и технологичной инактивированной вакцины против ВЭГ, применяемой в условиях промышленного гусеводства, фермерских хозяйств и личного подворья - остается востребованной в связи с:

- отсутствием отечественного инактивированного вакцинного препарата против
вирусного энтерита гусей;

недостаточно длительным напряженным иммунитетом при применении живых вакцин против вирусного энтерита гусей;

сокращением количества вакцинаций с целью уменьшения стрессов и нагрузки на

- потребностью в вакцинном препарате, не содержащем живого вируса.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка технологии изготовления инактивированнои вакцины против вирусного энтерита гусей и изучение ее иммунобиологических характеристик.

Для достижения ее было необходимо решить следующие задачи:

подобрать производственный штамм вируса энтерита гусей и изучить его биологические характеристики;

изучить оптимальные системы культивирования вируса и его инактивацию;

разработать компонентный состав инактивированнои вакцины против вирусного энтерита гусей;

изучить физические параметры и иммунобиологические свойства инактивированнои вакцины;

изучить динамику формирования поствакционального иммунитета у вакцинированных гусей.

Научная новизна. Впервые разработана отечественная инактивированная эмульсионная вакцина против вирусного энтерита гусей.

Обоснованы режимы инактивации вируса энтерита гусей формальдегидом и димерэтиленимином. Изучена кинетика инактивации вируса.

Научно обоснован компонентный состав инактивированнои сорбированной и эмульсионной вакцины, определены оптимальные соотношения антигена и адъювантов. Доказана ее безвредность и высокая антигенность и способность индуцировать длительный поствакцинальный иммунитет у гусынь по сравнению с вирусвакциной ВНИВИП.

Практическая значимость работы. Полученные результаты исследований послужили основанием для разработки технологии изготовления инактивированнои вакцины и подготовки нормативной документации на вакцину против вирусного энтерита гусей:

Россельхозакадемии, 2010 года.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

Схема получения вируссодержащего сырья для изготовления инактивированной вакцины;

Инактивация вируса энтерита гусей димерэтиленимином;

Компонентный состав инактивированной сорбированной и эмульсионной вакцины;

Физические и иммуногенные характеристики инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с ведущим научным сотрудником Никитиной Н.В., за что автор выражает ей сердечную благодарность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, в том числе одна работа в издании, рекомендованном ВАК РФ, уведомление о поступлении и регистрации заявки №2010100456 от 12.01.2010 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и список литературы, приложения. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами, 6 рисунками. Список использованной литературы включает 243 источника, из них 121 зарубежный.

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка и внедрение средств диагностики и специфической профилактики наиболее опасных вирусных болезней птиц"

1. В качестве вакцинного предложен аттенуированный штамм "ВНИИБП", который по основным генетическим маркерам (физико-химическим, антигенным и иммунобиологическим свойствам) соответствует эталонным штаммам вируса ИЛТ. Отличия штамма "ВНИИБП" от "ЦНИИПП" заключаются в низкой патогенности для эмбрионов и реакто-генности для цыплят, антигенной специфичности, отсутствии гемагтлютиногенности и цитопатогенности, и выраженной иммуногенности при индивидуальных и групповых методах иммунизации. Штамм генетически стабилен, нереверсибелен и способен к длительной персистенции в организме иммунной птицы. Обнаруживается определенная коррелятивная связь между некоторыми генетическими признаками (и, К, гс135, ТС, 11> и патогенностью (РсЪе, Рс^ь Рбр^)

2. Разработана и освоена технология изготовления вирусвакцины против ИЛТ из штамма "ВНИИБП". Предложенные методы контроля позволяют выпуск высококачественной вакцины из штамма "ВНИИБП". Вакцина менее реактогенна и более иммуноген-за по сравнению с вакциной из штамма "ЦНИИПП" при аэрозольной вакцинации и безвредна при клоачном, окулярном и энтеральном методах введения. Напряженность и гродолжительность иммунитета цыплят зависят от метода и кратности введения, дозы закцины и возраста привитой птицы. При вакцинации цыплят в возрасте 60 и более сут остойчивость их сохраняется в течение всего срока эксплуатации птицы. Для оценки >ффективности иммунизации предложен метод контрольного заражения цыплят виру-юнтным вирусом ИЛТ и определения уровня антител в РН.

3. Схемы применения вакцины необходимо корректировать для каждого птицехозяй-;тва в зависимости от конкретной эпизоотической ситуации. Наиболее эффективна дву-;ратная вакцинация птицы с интервалом 16-20 сут.

4. Изучены эпизоотологические особенности вирусного энтерита гусей, клинические :имптомы и патологоан атомические изменения у больных и павших гусят, что позволяет [редварительно ставить диагноз в хозяйстве. Окончательный диагноз подтверждается в ибораторных условиях изоляцией вируса в гусиных эмбрионах, в культурах клеток первичных или перевиваемых), идентификацией в реакции нейтрализации и РДП, с из-естной гипериммунной сывороткой к парвовирусу гусей.

5. Клонированы эпизоотические штаммы вируса энтерита, изучены их иммунобиоло-ические свойства и селекционирован алатогенный вакцинный "клон 6" штамма "П-75".

По морфологической и антигенной структуре, а также основным иммунобиологически признакам "клон 6" принадлежит к парвовирусу гусей. Вакцинный "клон 6" неревера белен, апатогенен для гусят и обладает выраженной антигенностью и иммунногеннс стью.

7. Вирусвакцина ВНИВИП из "клона 6" предназначена для специфической профилак тики в стационарно неблагополучных хозяйствах и в хозяйствах с острой вспышкой бо лезни. Вакцина при двукратной иммунизации родительского стада перед яйцекладко! или однократной - гусят в 1-2-сут возрасте индуцирует резистентность молодняка на вес восприимчивый период. Вакцинация гусепоголовья в комплексе с ветеринарно санитарными мероприятиями обеспечивает устойчивое благополучие хозяйств по вирус ному энтериту гусей.

8. Анализ эпизоотической ситуации по реовирусному теносиновиту кур в РФ за по следнее десятилетие (1990-1999 гг.) свидетельствует о широком распространении болез ни. Методом ИФА и МФА установлена персистенция возбудителя РТ в 90-95% обследо ванных птицехозяйствах, специализирующихся на кроссе Ломан браун и мясной птице Выявлен широкий спектр патогенности вирусных изолятов, циркулирующих на террито рии страны.

9. Изучена специфичность метода ИФА при реовирусном теносиновите кур. Оптими зированы основные параметры постановки ИФА по иммуноспецифическим и неспеци фическим компонентам набора диагностикума. Разработан набор компонентов для диаг ностики РТ кур иммуноферментным методом и освоена технология его изготовления Набор предназначен для выявления в сыворотке крови и желтке яиц кур специфически? антител к вирусу РТ иммуноферментным методом и применяется для ретроспективно< диагностики и оценки поствакцинального иммунитета против РТ.

10. Атгену'ирован вакцинный штамм "ВНИВИП-ДЕП" методом перемежаюшихо пассажей на КЭ и культуре клеток. Изучены генетические признаки штамма на разлиЧ' ных биологических моделях и антигенные взаимоотношения с полевыми изолятами Установлено его антигенное родство с эпизоотическими штаммами, выраженная имму-ногенность и отсутствие патогенности для цыплят. Отработаны оптимальные параметры культивирования вируса.

11. Предложена для серийного производства и применения в условиях птицеводства вирусвакцина ВНИВИП против РТ сухая культуральная из штамма "ВНИВИП-ДЕП" Она предназначена для специфической профилактики заболевания, является безвредной и формирует поствакцинальный иммунитет, обеспечивающий устойчивость птицы ь заражению. Отработана схема вакцинации цыплят, включающая: двукратное введение живой вакцины в 7-10- и 35-40-сут возрасте и ревакцинацию инактивированной вакциной в возрасте 105-110-сут. Серологическая оценка напряженности поствакцинального иммунитета проводится методом ИФА. При уровне антител 1:400 - 1:800 птица устойчива к заражению.

5. Практические предложения

В ветеринарную практику внедрены' вирусвакцины против ИЛТ из штамма 'ВНИИБП", ВЭГ из "клона 6" и РТ из штамма "ВНИВИП-ДЕП". Они зарегистрированы в Российской Федерации, производятся серийно на биологических предприятиях и широко трименяются в птицеводческих хозяйствах России и стран СНГ.

Для лабораторий государственной ветеринарной службы и лабораторий птицехо-¡яйств предложены методы лабораторной диагностики ИЛТ и ВЭГ, а также метод ИФА 1ля серологической оценки напряженности иммунитета и ретроспективной диагностики эеовирусного теносиновита кур.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Трефилов Б.Б. Культивирование вакцинных штаммов вируса инфекционного ларин-готрахеита при различной температуре.//Матер. научно-произ.конф.по профил.и ле-чен.бол.птиц и с/х ж-х. Псков, 1970,29-33. !. Трефилов Б.Б. К вопросу об иммуногенности вакцинного штамма ЦНИИПП вируса ИЛТ птиц.//Тезисы докл.научно-произ.конф.по проф.и мерам борьбы с болезнями молодняка с/х ж-х. Минск, 1970, 74-76. I. Трефилов Б.Б. Биологические свойства вакцинных штаммов вируса ИЛТ, культивируемые в культуре фибробластов куриных эмбрионов. //Матер.всесоюз.научн.совещан.и конференций. Загорск, 1972, вып.4,367-372. Трефилов Б.Б. Изучение гемадсорбирующей и гемагглютинирующей активности вакцинного и эпизоотического штаммов вируса инфекционного ларинготрахеита. // Болезни птиц (сб.трудов, вып.10/21), 1972,236-240.

Трефилов Б.Б. Изучение чувствительности вакцинных штаммов вируса ИЛТ к некоторым физико-химическим факторам. // Тезисы докладов всесоюз.межвуз.конфер.по вег.вирусол., 1, М., 1973, 5-6. . Трефилов Б.Б. Бляшкообразующая и интерфероногенная активность вакцинных штаммов вируса ИЛТ птиц. // Научн.основы промышл.произ.яиц и мяса птицы, 38, 1974,244-248.

Трефилов Б.Б. Антигенная специфичность и степень нейтрализации специфической антисывороткой вакцинных штаммов вируса ИЛТ птиц. // Научные основы про-мышл.произв. яиц и мяса птицы, 38, 1974, 248-251.

Трефилов Б.Б., Малушко В.В. Испытание экспериментальной инактивированной ЭГОА вакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц. // Актуальные проблемы развития птицеводства (Матер.науч.конф.), 8. Загорск, 1974,98-101. Урбан В.П., Колабская Л.С., Колупаева Т.Д., Трефилов Б.Б. Влияние куриного им-муноглобулинового препарата на резистентность организма цыплят при экспериментальном ИЛТ. // Лечение и проф.болезней с/х ж-х и птиц (Матер.Ш научно-производ.конфер.), Л., 1975,2. 3. Трефилов Б.Б., Малушко В.В. Изучение некоторых генетических признаков вакцинных штаммов вируса инфекционного ларинготрахеита птиц. // Матер.научной кон-фер. К 50-летию УзНИВИ, Тайляк, 1976, 95-97

Малушко В.В., Трефилов Б.Б., Комиссаров К.П., Никитин Г.И. Генетические признаки и иммуногенная активность вакцин ЬТ-1УАХ и ЦНИИПП против инфекционного ларинготрахеита кур. // Сб.тр.Всесоюз.науч.-исслед.и технол.ин-та птицеводства, 1976, т.41,136-140.

12. Трефилов Б.Б., Малушко В.В. Методы лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита.//ГОСТ 25582-83, М. 1983

13. Малушко В.В., Щеглова И.В., Комиссаров К.П., Фадин B.C., Корнеева В.И., Трефилов Б.Б. Выделение вируса энтерита гусят и изучение его антигенной активности. // Лечение и проф. болезней с/х ж-х и птиц (матер.Ш научно-производ.конф.), Л., 1975, 3.

14. Трефилов Б.Б. Антигенная активность и родство штаммов-изолятов вируса энтерита гусят. // Передовой научно-производ.опыт птицеводства, 12(60), М., 1976,26-27.

15. Трефилов Б.Б. Патогенность и терморезистентность вируса энтерита гусей. // Тезисы докл. XIX конф.молодых ученых и аспирантов по птицеводству. Загорск, 1976, 5961.

16. Малушко В.В.,КудрявцевФ.С.,КомиссаровК.П.,Пожалова Р.Г.,Трефилов Б.Б. Об антигенном различии штаммов-изолятов вируса энтерита гусей. // Актуальные вопр.вет.вирусол., 1. Владимир, 1976, 165-167.

17. Малушко В.В.,Кудрявцев Ф.С.,Пожалова Р.Г.,Курганский Т.А.,Трефилов Б.Б. Культивирование вируса энтерита гусей в перевиваемых линиях клеток. // Научные основы вет.-проф.меропр.в промышл.птицев. Кишинев, 1977,37-39.

18. Щеглова И.В., Иващенко В.Г., Трефилов Б.Б. Применение гипериммунных сывороток для профилактики вирусного энтерита гусей. // Передовой науч.-произв.опыт в птицеводстве, М., 1980,30-31.

19. Малушко В.В., Иващенко В.Г., Щеглова И.В., Трефилов Б.Б. Вирусный энтерит гусей и меры борьбы с ним. //Актуальные вопр.вет.вирусол. Казань, 1980, 15.

20. Трефилов Б.Б. Испытание формолвакцины против вирусного энтерита гусей в производственных условиях. // Передовой науч.-произв. опыт в птицеводстве, 3/Ш/, М., 1982,40-41.

21. Малушко В.В., Трефилов Б.Б., Конгримавичус Л.М, Щеглова И.В., Фадин B.C., Бон-даренко А.Ф. Эпизоотологическое состояние гусеводческих хозяйств, профилактика и меры борьбы с вирусным энтеритом гусей. //Ветеринария, 1983.

22. Малушко В.В., Трефилов Б.Б.,;, Щеглова И.В., Иващенко В.Г Предупреждение вирусного энтерита гусей. //Птицеводство, №5,1984.

23. Малушко В.В., Трефилов Б.Б. Вирусный энтерит гусей. // В кн.: "Профилактика наиболее опасных вирусных болезней птиц". Кишинев, 1985, 139-154.

24. Трефилов Б.Б., Щеглова И.В. Биологические свойства вируса энтерита гусей. //Тез. докл. к всес.н.-произ.конф."Комплексная система ветеринарных мероприятий в пти-цеводстве-резерв повышения эффективности производства", Л., 1989, 36-37.

25. Трефилов Б.Б., Клонирование вируса энтерита гусей. // Тез. докл.к всесоюз.н,-произ.конф."Комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеводстве-резерв повышения эффективности производства", Л., 1989,37-39.

26. Трефилов Б.Б. Разработка средств профилактики вирусного энтерита гусей. // Ветеринария, №6, 1990, 6.

27. Инструкция по изготовлению и контролю вирусвакцины сухой культуральной ВНИВИП против вирусного энтерита гусей. // Утв.ГУВ, 1990, 48.

28. Малушко В.В., Трефилов Б.Б., Щеглова И.В. Вирусвакцина сухая культуральная ВНИВИП против вирусного энтерита гусей. // ТУ 10-09-40-90, 21.

29. Наставление по применению вирусвакцины сухой культуральной ВНИВИП против вирусного энтерита гусей. // Утв.ГУВ №044-3,1990,.

30. Малушко В.В., Трефилов Б.Б. Болезни гусей и их профилактика. // Птицеводство, №4, М., 1992,.

31. Трефилов Б.Б. Производственные испытания вирусвакцины ВНИВИП против вирусного энтерита гусей. // Сб.н.трудов "Система мероприятий обеспечения эпизоотического благополучия птицеводческих предприятий", СПб., 1993, 41-49

32. Малушко В.В., Трефилов Б.Б., Щеглова И.В., Пожалова Р.Г. Штамм Goosa parvovirus для приготовления вакцинных препаратов против вирусного энтерита гусей. // Патент №1499917, 1993.

33. Трефилов Б.Б. Гуморальный и клеточный иммунитет при сочетанном применении вирусвакцины ВНИВИП против ВЭГ с иммуномодуляторами. // Вирусные болезни с/х ж-х. Тез.докл.Всерос.науч.-практ.конф. Владимир, 1995,278.

34. Трефилов Б.Б. Специфическая профилактика вирусного энтерита гусей. // Вирусные болезни с/х ж-х. Тез.докл.Всерос.науч.-практ.конф. Владимир, 1995,277.

55. Трефилов Б.Б. Эпизоотологические особенности вирусного энтерита гусей. // Сб.науч.трудов "Ветеринарная профилактика в промышленном птицеводстве". СПб-Ломоносов, 1996, 48-56.

J6. Трефилов Б.Б. Профилактика вирусного энтерита гусей. // Информац.листок №1-96. СПб-Ломоносов, 1996.

S7. Трефилов Б.Б. Проблема вирусного энтерита гусей в промышленном птицеводстве. //Матер.науч.-произ.конф., посвященной 190-летию высшего вет.образования в России и 100-летию вет.науки, т.2. СПб, 1998, 99.

18. Трефилов Б.Б., Шурчилов А.Ф., Мытарова Н.В. МФА для обнаружения реовируса теносиновита кур. //Тез.докл.межрегион.науч.-произ. координац. совещания "Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном птицеводстве". Петрозаводск-СПб, 1994,7.

19. Мытарова Н.В., Трефилов Б.Б., Королев A.M. Экспериментальный реовирусный теносиновит у цыплят. // Тез. докл. межрегион.науч.-произ. координац.совещания "Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном птицеводстве". Петрозаводск-СПб, 1994, 7-8.

Ю. Мытарова Н.В., Трефилов Б.Б. Изучение иммунобиологических свойств вируса теносиновита кур. //Тез. докл.межрегион.науч.-произ. координац. совещания "Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном птицеводстве". Петрозаводск-СПб, 1994,9-10.

И. Трефилов Б.Б., Никитина Н.В. Оценка иммуноферментной тест-системы для определения антител к вирусу теносиновита кур. // Вирусные болезни с/х ж-х. Тез.докл.Всерос.науч.-практ.конф. Владимир, 1995,271

2. Инструкция по изготовлению и контролю набора для диагностики реовирусного теносиновита кур иммуноферментным методом, 1998.

3. Никитина Н.В., Трефилов Б.Б. Набор для диагностики реовирусного теносиновита кур иммуноферментным методом. // ТУ 9388-009-00495674-98.

4. Временное наставление по применению набора компонентов для диагностики реовирусного теносиновита кур иммуноферментным методом. // Утв.Департаментом ветеринарии РФ № 13-7-2/1264 от 05.06.98.

45. Трефилов Б.Б., Сарбаева Н.В. Антигенная специфичность и степень нейтрализацю штаммов вируса теносиновита кур. // Вирусные болезни с/х ж-х Тез.докл.Всерос.науч.-практ.конф. Владимир, 1995, 272.

46. Трефилов Б.Б., Никитина Н.В. Реовирусная инфекция птиц. // Информационны? листок, №2-96. СПб-Ломоносов, 1996.

47. Korovin R.N., Trefilov В.В., Nikitina N.V. The problems of chickens reovirus infection ii Russia. // 10th European poultry conference ("The Poultry Industiy Towards the 21я Cen tury"). Jerusalem, Israel, June 21-26,1998,80.

48. Инструкция по изготовлению и контролю вирусвакцины ВНИВИП против реови-русного теносиновита кур сухой культуральной, 1998.

49. Трефилов Б.Б., Явдошак Л.И., Никитина Н.В. Вирусвакцина ВНИВИП против рео-вирусного теносиновита кур сухая культуральная. // ТУ 9383-008-00495674-98,15.

50. Трефилов Б.Б. Временное наставление по применению вирусвакцины ВНИВИП против реовирусного теносиновита кур сухой культуральной (в порядке широкие производственных испытаний в 1998-2000 гг.). // Утв.Департаментом ветеринарии РФ, №13-5-2/1260, 3 июня 1998.

51. Трефилов Б.Б. Штамм "ВНИВИП-ДЕП" для получения вакцины против реовирусного теносиновита кур.//"Приоритетная справка", №98108898/13 от 24.04.98.

52. Коровин Р.Н., Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Явдошак Л.И., Горецкая Т.И. Сухая вакцина против реовирусного теносиновита кур. Патент от 17.03.2000.

Увеличение выхода молодняка гусей, обеспечение его благополучного роста и развития это не только насущная необходимость для мобилизации резервов производства, но и решающий фактор эффективного ведения птицеводства, позволяющий удовлетворить потребность населения в продуктах питания, а промышленность – в сырье.

Анализ структуры заболеваемости по регионам и в целом по стране показывает, что в последние годы на фоне относительно стабильного благополучия по парвовирусной инфекции постоянно имеют место возникающие спорадические случаи болезни.

Существенными факторами, способствующими появлению случаев заболевания, следует считать создание благоприятных условий для пассирования условно-патогенных микроорганизмов: высокая плотность посадки поголовья, неоднородность его иммунологического статуса, оптимальные условия среды обитания для возбудителей, а также несвоевременное проведение противоэпизоотических мероприятий без учета биологии возбудителя, как его способности длительного бессимптомного персистирования в организме взрослого поголовья гусей.

В случае возникновения смешанных инфекций болезнь принимает массовый характер, взаимодействие возбудителей чаще всего характеризуется синергизмом.

Учитывая эти обстоятельства и принимая во внимание поток информации по парвовирусной инфекции в течение последних двух-трех десятилетий, убедили нас в актуальности и своевременности ее обобщения и издания монографии с включением результатов собственных экспериментальных и производственных исследований.

Результатами обширных исследований в 1973–2013 гг. сотрудниками отдела вирусологии и опухолевых болезней птиц ГНУ ВНИВИП в области патологии гусей в более 60 гусеводческих хозяйствах установлено, что болезнь вызывается парвовирусом из семейства Parvoviridae.

Сотрудниками отдела разработана технология биофабричного изготовления и методы контроля вирусвакцины сухой культуральной ВНИВИП против вирусного энтерита гусей (патент РФ № 2118539 , 1998). Экспериментальные и производственные испытания опытных и биофабричных серий вирусвакцины ВНИВИП показали ее безвредность, стабильность и высокую антигенную и иммуногенную активность, как на гусятах, так и на взрослых гусях. По результатам испытаний разработана нормативная документация на вакцину (СТО 00495674-0008-2008 и Инструкция по применению). Вирусвакцина сухая культуральная ВНИВИП против вирусного энтерита гусей зарегистрирована и внедрена в ветеринарную практику. В течение 25 лет эпизоотологическая обстановка по парвовирусной инфекции гусей в большинстве хозяйств РФ и СНГ контролируется данной вакциной.

Результаты лабораторных исследований и производственных испытаний позволяют утверждать о высокой эффективности инактивированного препарата, предназначенного для активной специфической профилактики болезни. На основе проведенных исследований разработана нармотивная документация на вакцину. В настоящее время применение аттенуированной и инактивированной вакцин в гусеводческих хозяйствах обеспечивает сохранность 95–98 % молодняка гусей.

Таким образом, в разделах, посвященных парвовирусной инфекции гусей, представлены современные взгляды на патогенные потенции возбудителя, на источники и резервуары инфекции, охарактеризованы клинико-эпизоотологические особенности проявления болезни, приведены методы обнаружения вируса и вирусного антигена, а также рассмотрены вопросы иммунитета, активной и пассивной специфической профилактики и меры борьбы.

В настоящей работе на основе литературных данных и результатов собственных исследований подробно рассматриваются как традиционные, так и экспресс-методы индикации вирусных антигенов, к числу которых относятся МФА, ИФА, электронная микроскопия и другие. Показана возможность применения полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанной на выявлении вирусспецифической нуклеиновой кислоты – ретракционного анализа ДНК. В перспективе ПЦР займет достойное место в арсенале средств и методов специфической индикации парвовирусов гусей и в диагностике вызываемой ими болезни.

Большое внимание в данной монографии уделено проблеме смешанных форм течения болезни молодняка. Приведенные материалы, несомненно, помогут практическим ветеринарным врачам осмыслить и принимать адекватные суждения о роли ассоциации различной природы возбудителей в этиопатогенезе этой формы патологии и, конечном итоге, профессионально интерпретировать обнаруживаемые в органах и тканях изменения, вызываемые вследствие наслоения или одновременного инфицирования ими молодняка гусей.

Рассматривая вопросы специфической профилактики парвовирусной инфекции, авторы обращали особое внимание на обобщение эффективности результатов испытаний предлагаемых специалистами аттенуированных и инактивированных вакцин. Оказалось, что большинство исследователей отдает предпочтение инактивированным вакцинам, их безопасность более гарантирована в связи с отсутствием возможной способности персистировать и интегрировать в геном клеток организма хозяина.

Нет сомнений в том, что в перспективе на смену живым вакцинам придут более эффективные инактивированные препараты, введение которых обеспечит привитой птице иммунологическую перестройку достаточную для того, чтобы формировался напряженный длительный поствакцинальный иммунитет.

Серьезным препятствием на пути развития промышленного гусеводства наряду с факторами нарушения технологического режима выращивания являются различные инфекционные болезни молодняка, среди которых особое место занимает парвовирусная инфекция гусей (болезнь Держи). Эта болезнь до настоящего времени имеет широкое распространение в гусеводческих хозяйствах, протекает остро и сопровождается высокой смертностью среди гусят 1–30-суточного возраста, достигая до 60–100 % [1, 2, 3, 6, 12].

Данные эпизоотологических и клинических наблюдений, патологоанатомической картины и лабораторных исследований свидетельствуют о том, что парвовирусная инфекция (ПВИ) гусей протекает как моноинфекция и как смешанная инфекция с бактериальными, грибными и паразитарными болезнями (сальмонеллезы, колибактериоз, аспергиллез и кокцидиозы) [6, 11].

Диагностика смешанных инфекций связана со значительными трудностями и требует комбинированного использования современных вирусологических и микробиологических методов исследования.

Для серодиагностики широко используют реакцию нейтрализации в культуре клеток, которая высокоспецифична, но наряду с этим она дорогостоящая, методически трудоемкая и связана с сезонностью репродуктивного периода гусей [5, 12].

Серологическая диагностика ПВИ гусей с применением иммуноферментного анализа (ИФА) является наиболее распространенной, как в аспекте ретроспективного отслеживания возможных вспышек заболевания, так и для оценки эффективности специфической профилактики [4, 10].

Учитывая очевидную перспективность ИФА, разработка чувствительного и специфического метода выявления и оценки концентрации антител к парвовирусу в сыворотке крови гусей, используемого для серологического контроля за распространением ПВИ в популяциях гусей и оценки эффективности иммунизации поголовья против данной болезни является актуальной.

Целью исследований явилась разработка тест-системы для выявления антител к парвовирусу в сыворотке крови гусей методом иммуноферментного анализа.

Материалы и методы исследований

Химические агенты: аминоэтилэтиленимн (АЭЭИ), тиосульфат натрия (Na2S2O3).

Культуру клеток готовили из 14–15 – суточных гусиных эмбрионов (КЭГ) по общепринятой методике [8].

Вирус инактивировали АЭЭИ в режиме перемешивания в течение 24 ч при температуре (37,0 ± 0,5) °С. Нейтрализацию АЭЭИ проводили 2М раствором тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,03 М/дм3. Полноту инактивации вируса определяли последовательными трехкратными пассажами в культуре КЭГ.

Очистку вируссодержащего материала проводили методом гельхроматографии на макропористом стекле (МПС), обработанном 4 % раствором поливинилпирролидона.

Иммуноглобулины G (IgG) выделяли из нормальной сыворотки крови гусей. Осаждение сывороточных иммуноглобулинов проводили 30 % раствором сернокислого аммония с последующей очисткой на колонке с Sephadex G-200.

Статистическая обработка данных. Для статистической обработки данных использовали общепринятые методы вариационной статистики, применяя компьютерную программу Microsoft Excel.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа.

1.1. Получение очищенного парвовируса гусей. Парвовирус гусей репродуцировали в культуре клеток гусиных эмбрионов. Активный антиген парвовируса получали из культуральной вируссодержащей жидкости с титром не ниже 7,5 ± 0,2 lg ТЦД50/см3.

Вируссодержащую культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут. Вирус осаждали центрифугированием при 160000 g в течение 1,5 часов и очищали методом молекулярно-ситовой хроматографии на макропористом стекле с диаметром пор 700Å в 0,01М натрий-фосфатном буфере с содержанием 0,15 М хлорида натрия, рН 7,2 ± 0,2. Очистка вируса составила 98,5 %, с концентрацией белка 30–40 мкг в 0,1 см³.

1.2. Получение специфической (иммунной) сыворотки крови. Для получения специфической гипериммунной сыворотки крови к парвовирусу использовали клинически здоровых 30-суточных гусят, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней: ньюкаслская болезнь, гепатит, аденo-, рео- и парвовирусная инфекции гусей. Экспериментально было показано, что оптимальным методом получения гипериммунной сыворотки крови гусей является трехкратное введение птице очищенного вируса по схеме: двукратное введение антигена вируса подкожно в объеме 0,5 см³ с интервалом в 7 сут. Третья иммунизация через 7 сут. внутрибрюшинно в объеме 1,0 см³. Через 14 сут. после последней иммунизации гусей тотально обескровливали путем взятия крови из сердца. Активность гипериммунной сыворотки определяли в реакции нейтрализации на культуре клеток гусиных эмбрионов в β-варианте, ее активность равнялась 9,0 lоg2, а титр в ИФА составил 1:4000.

Нормальную сыворотку крови гусей получали от клинически здоровых 30-суточных гусят, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней птиц, в том числе к парвовирусу гусей, для отрицательного контроля в ИФА и получения антивидового иммунопероксидазного конъюгата.

1.3. Выделение IgG из нормальной сыворотки крови гусей проводили сульфатно-риваноловым методом. Фракцию, содержащую IgG(Н + L), очищали с помощью гельхроматографии на Sephadex G-200 и идентифицировали иммуноэлектрофорезом. Содержание белка в полученном материале составило 10,5 мг/см³ по Лоури. Выделенные IgG(Н+L) использовали для получения иммунопероксидазного конъюгата.

1.4. Конъюгат получали методом периодатного окисления и очищали от несвязавшейся пероксидазы на колонке с сефадексом G-200. Отбирали пиковые фракции с коэффициентом связывания от 0,4 до 0,6, так как при этих значениях достигается оптимальное соотношение фермента с IgG(Н + L) в конъюгате, когда каждая молекула иммуноглобулина связана с одной или более молекулами пероксидазы.

2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к парвовирусу гусей.

2.3. Количественная оценка титра антител к парвовирусу гусей методом одного разведения. Для определения конечного титра тестируемой сыворотки по одному разведению использовали метод регрессионного анализа. При исследовании проб сыворотки, имеющих разную активность, определяли корреляцию между значениями lg S/P и lg T, установленными для разведений сыворотки 1:100, 1:400 и 1:800, и проводили построение соответствующих математических моделей. Установлено, что наиболее высокое значение коэффициента корреляции определено для разведения сыворотки 1:400, которое и было принято за рабочее. Уравнение линейной регрессии lg T = 1,4128 (lg S/P) + 3,5575 для разведения сыворотки 1:400 было использовано для расчета числового значения титра.

Определение диапазона допустимых значений оптических плотностей (ОП) отрицательного и положительного контролей является обязательным для разрабатываемой тест-системы ИФА. Установлено, что разница показателей средних значений ОП положительного и отрицательного контролей в разведении 1:400 должна быть в диапазоне 0,340–0,980. Среднее значение ОП отрицательного контроля в разведении 1:400 не должно превышать 0,200.

2.5. Оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы проводили путем сравнительного анализа результатов тестирования проб сыворотки крови гусей в ИФА и реакции нейтрализации (РН), которая является классическим тестом серологической диагностики вирусных болезней. Результаты исследования представлены в таблице.

Параллельное тестирование сыворотки крови гусей различной активности показало, что корреляция между результатами исследования в ИФА и РН составила 97 %, 96 % и 95 % соответственно. С отрицательными и гетерологичными сыворотками крови гусей результаты иммуноферментной реакции были отрицательными (P