Вирус восточного энцефаломиелита лошадей

ИНФЕКЦИОННЫЙ ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТ ЛОШАДЕЙ (Encephalomyelitis infectiosa equorum), острая вирусная болезнь, характеризующаяся воспалением головного и спинного мозга, расстройством деятельности ц. н. с., парезом жел.-киш. тракта и мочевого пузыря, желтухой.

Этиология. Возбудитель И. э. л.— неклассифицированный вирус размером 80 —130 нм, круглой, овальной, реже палочкообразной формы. Вирус культивируется на 7—9-суточных куриных эмбрионах, в культурах растущих тканей эмбрионов и почках свиней. Устойчивость возбудителя к рН находится в пределах 4,5—8,5. Высушенный вирус сохраняет жизнеспособность в вакууме при t 2—4°C и течение 4—12 лет, в 30%-ном глицерине при t 14—18°C— до 3—6 мес. Солнечные лучи инактиинруют вирус через 4—8 ч. При t — 10°С вирус сохраняется до 3 мес. Вирус ниактипируется при t 65°С — через 10 мин, при кипячении — через неск. секунд. Р-ры дезинфицирующих средств в обычных концентрациях обезвреживают вирус через 10 мин.

Энизоотология. В естеств. условиях болеют, как правило, лошади в возрасте от 2 до 12 лет. Чаще заболевают лошади при пастбищном содержании. Болезнь встречается в виде небольших вспышек или спорадич. случаев. Источник возбудителя инфекции — больные лошади. Переносчиками болезни могут быть нек-рые виды комаров и клещей. Первые случаи болезни, в зависимости от концентрации насекомых-гематофагов в природе, регистрируются поздней

С наступлением осенних заморозков заболевание обычно затухает.В одном и том же неблагополучном пункте И. э. л. наблюдают обычно в течение неск. лет подряд, что обусловлено наличием резервуара возбудителя в природе. Переболевшие лошади приобретают стойкий иммунитет.

Течение и симптомы. Инкубационный период от 15 до 40 сут. Течение острое. Болезнь проявляется в осн. в буйной и тихой формах, реже встречается бессимптомная (латентная) форма. Продромальная стадия болезни продолжается от неск. часов до 3—5 сут. характеризуется кратковременным подъёмом [подъемом] темп-ры тела, угнетением, утомляемостью, снижением аппетита, зевотой, понижением кожной чувствительности, слабой желтушностью. При буйной форме лошади срываются с привязи, безудержно стремятся вперёд [вперед] , реже назад, натыкаются на препятствия, наносят себе раны и ушибы (рис. 1). Часто больные лошади принимают неестеств. позы — упираются головой в землю, падают набок, совершая плавательные движения, голову запрокидывают назад. Нервные явления усиливаются, появляются судорожные сокращения отдельных групп мышц, манежные движения. Рефлексы вначале ослаблены, позднее полностью отсутствуют. Наблюдаются потеря зрения, задержка мочеотделения. Пульс учащён [учащен] , дыхание поверхностное, темп-ра тела нормальная или неск. понижена. Приступы буйства иногда сменяются периодами угнетения. Длительность болезни—от 1,5 до 15 сут. Характерные изменения крови: увеличение кол-ва лейкоцитов (до 13—16 тыс. и более), билирубина (от 10 до 90 ед.) и эритроцитов, замедление СОЭ. Смертельность колеблется от 40 до 90%. Более 80% заболевших лошадей погибают в течение 24—48 ч. Тихая форма болезни, сопровождающаяся прогрессирующим угнетением, при своевременном лечении часто заканчивается выздоровлением.

Патологоанатомические изменения. Трупное окоченение выражено слабо и проходит сравнительно быстро. Обнаруживают истощение, желтуху шафранно-желтый цвет слизистых и серозных оболочек, подкожной клетчатки, фасций, апоневрозов, скелетных мышц. Серозные и серозпо-геморрагич. инфильтраты встречаются в подкожной клетчатке головы, брюшной стенки, конечностей. Лимфатич. узлы увеличены, набухшие, на разрезе влажные, пятнисто-покрасневшие. Оболочки головного и спинного мозга отёчны [отечны] , сосуды переполнены кровью, мозговое вещество размягчено. Гистол. изменения обнаруживают в печени: печёночные [печеночные] клетки загружены жировыми каплями, мн. из них с пикнотичными или лизированными ядрами; обильное отложение гемофусцина. В селезёнке [селезенке] — уменьшенное кол-во гемосидерина. В головном мозге встречаются групповые скопления преим. гистиоцитов, лимфоидных клеток, полинуклеаров; часто наблюдают мелкие кольцевые геморрагии.

Диагноз основывается на эпизоотол. исследовании, симптомах болезни, результатах гематологич. и вирусологич. исследований, патологоанатомич. и гистол. данных. И. э. л. дифференцируют от бешенства, болезни Ауески, ботулизма, пироплазмидрзов, кормовых отравлений, а также борнаской болезни, япон. и амер. энцефаломиелитов лошадей. При борнаской болезни у погибших лошадей обнаруживают ацидофильные внутриядерные тельца Иоста—Дегена в нервных клетках аммонова рога (рис. 2).

Лечение. Специфич. терапия не разработана. Больных лошадей ставят в просторном, затемнённом [затемненном] помещении с обильной подстилкой. У них очищают прямую кишку, проводят катетеризацию мочевого пузыря. Через носо-лищевой зонд дают 2 раза в сутки натрия сульфат (100—150,0 г), подкожно вводят камфорное масло по 20 мл через каждые 4—6 ч, внутривенно — растворённые [растворенные] в 400 мл физиол. р-ра уротропин (25,0 г), глюкозу (40,0 г), хлорид кальция (20,0 г). Применяют также кислород (10—12 л) под кожу, внутривенно вводят 200 мл 10%-ного гипертонич. р-ра хлорида натрия. При необходимости инъекции повторяют через 2—3 сут.

Профилактика и меры борьбы. Профилактич. мероприятия направлены на повышение устойчивости организма путём [путем] полноценного кормления, содержания в хороших условиях и правильного использования лошадей. Животных обрабатывают инсектицидами, переводят их на стойловое содержание, осушают заболоченные участки, расчищают кустарник. При возникновении И. э. л. неблагополучный пункт карантинируют. Больных и подозрительных по заболеванию лошадей изолируют и лечат. Карантин снимается по истечении 40 сут после последнего случая выздоровления или падежа больных и после проведения заключительной дезинфекции всех помещений и предметов, с к-рыми соприкасались больные лошади.

Лит.: Коляков Я. Е., Инфекционный энцефаломиелит, в кн.: Вирусные болезни лошадей, М., 1973, с. 5 — 40; Нымм Э. М., Инфекционные знцефаломиелиты, в кн.: Инфекционные и инвазионные болезни лошадей, М., 1976. с. 3-28.

Инфекционный энцефаломиелит был известен в США еще в прошлом веке и регистрировался под разными названиями — цереброспинальный менингит, кормовое отравление, канзасская чума лошадей, ботулизм и др. Некоторое время эту болезнь рассматривали как болезнь Борна.

Окончательно как вирусную инфекцию эту болезнь расшифровали благодаря открытию ее возбудителя — вируса в 1931 г. (К. F. Meyer, С. М. Haring, Howitt). Особенно широко ИЭМ лошадей распространился в 30—40-е годы. По данным Shahan и Giltner (1945), с 1930 по 1944 г. заболело около миллиона лошадей, из них погибло около 300 тыс. Отмечена выраженная цикличность в эпизоотическом течении американского инфекционного энцефаломиелита.

При дальнейшем изучении этиологии и особенностей течения болезни в разных зонах США была установлена циркуляция разных вариантов вируса восточного, более вирулентного, вызывающего тяжелое течение болезни и очень высокую смертность у животных и человека, и западного, несколько менее вирулентного вируса (Ховитт, 1937). В 1938 г. обнаружен венесуэльский вариант вируса, который был открыт и дифференцирован Бэком и Быковым (С. Е. Beck и R. W. Wyckoff). Таким образом, клинически однотипно протекающий ИЭМ в США вызывается по меньшей мере тремя разными вирусами, которые довольно точно дифференцированы иммунологическими методами: серологически по РСК, в опытах перекрестной нейтрализации гомологичными иммунными воротками, в опытах перекрестной иммунизации. Ранее ли варианты обозначали как разные типы, позже их по предложению I. Casals (1952) описывают как самостоятельные виды.

В период 1937—1942 гг. вначале серологическими методами (обнаружение соответствующих антител), а далее экспериментально было установлено заболевание лошадей, вызванное вирусом Сан-Луи, ранее считавшимся только вирусом энцефалита человека — трансмиссивной нейроинфекции, передающейся комарами. Западный ПЭМ лошадей (WEE) регистрировали в основном в западных штатах (преимущественно к западу от реки Миссури), а также в Аргентине и Канаде. Восточный ИЭМ (ЕЕЕ) отмечался на востоке страны, а также в Мексике, Панаме, Бразилии и на Кубе. В Республике Куба была отмечена вспышка ИЭМ лошадей в 1969 г. Выделен вирус, сходный с возбудителем восточного американского ИЭМ (В. А. Василенко, Армандо Фердинандес Мартинез, Мария Херрера Альварес и др., 1971).

В некоторых штатах США (Иллинойс и др.), а также в Венесуэле, Колумбии, Эквадоре у больных лошадей был выявлен венесуэльский вирус ИЭМ. В 1972 г. появились новые очаги венесуэльского энцефалита (VEE) в Эквадоре, Гватемале, Никарагуа, Гондурасе. Вирус был выделен в Эквадоре у 10 человек и 4 лошадей. В названной зоне проводится вакцинация лошадей против VEE (данные МЭБ, 1972 г.)

К эпизоотологическим особенностям американского ИЭМ относятся: выраженная сезонность (июнь — сентябрь в западных штатах, август — октябрь на востоке, возможны отдельные случаи в зимнее время); периодичность вспышек, порой весьма значительных, через неопределенное количество лет; отсутствие или незначительная заболеваемость в пунктах, где наблюдалась эпизоотия в предшествовавшие ближайшие годы; концентрация случаев заболевания в отдельных хозяйствах небольшая, нередко заболевают лишь отдельные лошади; наличие биологического резервуара вируса — многие виды дикой птицы, голуби, фазаны, некоторые грызуны и членистоногие (комары и клещи). Следует отметить, что заболевали лошади только в сельской местности. Пол, возраст, порода, видимо, не влияют на заболеваемость. Болеют лошади, пони, мулы. Имеются сообщения, что последние более устойчивы к естественной инфекции.

Величина частиц вирусов западного и восточного ИЭМ, установленная в электронном микроокопе, раина 39,6—58,8 ммк. Вирус округлой формы, проходит через фильтры Беркефельда N, V и W, Зейтца, Мандлера и коллодийные фильтры с порами диаметром 66 ммк.

Вирусы западного, восточного, венесуэльского энцефаломиелитов можно культивировать на 10—11-дневных куриных эмбрионах при заражении их в хориоаллантоис, аллантоис и амниотическую полости и в тело эмбриона. Эмбрионы гибнут обычно через 15—24 часа. Хорошей лабораторной моделью служат мыши-сосунки, однодневные цыплята. Этими тестами пользуются при выделении вируса из мозга павшей или убитой лошади. Мышам и цыплятам вирус вводят интрацеребрально. Западный вирус вызывает заболевание мышей обычно через четыре дня, восточный — через 40 часов. К обоим вирусам восприимчивы морские свинки, белые мыши, крысы, кролики, хомяки, голуби, белки, обезьяны, собаки и др. К восточному вирусу, помимо названных животных, восприимчивы также овцы, кошки, ежи и перепелки.

Следует отметить, что к вирусам ИЭМ особо чувствительны морские свинки, которые заболевают после интрацеребрального заражения через 1—3 дня. Вирус у них можно в определенный период (лихорадка) обнаружить в крови. Вирус венесуэльского энцефаломиелита также патогенен для большинства названных животных. К вирусам американского ИЭМ восприимчивы многочисленные виды млекопитающих и птиц, которые наряду с комарами (Aedes aegypti, Aedes triseriatus et al.) с клещами (Dermacentor andersoni, Dermanyssus gallinae et al.) составляют резервуар вирусов ИЭМ в природе. В частности, установлено носительство вируса восточного энцефаломиелита в Мериланде английскими воробьями и кудахтающими куропатками (R. I. Byrne, 1961). Западный вирус был выделен у голубей из секрета зоба.

По сообщению Кислинга и др., установлена возможность парентерального заражения вируссодержащим материалом, а также подсадкой зараженных комаров Aedes aegypti et al. на птиц следующих видов: виргинских кардиналов, кедровых свиристелей, красноплечих дроздов и домашних воробьев. Обнаружен вирус у свободноживущих фазанов. У диких птиц исследователи иногда обнаруживали высокий уровень в крови нейтрализующих антител и антигемагглютининов. В связи с широким распространением в природе вирусов ИЭМ возникло предположение, что в эпизоотической цепи этой вирусной инфекции лошади являются лишь случайным (по Ленину) включением в широкий ареал эпизоотического процесса животных многих видов, прежде всего диких птиц.

Как было указано выше, при выделении и идентификации вирусов ИЭМ заражают 10—11-дневные куриные эмбрионы. В них за одни сутки накапливается вирус до уровня вирулентности 10 -6 (особенно при пассажах). Вирусы американского ИЭМ успешно выращивали также в культуре ткани куриного эмбриона, в суспензии ткани мозга эмбриона мыши, в ткани эмбриона живородящей рыбы гамбузии и других клеточных культур (Р. К. Olitsky, R. Сох).

В литературе имеется большой материал по экспериментальному заражению лошадей вирусами американского ИЭМ. Еще в 30-х годах Мейер, Херст, Шеген и Джильтнер и др., вводя лошадям вируссодержащий материал (мозговая суспензия больных лошадей и инфицированных морских свинок, в отдельных случаях их кровью) различными методами, вызвали их заболевание. Интрацеребральное заражение во всех случаях (за редким исключением) вызывало заболевание лошадей с симптомами, соответствующими естественному течению болезни. Особый интерес представляют дальнейшие исследования Кислинга и др. (R. Е. Kissling, 1954) по воспроизводству болезни подсаживанием для кормления зараженных вирусом комаров. Из шести лошадей заболело три, проявившие признаки нарушения функции центральной нервной системы, причем у всех животных были обнаружены вируснейтрализующие антитела. Важно указать, что во многих опытах экспериментального заражения у подопытных лошадей обнаруживали вирус в крови через 24—48 часов после заражения.

Теория о передаче вирусов ИЭМ комарами возникла в 1933 г., когда Кельсеру (R. A. Kelser) впервые удалось при помощи искусственно инфицированных комаров Аеdes aegypti перенести вирус западного типа от морской свинки па морскую свинку, от последней на лошадь и с лошади опять па лошадь. Прошло около 40 лет. За это время американские исследователи провели много опытов для уточнения важных моментов в вопросах о роли гематофагов в переносе вирусных энцефалитов. Установлены основные резервести и переносчики каждого вируса (комары Aedes sollicitans, A. nigromaculis, A. dorsalis et al.), определены сроки и титры накопления вирусов в организме комаров, особенности виремии у лошадей, инфицированных птиц и лабораторных животных. Однако все еще нет ответа на ряд таких противоречивых фактов, как, например, отсутствие заболеваемости среди лошадей при обнаружении вирусов у комаров в данной зоне, циркуляция у комаров вируса, гетерологичного вирусу, выделенному в данный момент от больных животных, появление отдельных вспышек ИЭМ зимой. Начиная с 1941 г. Сивертон и др., Ховитт и др., Ривс и др. установили носительство и возможность переноса вирусов ИЭМ различных видов клещами Dermacentor Andersoni, Dermanyssus gallinae et al.

Большинство авторов полагают, что основными поставщиками вирусов для гематофагов являются не столько лошади, сколько дикие птицы и, возможно, куры, фазаны, голуби, воробьи. Следует считать, что резервуаром инфекта могут служить некоторые дикие млекопитающие, в частности суслики, у которых удалось обнаружить возбудителя ИЭМ западного типа.

Несмотря на утвердившееся мнение, что вирусы ИЭМ передаются гематофагами, в литературе встречаются высказывания о контактной передаче болезни (заражение интраназальное и через рот).

Инкубационный период у лошадей при экспериментальном интрацеребральном заражении продолжается 3—8 дней, при заражении в естественных условиях — примерно 1—3 недели. У заболевших лошадей повышается температура тела до 41°. Через 18—36 часов лихорадка исчезает. В конечном периоде болезни температура часто субфебрильна. Клиническая картина, особенно по нервной симптоматике, мало отличается от наблюдающейся при ИЭМ, протекающем в СССР (см. ниже). Как отличие следует отметить отсутствие при американских формах ИЭМ желтушности, или слабую ее выраженность у большинства больных. Болезнь, как правило, протекает остро от 3 до 8 дней. Смертельность в среднем достигает 50%, при заболевании энцефаломиелитом восточного типа значительно выше, чем при заболевании западным.

Важным моментом в диагностике американского ПЭМ является иммунодиагностика, направленная не только на подтверждение вирусной этиологии изучаемого случая болезни, но также для дифференцирования типа действующего вируса. К методам этой диагностики относятся: реакция нейтрализации, реакция задержки (подавления или ингибиции) гемагглютинации, реакция связывания комплемента. При изучении западного ИЭМ Доби и др. (R. В. Doby et al., 1966) пришли к заключению о высоком диагностическом значении реакции ингибиции гемагглютинации. Так, уже в первые 4 дня с начала болезни при помощи этой реакции удалось подтвердить правильность диагноза на вирусный энцефалит в 96,4%, а при помощи РСК — лишь в 71,4% случаев. На фоне циркулировавшего в штате вируса западного энцефаломиелита авторы серологически установили у трех лошадей инфекцию, вызванную вирусом Сан-Луи. Из указанного видно, что серодиагностика ИЭМ заслуженно приобретает важное практическое значение.

Патологоанатомические изменения при американском ИЭМ не характерны. Отмечают сочность лимфатических узлов, желтушность, слабые дегенеративные и воспалительные изменения, а иногда появление интрануклеарных включений, напоминающих в некоторой степени тельца Иеста в ганглиозных клетках мозга.

Важнейшим разделом учения об американском ИЭМ является иммунология. Ее основой является установленное в 30-х годах антигенное различие циркулирующих па американском континенте вирусов ИЭМ различных видов. Это обстоятельство имеет весьма важное значение в эпидемиологическом и эпизоотологическом аспектах, а также для создания специфических диагностических препаратов, иммунсывороток и вакцин, гомологичных действующему в данной зоне вирусу.

Идентификацию вируса при помощи видоспецифических диагностических сывороток и соответствующих антигенов проводят реакцией нейтрализации (на мышах либо на культуре клеток куриных фибробластов), методом торможения (ингибиции) гемагглютинации (HI) и РСК. Гипериммунизацией лошадей получали лечебную сыворотку (Меир, Рекорде и др.). Она эффективна в ранней стадии болезни, ее вводят внутривенно. Большое значение приобрела активная иммунизация формолэмбрионвакциной против соответствующего вида вируса — восточного или западного. Вакцина была предложена в 1938 г. Бирдом, Финкельштейном, Сили и Быковым (J. W. Beard, Н. Finkelstein, Sealy, R. Wycoff). Вакцину стали широко применять на практике. Только до 1940 г. было привито около 3 млн. лошадей в неблагополучных и угрожаемых по ИЭМ очагах.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Инфекционные энцефаломиелиты лошадей, описание болезни.

Инфекционные энцефаломиелиты лошадей — вирусные заболевания, похожие по клиническому проявлению.

Инфицирование инфекционными энцефаломиелитами лошадей производится кровососущими насекомыми. Все энцефаломиелиты различаются природной очаговостью.

Венесуэльский энцефаломиелит отмечается в Венесуэле, ряде стран Центральной Америки, южных штатах США.

Восточный энцефаломиелит прослеживается на Восточном побережье США, Канады, в Мексике, Бразилии, Панаме, на Кубе, Гаити. Вспышки заболевания практически каждый год появляются в США, эпизоотии выделяются значительной смертностью.

Западный энцефаломиелит отмечается на Тихоокеанском побережье США, в Канаде, Мексике, Бразилии, Аргентине.

Энцефалит долины Муррей встречается в Австралии и Новой Гвинее.

Японский энцефалит — распространенное заболевание в Японии, Китае, Индонезии, на Корейском и Индокитайском полуостровах.

Энцефаломиелит, встречающийся в России, нередко фиксировался на территории страны в 20-40-е годы.

Болезнь Борна прослеживается в виде спорадических эпизодов в Германии и отдельных прочих государствах Европы. В прошлом наблюдались массовые вспышки.

Возбудители энцефаломиелитов — вирусы, причисляются к семейству тоговирусов (роды альфа- и флявивирусы), входящих в широкую группу арбовирусов.

Отличительная характерная черта их — передача членистоногими. Вирусы слабоустойчивы в наружной среде, резко дезактивируются под воздействием солнечного света, тепла и дезинфектантов.

Патогенны не только лишь для лошадей, однако и для сельскохозяйственных животных прочих видов, а также человека.

Возбудители энцефаломиелита лошадей в РФ и заболевания Борна не идентифицированы, первый поражает только лишь лошадей, его патогенность для животных сельскохозяйственного назначения прочих видов, а также человека не признана.

Инфекционные энцефаломиелиты лошадей — способ передачи.

Эпизоотология. Характерная черта вирусных энцефаломиелитов принадлежность к определенной местности (нередко болотистой, сырой), их возбудители паразитируют в теле животных сельскохозяйственного назначения различных видов, а также человека.

Главный путь передачи — трансмиссивный через членистоногих. У сельскохозяйственных животных (в том числе птиц) отдельных видов вирусы вызывают бессимптомное инфекционное заболевание, данные виды являются первопричиной возбудителей в природе. Лошади и люди заболевают в клинически выраженной форме.

Природная очаговость энцефалитов однокопытных обуславливается передачей инфекции по замкнутой цепи: переносчик — животное, резервуар — лошадь либо человек. Для борнасской болезни и энцефаломиелита лошадей в России механизм передачи вируса не слишком изучен.

Иммунитет к инфекционным энцефаломиелитам лошадей.

У перенёсших инфекционный энцефаломиелит лошадей образуется невосприимчивость к вирусу.

Признаки инфекционного энцефаломиелита у лошадей.

Длительность инкубационного периода от 3 до 10 суток. У заболевших лошадей отмечается двухпиковая лихорадка. Второй пик как раз совпадает с диссеминацией вируса в нервных клетках. Патологии ЦНС (энцефаломиелит, менингит) сопровождаются утратой кожной восприимчивости, атаксией, движением по кругу, расстройством деятельности желудочно-кишечного тракта, желтушностью слизистых оболочек.

Летальный исход лошадей при восточном энцефаломиелите доходит 90-92 %, при западном энцефаломиелите — 22-30 %.

Энцефаломиелит лошадей в России проявляет себя в сильной, тихой, либо депрессивной, и скрытой формах. В продромальный этап видны невысокий подъем температурных показателей тела, угнетение, желтый оттенок слизистых оболочек. При буйной форме лошади после фазы депрессии оказывают неудержимое влечение вперед, упираются головой в землю.

Наблюдаются увеличенная перистальтика, запор. Позыв на приём пищи сохраняется.

Заболевание продолжается до 5 суток. Тихая форма имеет своей отличительной чертой депрессию животного, лошадь стоит, уткнувшись головой в кормушку, стену. Температура тела у животного в норме.

При борнасской болезни отмечается сначала угнетение, слабость и зевота, появляются запоры, поносы, колики. Потом отмечается симптомы патологии нервной системы, угнетение, вялость либо возбуждение. Длительность заболевания 2-6 недель. Выздоровление случается в отдельных эпизодах.

Изменения в организме у лошадей от инфекционного энцефаломиелита.

Они нетипичные. Обнаруживают кровенаполненость мозговых оболочек, некоторую опухлость мозгового вещества.

Нередко отмечается катаральный энтероколит, гипотрофию, уплотнение печени. При борнасской болезни в ганглиозных клетках (как правило, в аммоновых рогах) находят включения — тельца Иоста-Дегена.

Диагноз на инфекционный энцефаломиелит.

Диагноз устанавливают на основе эпизоотологических, клинических данных и итогов вирусологических и серологических изучений. Из серологических тестов применяют РСК, РДП, РТГА, иммунофлюоресценцию. Различать энцефаломиелит необходимо от бешенства, нервной формы ринопневмонии на основе данных лабораторных изучений.

Профилактика инфекционного энцефаломиелита у лошадей.

Предупреждение и меры борьбы. В природных очагах данной заразы производят процедуры по упреждению нападения насекомых-гематофагов на лошадей, культивации репеллентами, содержание в ночное время лошадей на конюшнях; разносторонние меры по уменьшению численности переносчиков – через осушение болот и водоемов, орошение и др.

В качестве иммунопрофилактики применяют живые и инактивированные вакцины, главным образом, против венесуэльского и японского энцефаломиелитов. Лечение нездоровых лошадей симптоматическое.

Нездоровых лошадей отделяют от всех и производят их лечение. На хозяйство накладывается карантин, который в РФ снимают через 40 суток со времени последнего случая гибели либо выздоровления лошади.

Все вопросы про инфекционные энцефаломиелиты лошадей можно задать в разделе болезни лошадей форум.

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКШ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ НПО "ВЕКТОР".

на правах рукописи

ПЕРЕБОЕВ АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ВИРУСА ВОСТОЧНОГО ЭНдаМОЖЬШТА ЛОШАДЕЙ ПРИ ПОМОЩИ МОНОКЛОНМЬНЫХ АНТИТЕЛ

, А ВТО РЕ ФЕ Р А Т

диссертации- на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Раоота выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной биологии НПО "Вектор".

Кандидат биологических наук Б.Б.ЛоктеЕ

Доктор медицинских наук H.H. Сергеев

Кандидат биологических наук А.В.Таранин

Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН.

Защита диссертации состоится 42- 199^ г. в час, заседании Специализированного совета К 09a.08.01 при Всесог ном научно-исследоватольском институте молекулярной биологии £ "Вектор" по адресу 633159, Новосибирская обл.. Новосибирский р-п.Кольцово.

С диссертацией мошо.ознакомиться в библиотеке Всесоюзно научно-исследовательского института молекулярной биологии.

Автореферат разослан 4S - /^n forir

Ученый секретарь Специализированного.совета ; кандидат химических наук Т.Н.Щубина

ОЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность -проблею* Вирусу ВсЗЛ уделяется значительное внимание б связи с тем. что он является весьма патогенным для человека. Летальность при этой инфекции достигает 70-75«. Зпи-г гоотки в США среди лошадей возникают практически ежегодно, ■главным соразом вдоль Атлантического побережья и Мексиканского залива. Периодически - через 10-15 лет - происходят белее или менее значительные, вспышки заболевания.

Природным резервуаром возоудителя служат прежде всего птшы, кз которых значительную часть составляют мигрирущке на большие расстояния перелетные птицы. Все это обусловливает необходимость всестороннего изучения данного возбудителя с целью разработки средств диагностики, профилактики а лечения вызываемого вирусом'.ВсЗЛ заболевания.

До настоящего времени -Эффективных средств профилактики инфекции ВсЗЛ не было создано. Имеющиеся аттенуированные птам-ш и тшактивированнне препараты не удовлетворяют требованиям надежности и безопасности для человека. Вирус ВсЬД в последние годы начинает интенсивно изучаться. Это, видимо, объясняется усилением активности вируса в природе в конце 80-х годов и возникающей опасностью появления вспышек данного заболевания. Подучены данные по первичной структуре РНК генома вируса. Однако, антигенная, структура вируса ВсЗЛ остается практически не изученной, особенно те ее аспекты, исследование которых вез-, можно лишь с.применением МАТ. Имеются лииь единичные сообщения по этому поводу. В то же. время многие альфавирусы детально исследованы с этой стороны.

В этой связи вызывает интерес изучение вируса ВсЗЛ, осо-

бенностэй его биологии, локализации участков вирусных белков, участвующее а формировании противовирусного иммунитета, определение антигенных связей вируса ВсЭЛ о другими, альфавирусаш.

Цель и задачи исследования При выполнении данной работы преследовалась цель изучить особенности антигенной структуры вируса ВсЭЛ. Дли этого решались следушие задачи:

- Получение и характернаация панели МАТ к вирусу ВсЭЛ;.

- Определение рели вирусных белков в формировании прсч'вовир'/сного ^лмунлтв^э í "

- Гопсдсго-функциональнсе картирование антигенных дзтер-

П032Е'ХНССТ!1Ы1С ГДИКОГТиОТ бИРСВ Е1 -I F2 *

- лзученпе -антигенных- взаимоотношений -вису са-ВсЭЛ с щ/-паи. слигззпГ'/самк.

Научная новизна и практическая ценность работы Создана коллекция гибридом, секретирущих моноклональные антитела к структурным белкам вируса ВсЭЛ* Впервые с помощью МАТ исследована антигенная структура вируса 8сЭЛ. Построена тополо-гсфункциональная карта антигенной структуры вируса ВсЭЛ. Проведано изучение антигенных взаимоотношений вируса ВсЭЛ с другими альфавирусаш. Обнаружен антигенный район, индуцирующий синтез антител, блокирующим гемагглютинацию адьфаБирусами. Полученные материалы могут быть использованы для создания высо-козффектиных диагностических средств и прсфмактических препаратов против БсЭЛ. .

Объем я структура диссертвгаш Диссертация состоит из bss-".* г:лтл глаз: обзора литературы (Глава 1), исходных мате-•.Глава г ¡. основных методов (Глава ">;, результатов

водов к списка шифруемое литературы (122 сскжсь Расст:. к:— ложена на 115 страницах машинописного текста,.включает : рг-. сунка, 9 таолкц к г щжложения.

Ашхрооацая работы Материалы диссертации докладывались ва. 2-й отраслевой конференции-конкурсе "Актуальные проблемы биотехнологии" (Кольцово, 1990г.), Всесоюзной шгадш-семшарэ "Молекулярная биология л медицина". (Ленинград, 1990г.). В завершенном виде диссертационная работа долокена не заседании научного1 семинара ВНИИ МБ 10 июня 1992 г.

Основные положения диссертации отрадны в пяти опубликованных научных работах. ' .

Использованные сокращения АТ - антителе; МАТ - монокло-нальные антитела; БсЭЛ - Воточшй энцефаломиелит лоладей; ВЗЛ

- Венесуэльский энцефаломиелит лошадей; ИЩА - ишуноферментЕКЕ анализ; РН -реакция нейтрализации; РТГА - реакция торькжения гемагглютинации; ТРИА - твердофазный радиоиммуноанаяиз; ПЭГ -полпзтиленглкколь; ГАТ - гкпоксантин, аминоптерин, тимидин; гп

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАЕОТЬ!

I. Получение габрндои, скк-гезируксгн. к вирус? ВсЗЯ

Самок крыс юи ишунизировали двукратно с интервалом в две недели внутриорюшинным•введением 100 мкг очиаенного вирусь БсЭЛ в смеси с полным адъювантом Фрейкда ("Вадга"). За I дня до слияния внутривенно вводили 50 мкг вируса, суспешгарованяо-го в.физрастворе. Самок-мшзея вахв/оиммунизировали ко таксе ве схеме, но ввдтркбрмйшно вводили 50 мкг, а внутрквейно зо № "!0, 1311, 43?б, ЗС4., 7Д6, . 7СЗ, 7Е1. 4Н5. 424, 1F3, 5Ы6. 5С11.2НЗ, 1Б2, соответственно, а - нормальная крысиная сыворотка, :: - красаная антасыворотка к вирусу ВсЭЛ.

?пс а. Ражтс«омуаспрецяпятацня структурных оелков вируса-. ВсЭЛ •¿гояоктональнывд ангятвлаыя.

Лсрсгка; : - сы-сь МАГ к г-япсспротвинаы 21 я Е2 вируса ВсЭЛ:

- - , ДС5. 731 , 7СЗ. Tili. COOT3S тотзвмко.

- чс&нзлья&а хс1сякя.ч гыасреяса.

нальном анализе (РН. РТГА, пассивная зашита животных). Оказалось, что ю типов--МАТ способны блокировать гвмап\шпшацих> вируса ВсЭЛ. Восемь из них были-такав способны блокировать ГА, вызываемую вирусом ВЭЛ.'Три типа МАТ нейтрализовали инфекционную активность вируса ВсЗЛ на культуре клеток (МАТ 4Б4, 153, 5Е6). Пять типов ЫАТ.(4Е4, 1РЗ, 5Н6, 5611, 1В2) при связывании с-вирусом ВсЗЛ запасшли белых мышей от развитая летальной- инфекции. При . этом наличие протективных свойств МАТ не всегда совпадало с наличием нейтрализувдей .активности (МАТ 5211, 1В2). Свойства всех МАТ, специфичных к гп Е1 и МАТ к га Ег. обладающих биологической..активностью, приведены в Табл. 1. Нейтрализующая, антигекагглатинирушая и протективная активность МАТ ассоциировалась только с гп-Е2 вируса ВсЭЛ.

2.3. Анализ конкурентного связывания ШТ с поверх-

ностккш глякопрбтеЕнаыи вируса ВсЗЛ, Для картирования антигенных детерминант был проведен анализ конкурентного взаимодействия немеченных и радиоактивно меченных МАТ, специфичных к гликопротеину Е1. Использовали е меченных 125 i к 8 немеченных МАТ. Данные анализа позволяет заключить, что-на гп Е" вируса ВсЭЛ имеется не менее четырех Бзаю.шонеперекрывакшхся сайтов связывания МАТ - сггш; £1-1,2,3 и 4. Связывание МАТ с -зтил® сайтам не проявляйте/: биологическими эффектами. - _ .

.Для, картирования эпитспов гликопротеша . Е2 использовал: го меченных ,251 и 24 немеченных МАТ. Данные анализа позволила идентифицировать на гя три антигенных сайта (12-4, Е2-5, Е2-6), связываясь с .которыми-. МАТ.. не проявляет активности в 6е

. ¿логических.рейашях и 4 сайта, (Е2-1.2,3,7), етвечащнх на . - 8 -

Свойства МАТ, взаимодействующих с вирусом Восточного энцефалоютелита лошадей

Взаимодействие с вирусом ВсЭГ

МАТ Вид Белок- ИФд"* РН** р^рд**Пр°текхдая мишень (ИР, 1^)

МЫЩЬ ' крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса крыса мыть мышь

Е1(ИБ) 31(ИБ) Е1(ИБ) Н1(ИБ) 31(ИБ) 31(ИБ) 21(ИБ) 31(ИБ)

бОООО 6СЮОО 240000 бОООО

50000 30000 50000 60000 . 60000 60000 бОООО

зоооо 60000 бОООО 120ООО 240000 бОООО

Е2(КРИ4) 480000 Е2(КРМ) 120000 вг(ИБ) 120000

н.о. н.о. л.о. н.о. н.о. н.о. н.о. 3200 . 2000

160 640 320 320 640 1280 160 1230 320 320 10240

вирионе за формирование вируснеЯтрализушии, внтигемагглвтинк-руших или протектизшх антител (Табл. 2). МАТ к трем эпитопам в составе 2-х сайтов (Е2-2а, Е2-За,Ъ) нейтрализовали вирус на

культуре клеток. Три сайта оказались способными вызывать индукцию AT, подавлякщих агглютинацию эритроцитов (сайты E2

l3,b,c,d,e,i,g,h; Е2-2а; £2

За,Ъ). Сайт Е2-1 содержит 8 зпитотов для перекрестнореагирущих в РТГА с вирусами ВсЭЛ и ВЭЛ МАТ. Моноклональные антитела к 5 эпитопам трех сайтов (Е2-2а,Ъ; Е2-За,Ъ; Е2- 7) были способны защищать зшвотных от летальной инфекции. Эпитопы связывания для MAT 5Н6 и 5G11 картируются в составе одного сайта на гп 12, что мокно рассматривать как доказательство того, что белком-мишенью для этих МАТ является именно Е2. На основании данных конкурентного анализа и биологической активности WIT наш построена топологическая карта их взаимного расположения. (Рис.з). При ее построеншш данные конкурентного анализа были использованы для выделения сайтов связывания МАТ, а данные по биологической активности антител - для выделения зпитопов связывания МАТ внутри одного сайта.

. Конкурентный анализ связывания МАТ с эпитопами гликопро-теина 22 показал наличие не менее- семи сайтов на гликопротеине е2 (Табл. 2, рис.з). Шесть сайтов, частично перекрываясъ, расположены не гликопротеине Е2 в виде непрерывной последовательности, представляющей собой, по-видимому, иммунодощшвнт-ную область. Причем биологически значимые районы оказывается сгруппированными в компактную структуру - домен. В ату область не включается лишь сайт Е2-7, взаимодействующий с протоктйокыг ми МАТ 1В2.

Свойства ешггопов гликопротеина Е2 вируса ВсЭЛ

Сайт, эпитоп ват Функция

32-2а SK6 РН,РТГА,протекция

i 2£-3a -iE-1 . PH. РТГА, Протекция i ■ j 52-3b_1 УЗ •■ РН,РТГА,Протекция

22-7 • , „ Поотвкция . i

Примечания; Ш - JUT ГОзатяааш в peaххаи нейтрализации; РТГА - MAT шзаткввн а рамсда тормажеякя гомагглютинации; Протехцдя - ШХ способны зпяитать tosseft от летальной инфекцка ЗсЗ.Т: - - стсутгтваю эффекта: # - IUT гголучекы к вирусу БЗД.

22-1 швлнта лошадей.

- граням впатрзоа ^ - рн, РТГА. Протекая*

отсутствие _ - биолигячвскжх фуякыяЯ

С нейтрализующей активностью оказались связаны;три зпито-

па сайтов Е2-2 и Е2-3 вируса ВсЭЛ. ' МАТ. к этим сайтам,,а-также

антитела к сайту Е2-1. оказались способны блокировать агглютк-

Еалшо гусиных эритроштов (Табл. 2; Рис.з). Взаимосвязь этих двух активностей со строго определенными районами гп Е2 характерна также и для вируса ВЭЛ. У других представителей альфави-'русов гемаглвтинирующая активность обычно связывается с гп ш, а у вируса Леса Семлики с этими двумя свойствами.связаны разные зпитош белка Е2.

На гп Е2 вируса ВсЭЛ обнаружено, три антигенных сайта, участвующих в гемагглютинаши. Два из них, обеспечивающие так-г.е нейтрализацию, являются, по-видимому, видо специфичными (Е2-2а, За.Ь). Сайт Е2-1 представляет собой сложную структура в формировании которой принимают участие эпитопы, носящие ка* линейный, та.с и конформашоннозависимый характер. Этот райо! распознают восемь типов МАТ различного, происхождения, которые одинаково хорошо взаимодействуют с вирусами ВсЭЛ и ВЭЛ в РТГА. Это позволило нам предположить--, группоспешфгшость данногс сайта для адьфавирусов.

Семнадцать типов МАТ, обладающих РТГА-активностыо по отношению к вирусам ВсЭЛ или ВЭЛ, из которых 8 типов реагировал в данной реакции с обоими вирусами были исследованы на способность подавлять гемагглютинашш, • вызываемую другими альфави-руеемк. • Были исследованны г шташа вируса ВсЭЛ, 2 штамма вируса ВЭЛ, а также по одному штамму.вирусов ЗЭЛ, Сицдбис, Лес; Сешшк, Пиксува, Чикунгунья, Гета и Аура. Данные по перекрестному взаимодействию МАТ. в РТГА с альфавирусами МА' представлены в Табл.з. Оказалось, что перекрестнореЕгирущие

Изучение перекрестных взаимодействий МАТ.- обладающих активностью а РТГА, с различными«предо? 'чтелями альфазирусоз.

МАТ тшу- ■Титл В РТГА

ногэв : :" 1 ВсЭЛ г ВсЭЛ ВЭЛ* ** ВЭЛ ЗЭЛ ВС ВЛС ВП ВЧ Гзта!Аура

4Е4; 1РЗ 5Н6 2ЯЗ 4Н5 ■ 4Р6.' ЗС4 ¿сз: 73)1 7СЗ ТАЗ : 3211 ВТ2 5В10 5ЕТ 5А12 гт ВсЭЛ ВсЭЛ ВсЭЛ ВсЭЛ ВЭЛ ВЭЛ ВЭЛ' ВЗЛ ВЭЛ ВЭЛ ВЭЛ ВЭЛ ВЭЛ вэл ВЭЛ ВЭЛ ВЭЛ . 1280 1бО 0240 зго 1280 160 160 640 320 : 640 зго 1230 .- зго 2048С 1280 2560 640 640 640 640 ' 640 : зго - ) - 320 1280 го 80 160 160 320 160 320 640 640 1280 . 40 1280 - 1280 1290 320 1280 .640 320 640 1280 320 640 2560 2560 320 20 640 320 320 320 2560 640 160 20 320 40 40 30 2560 5120 зго 1280 1280 640 1280 1гео 1280 640 80 320 зго 160 80 40 5120 1280 320 320 2560 1280 640 320 2560 10240 540 5120 20480 1230 1280 1280 20 640 20 1 С 160 80 30 30

Примечания; тятры в РТГА приведена-..в обратных,величинах, означает'титр в РТГА т ивф9ЩЩ2, вызываемой двумя вирусами, аналогичности факторов ¡крулентноста обеих вирусов и следовательно - о сходстве отельных этапов их патогенеза. . Именно поэтому для вируса эта ¡айоны могут быть важными н сохраняться прн эволзяши.

.При :сравнении , пары. атачаюз БД - 310 бьшэ показано, что .нтягэвяыо детерминанты за глиходротеияа 31 атэкаа 31 о гяруез

Сравнивая функциональную организацию гп:Е2 вирусов БЭЛ и БсЭЛ, являющихся типичными представителями различных антигенных комплексов, легко, заметить некоторыеобщие закономерности. . Девятнадцать из. 38 Е2-спецкфЕЧНьгх. МАТ реагируют с обоими .вирусами. У обоих .вирусов .функциональная активность (нейтрализация, протекция и антигемагглютшшрущая; активность) ассоциируется в основномс тремя сайта®, частично-перекрывавшимися менду собой Е- образуюащми аданую.-структуру..'- В этой области выделяется К-район (сайт Е2-1), оббснечйзащий дерекрест в РГГА всех исследованных адьфавирусов и район, .аналогичный эпитощ- Е2-2а у вируса ВсЭЛ и эпиталам Е2-6а вируса ВЗЛ. -МАТ к этим эштопам обладает чрезвычайно .-.выраженным-' протективнкм .гф-фектом (более' 90S - суммарной=активности--всех--МАТ-.),• высокой активностью в реакции!нейтрализации' и РГГА. И наконец, оба вируса имеют - в своей: .структуре 'сайт Е2-4, -.- обращающий на себя внимание своей -ишунодоминантностью.- -К этим-'.сайтам '.получено наибольшее^количество гибридом, они непосредственно, дрдагшсаит к функционально активному району, и взаимодействие о -;.-еими ííáT не влияет на функцию-ra.Е2..

npir исследовании гп Е1 вируса Всал'наи не удалось' обнару^-шть íiAT, тормозящих гемагглютагаащю, хотя- 'по данным^ ковку-

рентного анализа было картировано не менее четырех взаимноне-перекрывающихся антигенных сайтов на молекуле гликопротеикз Также у МАТ к белку Е1 отсутствовала нейтрализующая и дроте-ктивная активность. Сходные результаты были получены и при исследовании бблка 31 вируса ВЭЛ, на котором удалось картировать только один эпитоп, индуцирующий синтез протективных антител.

У типичных представителей двух других антигенных комплексов альфавируссв - комплексов ЗЭЛ и леса Семлики функциональная нагруяенность гп 22 представляется несколько другой. Антигемагг.'потинирухшая активность ассоциируется с -белком 31, нейтрализующая и протективная - с 32.

Однако, наряду с суще с гзенгЪм сходством антигенной структуры вирусов ВсЭЛ и ВЭЛ, нам удалось:обнаружить и явные отличия, существующие- между ними. Так, на гп Е1 обнаружена лаиь одна антигенная детерминанта, общая для двух вирусов. На гп Е2 вируса ВсЭЛ моноклональными АТ распознается 13 уникальных детерминант, . среди которых 4 формируют биологически значимые противовирусные МАТ. Для.вируса ВЭЛ таких детерминант.нами обнаружено е. , ВЫВ ОД У

1. Впервые создана коллекция гибридом, синтезирующих мо-нсклсналышв. антитела. к структурным белкам'вируса Восточного энцефаломиелита лозадей. Коллекция состоит из 16 мышиных я £4 ксысяных гибсидс-м.

. Свойства полученных -МАТ изучены в иммунсфарквнтнсм шзлпи, :глмунсолоттинге, пзакциях ггоуснс« кчйтззлпззцик.

торможения гемагглютшации, пассивной защиты-животных. Показано, что нейтрализующие, тормозящие гемагглютинашсо и.протек-

тивные антитела индуцируются антигенными"- детерминантами по-

верхностного гликопротеина Е2.

3. Методом ТРИА проведен анализ конкурентного связывания МАТ с вирусом ВсЭЛ. Создана "клася^икация и построена карТЕ антигенной структуры поверхностных гликспротеинов. вируса ВсЭЛ. На гликопротеине Е1 картировано 4 неперекрывающихся антигенные сайта. На гликопротеине Еа картировано 7 частично перекрывающихся антигенных сайтов, 4 из которых индуцируютлМАТ, активные в оиологическкх реакциях. Эти 4 сайта сгруппированы в единую структуру - домен.

4."На гликопротеине Е2 впервые" оонарукен антигенный район, антитела к которому тормозят гемагглютинацию, вызываемув альфавирусами.всех серокомплексов. . Данный район содержит эпигоны связывания МАТ, носящие как линейный, так и так и конфор-кашоннозависимый. характер. •

5. 'Исследовано перекрестное взаимодействие, панели МАТ с вирусами ВсЭЛ и ВЭЛ. Показано наличие .не'менее 19 ооших антигенных детерминант на гп Ег дь^х вирусов, 15 из которых индуцируют синтез 11, обладающих биологическим эффектом. На гп Е' ооааруаена 1 соаая антигеннаядетерминанта. В то же время нг гп Е1 и £2 какдого вируса имеются -'специфические антигенные детерминанта, обусловливающие своеооразие .их-антигенной орган1.' заиик.

Основные результаты диссертации изложены-в следующих рзоотэя.

*. А.В.ПереОоев, Е.Е.Волчков, Е.В,Протопопова, Е,В.Аге-нов, Е.А.Святченкс, И.А.Разумов, 'В.Е.Локтев, С.В,Навесов "Изучение антигенной структуры вируса Восточного айцефаломие-

дата■-лошадей, при иомопщ монсклональных антител./ Материалы 2Я праслевой. конференции-конкурса молодых ученых "Актуальные гроолемы биотехнологии" - 1990. - п.Кольцове. - с.32-33.

2. А.3.Перебоев, Е.В.Протопопова, Е.В.Агапов, З.А.Сзят-генко, И.А.Разумов, В.Б.Локтев. Изучение антигенной структуры труса Восточного энцефаломиелита лошадей при помоши монокло-[альных антител. /Материалы Всесоюзной школы-семинара "Молеку-шрная биология и медицина". - 1990. - г.Ленинград. - с.15.

А.с. по заявке N 487482.1 от 10.07.90 / А.В.Перебоев, I.В.Агапов, -В.А.Святченко. В.Б.Локтев. "Штамм гибридных культивируемых клеток хивотного Mua musculua. L. - продуцент про-'вктизкых маноклональных антител к вирусу Восточного энцефзло-мвлита лошадей4.. положительное решение от 22.04.91.

5. A.V PereBoev, S.V Agapor, V.A Svjatohenko, Г.А laauaavy 2.V Protopopova, ,V.B ,boktev. Investigation oi intigenio structure at Easter«.--equine encephalomyelitis virus •y nls^rs oi monoclonal antibodies./ Biomedical Sciences. - 3