Вирусные супрессоры рнк интерференции

Цена:

Авторы работы:

Научный журнал:

Год выхода:

БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып. 8, с. 1062 - 1069

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ СУПРЕССИИ РНК ИНТЕРФЕРЕНЦИИ ВИРУСАМИ РАСТЕНИЙ

Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева, Казахстан, 10008Астана, ул. Мунайтпасова, 5; электронная почта: romarov@gmail.com

Поступила в редакцию 22.02.10

В регуляции экспрессии генов эукариот важную биологическую роль играет молекулярный процесс РНК интерференции (RNA interference (RNAi)). Показано также, что RNAi является адаптивным защитным мо-лекулярно-иммунным механизмом, направленным против вирусных заболеваний. Антивирусная RNAi инициируется с генерации коротких интерферирующих РНК (short interfering RNAs (siRNAs)), которые используются в последующем распознавании и деградации вирусных молекул РНК. В ответ на защитную реакцию растений большинство вирусов кодируют специфические белки, способные противодействовать RNAi, этот процесс известен как супрессия RNAi. Вирусные супрессоры действуют на различных этапах RNAi и обладают биохимическими свойствами, которые позволяют им эффективно противодействовать защитной системе растений. Современные молекулярные и биохимические исследования нескольких вирусных супрессоров значительно расширили наше понимание всей сложности природы супрессии RNAi, а также механизмов взаимодействия между вирусами и растениями.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: РНК интерференция, вирус, растение, супрессор, супрессия.

RNAi, изначально известная как пост-транскрипционное умолчание генов (post-transcrip-tional gene silencing (PTGS)) в растениях, представляет собой процесс, который играет ключевую роль в регуляции экспрессии генов. RNAi у высших растений является естественной молекулярной составляющей устойчивости, приводящей к селективному распознаванию вирусов и их последующей деградации.

Изначально пусковым механизмом RNAi является синтез длинных двухцепочечных молекул РНК (dsRNA) [1]. Следующим функциональным шагом RNAi является действие ферментов Dicer (Dicer-like DCL)-(членов группы РНКазы III), катализирующих образование коротких интерферирующих молекул РНК (short interfering RNAs (siRNAs)) или микро РНК (microRNAs (miRNAs)) 20—30 нуклеотидов (нт) длиной с 2 нт липкими З'-концами [2, 3]. Эти небольшие молекулы РНК могут образовываться в результате энзиматического гидролиза длинных репликативных форм вирусных РНК, а также трансгенов и транспозонов [4, 5]. При вирусной инфекции растений siRNAs могут образовываться непосредственно из вирусного гено-

* Адресат для корреспонденции.

ма, однако получены данные, указывающие на участие РНК-зависимых РНК полимераз (RNA dependent RNA polymerases (RDRP)) в амплификации данных ключевых РНК молекул [3—6].

Последние исследования на растениях показали, что ферментативное метилирование siRNAs также играет важную функциональную роль в обеспечении стабильности этих молекул от процесса олигоурдилации с их последующей деградацией [7]. Метилирование siRNAs происходит на их З'-концах, и эта ферментная модификация катализируется метилтрансферазой (HEN1) [8, 9].

сальные компоненты RISC. AGO белки характеризуются наличием специфических консервативных доменов, которые носят название PAZ и PIWI [11]. Структурные исследования показали, что PAZ домен напрямую взаимодействуют с siRNA [12]. Более того установлено, что PAZ домен взаимодействует с З'-концами siRNAs. PIWI домен в AGO белках представляют собой ключевой каталитический центр, так как он обладает эндонуклеазной активностью [10, 13].

В ответ на действие RNAi вирусы выработали специфические стратегии для противодействия молекулярному механизму иммунной устойчивости растений. Наиболее эффективной и действенной контрмерой против RNAi является вирусная супрессия молекулярного иммунного механизма. Например, многие вирусы кодируют специфические белки-супрессоры, которые способны эффективно блокировать RNAi. Экспрессия супрессоров вирусами для противодействия защитной системе растений выдвигает вполне резонное предположение, что изначальной функцией RNAi в растениях было противодействие вирусным патогенам [14].

Целью настоящего обзора является обобщение современных научных данных о молекулярных и биохимических механизмах супрессии RNAi некоторыми вирусами растений.

Potyvirus HC-Pro. Вирусы семейства Potyviridae кодируют супрессор HC-Pro (helper component proteinase), который является классическим примером вирусного мультифункционального белка, ответственного за успешное системное распространение вирусов этого семейства в инфицированном организме. Многочисленными биологическими процессами, в которых функционально участвует белок HC-Pro являются: вирусная репликация, системное и межклеточное движение и белковое расщепление вирусного полибелка [18—20]. Однако наиболее важной биологической функцией HC-Pro является его участие в супрессии RNAi. Первым зафиксированным, но все же косвенным доказательством того, что HC-Pro участвует в супрессии RNAi, было наблюдение, что в трансгенных растениях, экспрессирующих 5'-концевой сегмент генома Tobacco etch virus (TEV) (кодирующий P1/HC-Pro сиквенс), происходило усиление симптомов заболевания при заражении другими вирусами [21]. Последующие независимые исследования показали, что белок является стержневым фактором в супрессии RNAi в инфицированных растениях [15, 22, 23]. Дальнейший мутационный анализ вируса показал, что центральный регион HC-Pro необходим для супрессорной деятельности белка, в то время как его ^-концевая часть не является обязательной для данной функции [24]. Довольно интересным представляется наблюдение, что HC-Pro взаимодействует с белком rgsCaM, который является эндогенным супрессором RNAi в растениях [25].

Позднее появилось предположение, что механизм действия HC-Pro заключается в ингиби-ровании DCL, так как трансгенная экспрессия вирусного белка в растениях связана с аккумулированием длинных необработанных dsRNAs [26, 27]. Было также показано, что экспрессия HC-Pro приводит к дефектам в росте и диффе-ренцировки растений Arabidopsis, предположительно благодаря ингибированию miRNA-ассо-циированного гидролиза РНК транскрипционных факторов [28]. Таким образом, впервые была установлена функциональная связь между молекулярными факторами, вовлеченными в процессы роста и дифференцировки, с одной стороны, и антивирусной RNAi — с другой. Более того, была впервые предложена причина возникновения симптомов заболевания в инфицированных растениях как результат экспрессии вирусного супрессора [29].

Биохимические исследования HC-Pro показали, что его способность формировать димеры и мультимеры является критической для функции в качестве супрессора RNAi [30]. Кроме того, супрессорная функция HC-Pro может быть

также связана с понижением стабильности siRNA, так как трансгенная экспрессия белка приводит к существенно уменьшенной 5'-кон-цевой модификации вирусных 21 нт siRNAs [31]. Более того, было обнаружено, что HC-Pro препятствует функциональному метилированию mi/siRNA [32] и связыванию ds siRNA [33]. Недавние исследования выявили функциональную роль участка FRNK в структуре HC-Pro белка для связывания siRNA и показали, что данная функция взаимосвязана с селективным связыванием miRNAs и степенью амплитуды симптомов вирусного заболевания [34].

Tombusvirus P19. Ранние генетические исследования белка P19, который кодируется геномом вирусов семейства Tombusviridae, показали участие белка в процессах репродукции, движения, упаковки РНК и векторной трансмиссии вируса [35]. Позднее было обнаружено, что P19 является важным патогенным фактором, который необходим для развития симптомов инфекции [36]. Например, P19 вируса кустистой карликовости томатов (Tomato bushy stunt virus (TBSV)) не оказывает существенного влияния на начальные этапы инфекции в растениях Nicotiana benthamiana, но необходим для системного вторжения в другие организмы, такие как перец (Capsicum annum) и шпинат (Spinacia oleracea) [37, 38]. Участие P19 в супрессии RNAi было впервые продемонстрировано на трансгенных растениях, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein (GFP)), инфицированных картофельным вирусом X (Potato virus X (PVX)), который был использован в качестве ве

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

ДОРОХОВ Ю.Л. — 2007 г.

ГРИШАЕВА Т.М., ИВАЩЕНКО Н.И., ЧУБЫКИН В.Л. — 2009 г.

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы —

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы —

Протоонкоген — это нормальный клеточный ген, который может стать онкогеном из-за мутации или гиперэкспрессии. Обычно протоонкогены кодируют белки, участвующие в росте и дифференцировке клетки.

ПЦР-анализ (ПЦР, полимеразная цепная реакция) — метод современной молекулярной биологии

РНКазомиметик — исскуственный низкомолекулярный аналог фермента РНКаза

Рибозим — олигорибонуклеотид, обладающий ферментативной активностью.

АнтагомикроРНК (antagomiRNA) антисмысло-вой олигонуклеотид, антагонист микроРНК, который связывается с регуляторной микроРНК по принципу комплементарности и снимает контролирующее влияние микроРНК на ген-мишень

мРНК — матричная РНК, на которой происходит синтез белков рибосомами

миРНК (microRNA) — микроРНК, малая регулятор-ная антисмысловая РНК, подавляющая трансляцию гомологичной молекулы мРНК

siPHK (small interfering RNA) — малая интерферирующая РНК. Это малая антисмысловая РНК, которая образуется из специфической двуцепочечной РНК, запускающей механизм РНК-интерференции.

РНК-интерференция — процесс, посредством которого двуцепочечная РНК специфически подавляет экспрессию гомологичного гена

Триплексная технология — наиболее современный из антисмысловых подходов, в котором антисмысловой олигонуклеотид связывается с двуцепочечной ДНК не по принципу комплементарности оснований Уот-сона-Крика, а на основе так называемого спаривания Хугстина. Эта технология позволяет регулировать экспрессию гена не на уровне трансляции, как другие антисмысловые технологии, но на уровне транскрипции. Она также позволяет навсегда подавить экспрессию гена или вносить в него мутации.

Представители традиционного подхода настаивали на том, что для подавления экспрессии в культуре клеток эффективность обоих методов сравнима. По их мнению, причиной недооценки эффективности антисмысловых последовательностей является либо использование старых олигонуклеотидов первого поколения (на тот момент уже были известны более совершенные олиго-нуклеотиды третьего поколения), либо неправильный подбор самих последовательностей-мишеней для них.

Что касается использования интерферирующих РНК in vivo, то, по словам представителя калифорнийской биотехнологической компании ISIS Pharmaceuticals, требуется существенная оптимизация этого подхода, чтобы хотя бы встать на один уровень с антисмысловы-ми препаратами. Такая оценка не кажется неожиданной для исследователей из ISIS — единственной фирмы, преуспевшей в выпуске на фармацевтический рынок препарата на основе антисмысловых олигонуклеотидов — Vitravene, — использующегося для лечения кожных заболеваний.

Впрочем, вряд ли с его мнением согласился бы другой представитель фармацевтической индустрии. По мнению вице-президента компании SIRNA Therapeutics, прорыв в

РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ И АНТИСМЫСЛОВОЙ ПОДХОД:

конкуренты или сотоварищи?

Фирмы, разрабатывающие средства доставки, обычно оптимизируют их для обоих типов препаратов, как это делает для своих липидных систем доставки компания Neopharm из Иллинойса. При этом ведущий научный сотрудник компании считает, что в общем и целом препараты интерферирующих РНК работают лучше, чем антисмысловые.

Известно, что причиной ряда заболеваний, в том числе и онкологических, является повышенный клеточный уровень ряда микроРНК, который снижает активность экспрессии ряда клеточных генов. МикроРНК — это клеточные аналоги siPHK, который сама клетка исполь-

зует для регуляции работы своих генов. Снять такую микроРНК-блокаду важных клеточных генов помогут так называемые антагонисты РНК (antagomiRNA) — антисмысловые молекулы, тем или иным способом инактивирующие клеточные микроРНК.

Есть и другие области применения, где антисмысловые РНК могут зарекомендовать себя лучше интерферирующих. Так, крепким орешком для siPHK могут оказаться некоторые вирусы. Существовавшая изначально точка зрения, что механизм РНК-интерференции является своеобразным клеточным иммунитетом от вирусных инфекций, оказалась справедливой только для вирусов растений и ряда низших животных. Несмотря на то, что с начала использования технологии РНК-интерференции появились сообщения об успешном подавлении активности таких вирусов, как ВИЧ (HIV-1), вирусы гепатита В и С, вирус атипичной пневмонии (SARS), гриппа типа А в различных экспериментальных системах, оказалось что многие из вирусов применяют активные и пассивные средства борьбы с siPHK. Многие белки, закодированные в геноме различных вирусов, являются супрессорами, то есть подавляют РНК-интерференцию. Среди них NS1 белок вируса гриппа А, белок оболочки вируса гепатита С, белок Tat вируса иммунодефицита человека, белок VP35 вируса Эбола и др.

Вообще оказалось, что многие РНК-вирусы снабжены неплохой системой защиты. РНК-геном ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса) оказался так плотно упакован внутри вирусной частицы, что просто недоступен для РНК-интерференции. Кстати, вирус иммунодефицита человека относится к роду лентивирусов семейства ретровирусов, и принцип сборки вирусной частицы у него очень близок к классическим ретровирусам.

Существуют противоречивые сообщения о возможности инактивировать геном ВИЧ внутри такой белковой упаковки с помощью siPHK. Если атакующий клетку вирус окажется защищен от интерференции, на идее создания профилактической вакцины от ВИЧ с применением этой технологии придется поставить точку. После того как геном ВИЧ встроится в хромосому атакованной клетки и начнет экспрессироваться, интерферирующим РНК останется только бороться с копиями вирусных

Возрастная дегенерация сетчатки или зрительная катастрофа (Age-related Macular Degeneration (AMD))

Макула (macula lutea, или желтое пятно) — это центральный участок сетчатки диаметром около 5 мм, ответственный за центральное зрение и состоящий из самых высокочувствительных клеток. Здоровая макула обеспечивает человеку приблизительно 80% остроты зрения, и лишь 20% зрения дает нам остальная часть сетчатки.

Дегенерация макулы — одна из главных причин безвозвратного снижения зрения у пожилых людей. Если раньше такой диагноз ставился обычно в возрасте 70—80 лет, то сейчас возрастной порог снизился до 40 до 60 лет. По данным Американской Академии Офтальмологии, в США возрастная дегенерация (AMD) является главной причиной утраты зрения после 50 лет.

При возрастной дегенерации сначала в поле зрения появляются точечные дефекты, затем в процесс вовлекаются более обширные области и, наконец, изображение в центре просто исчезает. Одним из ранних симптомов заболевания является искажение зрения, metamorphopsia — решетка из параллельных линий видится извивистой, местами изображение ее просто исчезает. Простым и эффективным инструментом для выявления этого симптома является Amsler Grid Test — центральная черная точка для фиксации зрения и решетка вокруг нее. Возрастная дегенерация может приводить к полной утрате зрения. Пожалуй, самой большой утратой для тех, у кого зрение частично сохраняется, является невозможность видеть лица — вблизи или совсем. Препарат SiRNA-27 — первое из лекарств серии интерферирующих РНК, допущенный до клинических испытаний. Всего из 8 siPHK препаратов, допущенных до испытаний, три направлены на лечение возрастной дегенерации сетчатки.

На сегодняшний день представляется вполне ясным, что РНК-интерференция не является конкурентом, призванным вытеснить классическую антисмысловую технологию с фармацевтического рынка. У каждого подхода есть свои сторонники и противники, и есть задачи, которые более успешно решаются в рамках той или иной технологии. Есть также и такие задачи, которые можно с большим успехом решить, применяя комбинации препаратов антисмысловых и интерферирующих РНК.

Ответ на другой вопрос: не ждет ли первоначально сверхуспешную РНК-интерференцию судьба классической антисмысловой технологии, на которую два десятка лет назад возлагались огромные, но по сегодняшний день не сбывшиеся надежды, найти сложнее.

Список самых опасных врагов сегодняшней медицины, болезней — массовых убийц, препараты против которых теоретически возможно получить на основе той или иной технологии, очень близок для з1РНК и антисмысловых олигонуклеотидов. Сюда входят и все виды онкологических болезней, и нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона, основные сердечно-сосудистые заболевания (наследственные болезни сердца, гипертония, атеросклероз, миокардит, гипертрофия сердца и инфаркт), и болезни, связанные с нарушением работы иммунной системы (астма, псориаз, аллергические состояния,

воспаления), и многие виды вирусных и невирусных гепатитов, а также ряд других вирусных инфекций.

Как экспериментальная технология нокаута генов РНК-интерференция уже на сегодня состоялась как подход, который стоит считать приоритетным для широчайшего спектра исследований. Она также существенно снижает расходы на тестирование кандидатных лекарственных препаратов в фармакологии. Станут ли siPHK-молекулы основой для нового поколения терапевтических препаратов или повторят судьбу антисмысловых олигонуклеотидов?

Литература к редакционному комментарию Dykxhoom D.M. and Liebennan J. The silent revolution RNA Interference as Basic Biology, Research Tool, and Therapeutic// Annual Review of Medicine, 2005. V. 56(1):401

HaasnootJ., Westerhout E. M., Berkhout B. RNA interference against viruses: strike and counterstiike//Nature Biotechnology 25,1435 - 1443 (2007)

Sassen S., Miska E.A., Caldas C. MicroRNA—implications for cancer// Virchows Arch. 2008January; 452(1): 1—10

Pellish R.S., Nasir A., Ramratnam B. and Moss S.F. RNA interference — potential therapeutic applications for the gastroenterologist//Alimentary Phannacology and Therapeutics 27(9), 715-723, May 2008

Wu W., Sun M., Zou G.-M. andJianjun Chen.//International Journal of Cancer: 120,953-960, 2006

Marquez R. T. and MCcaffrey A. P. Advances in MicroRNAs: Implications for Gene Therapists// Human Gene Therapy. January 1, 2008,19(1): 27-38. doi:10.1089/hum. 2007.147.

Wu L., Belasco J. G.. Let Me Count the Ways: Mechanisms of Gene Regulation by miRNAs and siRNAs // Molecular Cell 29, January 18, 2008:1-7

Kuireck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications//FEBSJournal, Volume 270, Number 8, April 2003, pp. 1628-1644(17)

Clayton J. The silent treatment. // Nature. Vol 431, 599-605, 2004

Liebennan J., Song E., Lee S.K., Shankar P. Interfering with disease: opportunities and roadblocks to harnessing RNA interference // Trends in Molecular Medicine 2003 Sep; 9(9):397—403

Tang Y., Ge Y.-z., Q Yin J. Exploring in vitro roles of si RNA in cardiovascular disease // Acta Phannacologica Sinica, Volume 28, Number 1, January 2007, pp. 1-9(9)

DeFougerolles A. R. Delivery Vehicles for Small Interfering RNA In Vivo //Human Gene Therapy 19:125—132, February 2008 Li C.X., Parker A., Menocal E., Xiang S., Borodyansky L. and FruehaufJ.H. Delivery of RNA interference. Cell Cycle 5(18): 2103-2109, 2006 September 15

Love T.M., MoffettH.F.,Novina C.D..NotmiR-lysmallRNAs: big potential for microRNAs in therapy // Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2008 Feb ;121 (2):309-19 18269923 (P,S,E,B,D)

Aboul-Fadl T. Antisense Oligonucleotides: The State of the Art // Cuirent Medicinal Chemistry, Volume 12, Number 19, September 2005, pp. 2193-2214(22)

Пост-транскрипционный сайленсинг в защитном ответе растений на патогены: новые клеточные и вирусные белки-модуляторы функций малых РНК НИР

Руководитель НИР: Соловьев А.Г.
Участники НИР: Атабекова А.К., Бакшеева В.Е., Горюнов Д.В., Зерний Е.Ю., Лазарева Е.А., Лезжов А.А., Логачёва М.Д., Макаров В.В., Морозов С.Ю., Панкратенко А.В., Серебрякова М.В.
Подразделение: Отдел биохимии вирусов растений
Срок исполнения: 8 июля 2014 г. - 31 декабря 2016 г.
Номер договора (контракта, соглашения): 14-14-00053
Номер ЦИТИС: 01201464075
Тип: Фундаментальная
Приоритетное направление научных исследований: другое
Рубрики ГРНТИ:
- 34.15.31 Молекулярная биология вирусов
- 34.15.17 Макромолекулярные ассоциации и проблемы узнавания в молекулярной биологии
- 34.25.29 Биология вирусов человека, животных, растений и бактерий
Ключевые слова: вирусы растений, малые рнк, вирусные супрессоры сайленсинга, сайленсинг генов, транспорт макромолекул, патогенез растений, рнк-интерференция, защитные механизмы растений

Описание:

Механизмы РНК-интерференции (РНК-сайленсинга), реализуемые через биогенез и функционирование малых РНК, являются важнейшей частью комплексной системы иммунного ответа растений. Данный проект направлен на исследование механизмов РНК-интерференции при ответе растения на инфекцию. В настоящее время достаточно полно исследованы пути биогенеза различных типов малых РНК растений, а также основные белковые компоненты эффекторных комплексов, в составе которых происходит функционирование малых РНК. Вместе с тем, способы регуляции РНК-интерференции, в частности в контексте взаимодействий патогенов и растений-хозяев, пока исследованы недостаточно. Для того, чтобы изучить пути такой регуляции, в данном проекте мы ставим задачу охарактеризовать связанные с патогенезом молекулярные механизмы модулирования функций малых РНК с участием клеточных и вирусных белков. В рамках этой задачи будет исследована как активация и супрессия РНК-сайленсинга, так и регуляция на организменном уровне, основанная на транспорте малых РНК по растению. Исследования, предложенные в проекте, важны с точки зрения понимания общих механизмов молекулярных взаимодействий растений с патогенами различной природы.

#	Сроки	Название
1	8 июля 2014 г.-31 декабря 2014 г.	Пост-транскрипционный сайленсинг в защитном ответе растений на патогены: новые клеточные и вирусные белки-модуляторы функций малых РНК
Результаты этапа: Исследования клеточных и вирусных белков-модуляторов функций малых РНК велись в нескольких направлениях. Проведен скрининг библиотеки растительной кДНК в дрожжевой двугибридной системе; выявлены клеточные белки, способные взаимодействовать с белком Nt-4/1. Получены трансгенные растения с пониженным уровнем экспрессии белка Nt-4/1. Отработаны методы иммунопреципитации белков Nt-4/1 и р42 из растительных экстрактов. Исследована способность вирусных белков ТБГ1 и ЦББ супрессировать РНК-сайленсинг в трансгенных растениях. Клонированы гены ТБГ1 вирусов HGSV и SSMAV. С использованием рекомбинантного вирусного генома показано, что клеточный белок Nt-4/1 оказывает существенное влияние на системный транспорт вирусной инфекции в растении. С помощью секвенирования нового поколения показано, что экспрессия Nt-4/1 в составе вирусного генома значительным образом меняет профиль накопления вирус-специфических малых РНК в растении.
2	1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г.	Пост-транскрипционный сайленсинг в защитном ответе растений на патогены: новые клеточные и вирусные белки-модуляторы функций малых РНК
Результаты этапа: Поведен анализ взаимодействий in vitro белка Nt-4/1 и его белка-партнера, идентифицированного ранее в дрожжевой двугибридной системе, с использованием плазмонного резонанса. С помощью флуоресцентной микроскопии показано, что ко-экспрессия данных белков в клетках растений ведет к изменению внутриклеточной локализации Nt-4/1. Показано, что в трансгенных растениях N.tabacum с пониженным уровнем экспрессии Nt-4/1 подавлено проникновение вируса погремковости табака в апикальную меристему стебля. Проведено выделение комплексов, содержащих белки Nt-4/1 и р42, из клеток растений, их белковые компоненты идентифицированы с помощью масс-спектрометрии. Показано, что РНК-связывающая активность белка Nt-4/1 вносит вклад в его влияние на системный вирусный транспорт, однако не является единственной детерминантой этого влияния. С использованием секвенирования транскриптомов методами нового поколения проведено исследование влияния белка Nt-4/1 на экспрессию клеточных генов. В экспериментальной системе, основанной на комплементации межклеточного транспорта вируса морщинистости турнепса не выявлена способность ЦББ и ТБГ1 супрессировать РНК-сайленсинг. Проведено исследование эволюции структуры генов 4/1 у низших растений. Показано, что хеликазный домен, родственный репликативным хеликазам вирусов растений, обнаруживается в составе белка, кодируемого рядом ретротранспозонов насекомых, и, подобно соответствующим доменам белков фитовирусов, обладает способностью супрессировать РНК-сайленсинг.
3	1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г.	Пост-транскрипционный сайленсинг в защитном ответе растений на патогены: новые клеточные и вирусные белки-модуляторы функций малых РНК
Результаты этапа: Проведено изучение белок-белковых взаимодействий с участием Nt-4/1 in vivo. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показано, что в растительных клетках слитный белок NtPBL-mRFP локализован в полигональной сети эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и малых ЭПР-ассоциированных тельцах, не являющихся структурами аппарата Гольджи. В экспериментах по ко-экспрессии NtPBL-mRFP и Nt-4/1-GFP показано, что Nt-4/1-GFP-содержащие цитоплазматические тельца ко-локализуются с ЭПР-ассоциированными тельцами, содержащими NtPBL-mRFP, что согласуется с данными о взаимодействии белков NtPBL и Nt-4/1, полученными другими методами. Проведен анализ взаимодействия Nt-4/1 с белком Nb-CPL3 методом ко-экспрессии в клетках растений. Показано, что CPL3С-mRFP, представляющий собой слитый с mRFP N-концевой район белка Nb-CPL3, локализуется диффузно в цитоплазме и нуклеоплазме. При ко-экспрессии CPL3С-mRFP и Nt-4/1-GFP обнаружено, что CPL3С-mRFP локализуется таким же образом, как и в отсутствие Nt-4/1-GFP. При этом Nt-4/1-GFP, который в отсутствие CPL3С-mRFP локализуется в цитоплазматических тельцах, в случае ко-экспрессии локализовался в цитоплазме диффузно. Таким образом, показано, что фрагмент белка Nb-CPL3 радикально меняет внутриклеточную локализацию белка Nt-4/1-GFP, что является указанием на взаимодействие CPL3 и Nt-4/1 in vivo. Исследовано функциональное взаимодействие белка Nt-4/1 и белка р25, супрессора сайленсинга, кодируемого Х-вирусом картофеля, который вызывает протеасомную деградацию белка AGO1. Поскольку AGO1 контролирует уровень мРНК белка AGO2, содержащей мишень miR403, которая функционирует в комплексе с AGO1, было оценено влияние Nt-4/1 на способность р25 воздействовать на уровень мРНК AGO2. В опытах по агроинфильтрации с помощью ПЦР в реальном времени обнаружено, что в отсутствие белка р25 Nt-4/1 не влияет на уровень мРНК AGO2. Статистически достоверно показано значительное снижение количества мРНК AGO2 в присутствии белков 25K и Nt-4/1 в сравнении с экспрессией одного белка 25K. Было обнаружено, что при этом уровень мРНК AGO1 в присутствии белков Nt-4/1 и р25 составлял 76% от уровня этой мРНК в присутствии только белка р25. Таким образом, причиной действия Nt-4/1 на уровень экспрессии AGO2 в присутствии р25 является не повышение уровня мРНК AGO1. Полученные данные указывают на то, что эффект Nt-4/1 реализуется на уровне белок-белковых взаимодействий, и что белок Nt-4/1 подавляет протеасомную деградацию белка AGO1, вызванную вирусным белком-супрессором сайленсинга р25. Проанализированы РНК-связывающие свойства белка NtPBL. Методом сдвига в агарозном геле показано, что NtPBL-С, который представляет собой С-концевую гидрофильную область белка NtPBL, связывает РНК GFP и вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК), демонстрируя более эффективное связывание РНК ВВКК с выраженной вторичной структурой. В экспериментах по связыванию NtPBL-С с другими РНК-субстратами со стабильной вторичной структурой показано, что NtPBL-C эффективно связывает тРНК и с еще большей аффинностью взаимодействует с предшественниками микро-РНК miR171 и miR390. Проведен мутагенез NtPBL-C и анализ РНК-связывающих свойств полученных мутантов. Обнаружено, что мутация, внесенная в С-концевой участок белка, полностью блокировала его способность связывать предшественник miR171, но не приводила к утрате способности образовать комплексы с ВВКК. Таким образом, показано, что C-концевая область белка NtPBL участвует в высокоспецифичном связывании предшественников микро-РНК. Исследовано влияние экспрессии гидрофильной области NtPBL (NtPBL-C) в растениях на фенотип вирусной инфекции. Показано, что экспрессия NtPBL-C в растениях N. benthamiana с помощью вектора на основе вируса погремковости табака (ВПТ) приводит к существенному изменению фенотипа виусной инфекции. В контрольных растениях, инокулированных ВПТ, на 15-й день после инфильтрации наблюдалась мягкая мозаика и умеренная задержка роста в сравнении с незараженными растениями. В случае растений, инфильтрированных ВПТ-NtPBL-C, наблюдалась сильная задержка роста (карликовость) и существенные нарушения нормальной морфологии верхних листьев растений. Эти фенотипические эффекты экспрессии NtPBL-C в контексте генома ВПТ сходны с аномалиями развития, наблюдаемыми при нарушении биогенеза и/или функций микро-РНК.

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, . ). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

Справочник

Обзоров: 126
Биографии: 12
Записей в дневниках: 13
Новостей: 16

Интерференция РНК

Интерференция РНК – феномен, ведущий к посттранскрипционному молчанию генов (PTGS 2 ).
Явление RNA interference (RNAi 3 ) обнаружено Fire et al. в 1998 году у нематоды C.elegans. Было обнаружено, что введение двухцепочечной РНК (dsRNA 1 ) в нематоду приводит к замолканию генов гомологичных введеной
dsRNA 1 и образование малых РНК (siRNAs 4 ). Позже выяснилось, что этот феномен широко распространен среди большинства организмов, включая простейших, животных и растений. Интерференция РНК заключается в разрезании dsRNA 1 на короткие,

20 нуклеотидов, фрагменты, которые выполняют роль матрицы для узнавания комлементарных РНК и разрезания их на фрагменты.

Механизм
Механизм RNAi 3 заключается в расщеплении двухцепочечной РНК на 21-23 пн фрагменты, которые действуют как матрица для разрушения гомологичных последовательностей РНК. Причем было установлено, что длинные dsDNA более активны чем короткие.
Попавшая в клетку dsRNA 1 узнается белком Dicer, осуществляющим разрезание длинных
двухцепочечных РНК на короткие фрагменты. Далее такие дуплексы РНК с 2-3 нуклеотидными липкими концами, полученные Dicer связываются с белковым комплексом RISC (RNA-induced silencing complex), осуществляющим разрезание комплементарных одноцепочечных РНК в месте узнавания, что исключает трансляцию этих РНК. РНК разрезается в середине места узнавания, примерно 12 пн от 3'конца siRNA 4 . Эта позиция соответствует одному обороту двуцепочечного дуплекса РНК разрезающей и РНК которая разрежется. Вирусный белок Hc-Pro ингибирует действие комплеков RNAi 3 . (рис1.).
Dicer - АТФ-азная рибонуклеаза - инициатор сайленсинга, разрезает исходную dsRNA 1 , для матрицы. Имеется геликазный домен, С-концевой сегмент связывания с РНК и РНКазныйIII. Мышиный Dicer М=215 кДа и длиной 1373 аминокислоты расположен на конце 12 хромосомы и экспрессируется в различные фазы развития от эмбриональной
до взрослого состояния. Человеческий Dicer имеет массу 218 кДа.
RISC - мультибелковый комплекс

500кДа, состоящий из нуклеиновых кислот и белков. Одна из субъединиц - Argonaute-2.
Длина некоторых интронов после процесcинга составляет

20 нуклеотидов, что может указывать на участие их в механизме RNAi 3 .

20 пн. siRNAs 4 4 . Фрагменты связываются с белковым комплексом RISC, который узнает и разрезает мРНК. Оставшийся одноцепочечный фрагмент может связываться с мРНК и служить затравкой для РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), которая достраивает мРНК до двухцепочечного
состояния, которое вновь узнается белком Dicer. И так происходит до тех пор, пока вся чужеродная мРНК не уничтожится. (Bantounas at al., 2004) Функции в клетке.
Защита от вирусов.
Интерференция РНК служит для защиты от проникновения в клетку молекулярных паразитов, таких как геномная РНК некоторых вирусов, состоящая из двух антипараллельных молекул. При запуске механизма RNAi 3 такие дуплексы служат матрицей для последующего разрушения молекул РНК, с которых будут синтезированы вирусные белки. Однако вирусы не стояли на месте и приобрели способность противостоять клеточной защите. Вирусный белок Hc-Pro ингибирует работу белковых комплексов вовлеченных в механизм RNAi 3 .
Контроль активности транспозонов.

Так же RNAi 3 служит для контролирования активности мобильных элементов. Мобильный элемент, или транспозон, это участок внутри ДНК какого-либо организма способный к копированию самого себя и встраиванию в любую часть генома. Если бы все транспозоны в клетке находились в активном состоянии они начали бы беспорядочно встраиваться в некодирующие участки генома, что может быть не так страшно, и в кодирующие участки, что неминуемо привело бы к нарушению работы генов и гибели организма. Предполагается, что механизм RNAi 3 препятствует активации транспозонов и расселению их по геному. Таким образом, взаимодействие RNAi 3 и транспозонной активности участвует в формировании структуры геномов большинства организмов. Считается, что транспозоны могут быть предками ретровирусов встроившихся когда-то в геном и существующими как внутренние паразиты. Из вышесказанного следует, что RNAi 3 служит защитой
как с внешней стороны - вирусы, так и с внутренней - транспозоны.
Метилирование ДНК
RNAi 3 -зависимое метилирование ДНК - известный феномен у растений. Ранние наблюдения специфического метилирования ДНК, зависящего от репликации РНК, у растений описаны Wessenegger et al. (1994). Эта работа демонстрирует, что метилируются короткие районы

30 пн, когда присутствует гомологичная РНК. При действии вирусного белка Hc-Pro, ингибирующего RNAi 3 , метилирование районов уменьшается. При метилировании ДНК, способность присоединять гистон ацетилазу уменьшается, что мешает разрыхлению хроматина и, соответственно, транскрипции генов. Модификации ДНК, полученные таким образом, могут наследоваться и передаваться дочерним клеткам, что может явиться механизмом клеточной памяти и регуляции развития организма.

Использование
в исследованиях.
Интерференция РНК используется исследователями для анализа функций различных генов. Если необходимо исключить из клетки какой-либо белок или несколько белков, исследователь может инъецировать двуцепочечные фрагменты РНК, комплепментарные участку мРНК, и механизм RNAi 3 удалит мРНК и предотвратит их трансляцию. Это можно проделывать на различных этапах клеточного цикла. Такой подход называется генным нокдауном. Например, таким способом было систематически инактивировано 5690 генов C.elegans для определения генов, регулирующих продолжительность жизни. В результате эксперимента был обнаружен ген митохондриальной лейцил-тРНК-синтетазы и показано, что мутации этого гена остлабляют работу митохондрий и увеличивают продолжительность жизи. Было предположено, что это результат уменьшения уровня АТФ и потребления кислорода. Введение конструкций, экспрессирующих РНК, содержащую инвертированные повторы. Такой механизм, вероятно, может происходить и в
естественных условиях.

Лечение заболеваний.
Существует два основных нарушения при развитии рака. Первое, это нарушение клеточного цикла, результатом которого является ненормальный рост клеток, и второе это потеря чувствительности к белкам вызывающим апоптоз, или клеточную смерть.
RNAi 3 может быть использована для лечения рака. Для этого можно создать нокдаун генов ответственных за клеточный цикл и противоапоптозных генов в клетках опухоли. Для избирательного действия на раковые клетки можно использовать RNAi 3 , вводя уникальные последовательности dsRNA 1 , специфичные для какого-нибудь определенного гена, или вводя их непосредственно в опухоль.
Недавние исследования ясно показали продвинутость метода RNAi 3 в подавлении роста и разрушении раковых клеток. Предпринимаются успешные попытки
введения вирусных векторов в раковые клетки, что так же способствует подавлению их роста. Однако все эти методы лечения находятся пока на предклинических испытаниях.
Болезни, вызванные вирусами и бактериями, продолжают являться основной причиной смертности людей в мире и продолжают вызывать беспокойство возможностью появления новых форм опасных заболеваний и использование их террористами. В настоящее время ВИЧ достиг эпидемических показателей в африканских странах и продолжает являться важной причиной смертности среди гомосексуалистов и наркоманов.
Способность RNAi ингибировать репликацию вирусов и других инфицирующих агентов была продемонстрирована на клеточных культурах и подает надежды на лечение этих заболеваний.

Читайте также: