Вирус полиомы из клеток меркеля
Задуманные и разработанные эксперименты: WAMB WM. Выполнял эксперименты: JMB HBPMD. Проанализированы данные: CTAHW JGMH JMB HBPMD WAMB WM. Написал документ: CTAHW JGMH WAMB WM.
Недавно был обнаружен новый вирус, называемый клеточный полиомавирус Merkel (MCPyV) в карциноме клеток Меркель (MCC). MCC — редкая агрессивная мелкоклеточная нейроэндокринная карцинома, в основном, полученная из кожи, морфологически неотличимая от мелкоклеточной карциномы легких (SCLC). До настоящего времени фактическое присутствие вируса в опухолевых клетках MCC на морфологическом уровне не было продемонстрировано, и присутствие MCPyV в других мелких нейроэндокринных карциномах клеток еще не изучено.
Мы исследовали образцы тканей MCC у пяти пациентов и SCLC от десяти пациентов для присутствия MCPyV-ДНК с помощью ПЦР и секвенирования. Электронная микроскопия использовалась для ультраструктурного поиска морфологического присутствия вируса в положительных образцах MCPyV-ДНК. MCPyV был обнаружен в двух из пяти первичных MCC. У одного пациента MCC MCPyV-ДНК была обнаружена как в первичной опухоли, так и в метастазировании, что настоятельно указывает на интеграцию MCPyV в клеточную ДНК опухоли у этого пациента. В первичной MCC другого пациента вирусные частицы в ядрах опухолевых клеток и цитоплазмы идентифицировали с помощью электронной микроскопии, что указывает на активную репликацию вируса в опухолевых клетках. Ни в одном из SCLC обнаружена MCPyV-ДНК.
Наши результаты свидетельствуют о том, что MCPyV является онкогенным полиомавирусом у людей и потенциально причинно связан с развитием MCC, но не с морфологически подобным SCLC.
Меркель-клеточная карцинома (MCC) — редкая карцинома кожи, которая быстро метастазирует и имеет 5-летнюю смертность до 50% [1]. Заболеваемость резко возрастает и утроилась за последние 15 лет в США [2]. Факторами, замешанными в этиологии, являются ультрафиолетовое облучение, преклонный возраст и иммуносупрессия [2]. В частности, многие формы иммунного подавления Т-лимфоцитов связаны с MCC, например. СПИД [3], трансплантация твердых органов [4] и хронический лимфоцитарный лейкоз [5].
В 2008 году Feng et al. обнаружили новый полиомавирус в образцах ткани MCC [6] и назвали его полиомавиром клеток Меркель (MCPyV). Семейство вирусов Polyoma подразделяется на несколько генетически различных групп. Одна из этих групп, подгруппа SV40, содержит четыре известных вируса полиомы человека: BK, JC, KI и WU. Известно, что вирус BK и JC вызывает инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом, тогда как KI и WU были выделены из носоглоточных секретов пациентов с респираторными инфекциями [7] -9. Полиомавирусы могут быть онкогенными у животных, но до сих пор не было установлено, что полиомавирус не является онкогенным у людей [10].
Feng et al. показал, что MCPyV интегрирован в разных местах в геноме человека в MCC, а кроме того, большой транскрипт T-антигена выражен в MCC [6]. Это подразумевает, что MCPyV не только связан с MCC, но и может быть на самом деле быть возбудителем. Действительно, в нескольких исследованиях сообщалось о наличии MCPyV-ДНК в 43-85% случаев MCC [6], [11] — [13].
MCC и мелкоклеточная карцинома легкого (SCLC) являются одновременно агрессивными нейроэндокринными карциномами, гистологически состоящими из морфологически идентичных мелких клеток. Фактически, MCC часто называют кожной формой мелкоклеточной карциномы легких [14]. Подобно MCC, SCLC также является высоко злокачественной карциномой с 5-летней выживаемостью менее 5% [15]. Эта опухоль содержит около 10-20% рака легких и сильно связана с употреблением табака [15], [16].
Чтобы исследовать заболеваемость MCPyV и отношение к онкогенезу, были проанализированы образцы тканей из малоцепочечных нейроэндокринных карцином как с кожи, так и с легкого для присутствия MCPyV-ДНК. Мы обнаружили, что MCPyV-ДНК присутствует в 40% случаев MCC и отсутствует во всех SCLC. Это говорит о том, что MCPyV имеет ограниченный тропизм. MCPyV-ДНК была обнаружена в первичной и метастатической опухолях одного пациента MCC, что указывает на интеграцию вирусной ДНК. Кроме того, мы изучили образцы тканей MCC с помощью электронной микроскопии, чтобы определить фактическое присутствие вирусных частиц в опухолевых клетках. Вирусные частицы MCPyV были ультраструктурно идентифицированы в первичной цитоплазме опухолевых клеток MCC и ядра у одного пациента, что настоятельно указывает на активную репликацию вируса.
Мы получили замороженные и парафиновые (формалин-фиксированные) MCC и SCLC биопсию и образцы резекции из архивов отдела патологии Медицинского центра Университета Радбуда Неймегена. Все образцы были собраны для диагностических целей в 1995-2008 годах. Из пяти пациентов МСС было использовано семь образцов, в том числе два первичных МСС и их метастазы. Использовались образцы замороженных SCLC у десяти пациентов, представляющих три первичные опухоли, три узловые и четыре отдаленные метастазы. Во всех случаях диагноз либо MCC, либо SCLC был подтвержден иммуногистохимией с использованием фактора транскрипции щитовидной железы-I и низкомолекулярного цитокератина 20, чтобы различать эти два объекта. Для ПЦР использовались контрольные образцы, состоящие из замороженных и парафиновых образцов тканей у восьми пациентов с переменными злокачественными и доброкачественными кожными заболеваниями. Клинические характеристики всех пациентов приведены в таблице 1.
f: женщина; м: мужчина.
Введенные парафином срезы инкубировали в течение ночи с протеиназой K в буфере для лизиса (56 ° C) до выделения ДНК с использованием набора ДНК-ткани EZ1 (Qiagen Benelux BV), как описано ранее [17]. ДНК была выделена из секций замороженной ткани с использованием комплекта изоляции Magnapure Total NA (Roche Molecular Diagnostics). Продукт изоляции хранили при -80 ° С до использования для ПЦР.
Для ПЦР использовали 4 мкм срезы из вложенных парафинов тканей и 10 мкм срезов образцов замороженной ткани. Все образцы готовили и анализировали в стерильных условиях. Все образцы тканей изучались в соответствии с национальными этическими принципами.
Перед обнаружением MCPyV-ДНК качество ДНК тестировали с помощью β-глобиновой ПЦР для обнаружения ДНК человека (Roche Diagnostics). Все образцы испытали положительный результат. Праймеры для обнаружения MCPyV были адаптированы из Feng et al. [6]. Мы использовали LT3, поскольку сообщалось, что этот набор праймеров имеет самую высокую чувствительность [13]. Мы уменьшили размер ампликонов до 250 п.о., чтобы получить более высокую чувствительность в образцах образцов, обработанных парафином [18]. Последовательность прямого праймера была 5′-ац tgc acc ttt tct aga ctc c-3 ‘, а обратная праймерная последовательность 5′-ata тега ggg cct cgt caa cc-3’. ПЦР MCPyV проводили с использованием PCR Mastermix (Roche Diagnostics), содержащего ДНК-полимеразу Taq. Пять мкл ДНК использовали в общем объеме 45 мкл. Вода вместо ДНК-матрицы использовалась для ПЦР-отрицательных контролей, содержащих все остальные компоненты ПЦР. ПЦР состояла из 40 циклов с температурой отжига 50 ° С. Продукты ПЦР анализировали с помощью гель-электрофореза и путем анализа последовательности.
Положительные образцы MCPyV секвенировали с использованием последовательности циклов Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). Полученные последовательности сравнивали с эталонной последовательностью базы данных Entrez Nucleotide Национального центра биотехнологической информации (GBB) (gb / EU375803.1. Изолят полиомавира Merkel MCC350 и gb / EU375804.1, изолят полиомавира Merkel MCC339) с использованием взрыва NCBI программа. Подтвержденные положительные образцы позднее использовались в качестве положительного контроля в последующих экспериментах ПЦР.
Для электронной микроскопии использовался кусок парафинового материала из двух положительных MCC-образцов MCPyV. Материал депарафинизировали в течение ночи в ксилоле, регидратировали и промывали в 0,1 М натрий-какодилатном буфере. Фрагменты ткани откладывают в 2% OsO4, затвердевшем в лапте, в течение 1 часа, обезвоживают и внедряют в Epon812, процедуру Luft (Merck, Darmstadt, Germany). Ультратонкие срезы контрастировали с 4% уранилацетатом в течение 45 мин, а затем с цитратом свинца в течение 5 мин при комнатной температуре. Разделы были исследованы на электронном микроскопе Jeol 1200 EX2 (JEOL, Токио, Япония).
Образцы тканей первоначально были взяты для диагностических целей. Для нашего исследования мы выбрали оставшуюся часть образцов ткани из нашего архива, после чего они были закодированы. Наша больница использует политику, согласно которой закодированный материал пациента, который был первоначально удален для диагностических целей, может использоваться для дальнейших исследований, если только пациент не заявил об ином. В случае исследований с закодированным / анонимным материалом информированное согласие не требуется, если исследователь не может обнаружить идентичность пациентов, связанную с материалом исследования. Когда пациент явно отказался, им не разрешено использовать эти образцы тканей для исследования. Авторы заявляют, что они использовали кодированные образцы опухолей и что ни один из пациентов не отказался участвовать в исследовании.
Исследователи не проконсультировались с комитетом по этике / IRB перед исследованием.
Средний возраст пациентов с MCC составлял 63 года, а 60% мужчин. MCPyV-ДНК была обнаружена в первичных опухолях двух из пяти пациентов с MCC (40%). Из этих двух пациентов был метастатический рак, и MCPyV-ДНК была обнаружена и при этом метастазировании (пациент № 3). Другие три первичных образца MCC и метастазы другого метастазирующего пациента были все протестированы отрицательно для MCPyV-ДНК. Последовательность всех положительных продуктов ПЦР показала MCPyV-ДНК.
Для того чтобы морфологически установить присутствие вируса в положительных образцах MCPyV-ДНК, проводилась электронная микроскопия. Глутаральдегид является предпочтительным фиксатором для электронной микроскопии. К сожалению, в нашем архиве присутствовал только фиксированный формалин и встроенная или замороженная ткань (без криозащиты) MCC. Известно, что эти обычные методы фиксации и встраивания вызывают различные ультраструктурные артефакты в зависимости от нескольких параметров [19]. Из-за этих артефактов была получена субоптимальная морфология, и только один из образцов MCC можно было использовать для ультраструктурного исследования (пациент № 4). Электронная микроскопия этого образца выявила как внутриядерные, так и внутрицитоплазматические вирусные частицы. Вирусные частицы окрашивали продуктами реакции электролюминесценции и измеряли приблизительно 50 нм, будучи совместимыми с вирусными полиомами. Была показана ядерная локализация свободных вирусных частиц, проникновение через ядерную мембрану и внутрицитоплазматическое накопление капсидов (рис. 1).
а) разрушенная клетка карциномы клеток меркель с вирусными частицами (белая стрелка) размером 50 нм, смешанная с ядерными фрагментами и несколькими меньшими рибосомами (20 нм). б) проникновение вирионов через ядерную мембрану (белые стрелки) в сторону цитоплазмы (слева). (оригинальное увеличение, 12000 ×).
У пациентов с SCLC средний возраст составил 59 лет, а у 50% мужчин. Десять образцов SCLC тестировали на MCPyV-ДНК с использованием набора праймеров LT3 и всего тестируемого отрицательного.
Контрольные пациенты имели средний возраст 56 лет, а 50% — мужчины. Из восьми образцов контрольной ткани у разных пациентов ни один из них не был выявлен положительным методом ПЦР MCPyV-DNA.
В этом исследовании мы показываем, что только мелкие клеточные нейроэндокринные карциномы кожи, а не легких содержат MCPyV-ДНК. Это говорит о том, что MCPyV имеет ограниченный тропизм. MCPyV-ДНК была обнаружена в первичной и метастатической опухолях у одного пациента, что свидетельствует о интеграции вирусной ДНК. Ультраструктурная идентификация вирусных частиц MCVyP в первичной цитоплазме опухолевых клеток MCC и ядра у другого пациента предполагает активную репликацию вируса.
В нашей небольшой группе пациентов мы обнаружили, что у MCCyV-ДНК у 40% пациентов с MCC-вирусом, что более или менее похоже на данные, представленные в предыдущих исследованиях (43-85%) [6], [11] — [13]. Поскольку вирусная ДНК, по-видимому, может интегрироваться в геном хозяина, о чем свидетельствует Фэн и др. и предложенный нами, основанный на нашем нахождении положительного метастаза MCPyV у одного пациента, причинно-следственная связь между инфекцией MCPyV и развитием MCC является реалистичной. Однако до сих пор, в среднем, только половина исследуемых популяций пациентов MCC была положительной MCPyV-ДНК. MCPyV является членом группы полиомавирусов, принадлежащей к семейству Papovaviridae. Другим членом этого семейства являются папилломавирусы, и некоторые интригующие сходства между папилломавирусами человека (HPV) и MCPyV могут объяснить относительно низкую распространенность MCPyV в MCC.
Прежде всего доказана причинно-следственная связь между ВПЧ и развитием рака шейки матки [20], и интеграция ДНК ВПЧ в геном хозяина является основной чертой онкогенеза. Параллельно с нашей демонстрацией MCPyV-ДНК в метастазах MCC, HPV-ДНК была обнаружена и в метастазах ВПЧ-положительных инвазивных цервикальных карцином [21]. Кроме того, около 60% рака шейки матки являются положительными для ВПЧ 16, остальные раковые заболевания вызваны широким разнообразием по меньшей мере 12 других генотипов ВПЧ [22]. В соответствии с цервикальной карциномой, MCCs, которые испытывали отрицательный результат для MCPyV, могут быть вызваны другими, но неопознанными генотипами MCPyV, которые не были обнаружены конкретным набором праймеров, используемым в исследованиях. Это может также объяснить гораздо большую долю MCPyV-положительных опухолей MCC у североамериканских пациентов (43%) по сравнению с австралийскими пациентами (24%) [12].
С другой стороны, это различие также может быть связано с более высоким воздействием солнца у австралийского населения. Воздействие на Солнце является этиологическим фактором в MCC, о чем свидетельствует обнаружение мутаций, связанных с УФ-излучением, например, TP53 в MCC, и клиническая ассоциация MCC с другими неметаномическими раковыми заболеваниями [23], [24].
Диапазон от 40 до 85% в MCPyV-положительном MCC также может быть объяснен наличием двух разных, но параллельных онкогенных путей, одного связанного с MCPyV и одного MCPyV несвязанного пути. Предложена аналогичная теория двух отдельных путей, ведущих к карциноме вульвы, с участием вирусов папилломы человека, связанных с полиомавирусами.
Во-первых, зависимый от вируса папилломавирус (ВПЧ) путь, в котором предраковые стадии рака вульвы являются классическими поражениями внутриэпителиальной неоплазии вульвы (VIN). Во-вторых, независимый от ВПЧ путь, связанный с дифференцированными поражениями VIN III и / или склерозом лишайников [25].
В SCLC, хотя морфологически почти неотличимы от MCC, состоящие из небольших клеток с нейроэндокринными признаками и оба проявляющие агрессивное поведение, MCPyV-ДНК не может быть обнаружена. Однако, хотя маловероятно, возможность неизвестных штаммов MCPyV, связанных с SCLC, не может быть полностью исключена.
Мы первыми продемонстрировали фактическое присутствие MCPyV в ядрах опухолевых клеток MCC и цитоплазмы морфологически с помощью электронной микроскопии. Обнаружение множественных частиц, как в цитоплазме, так и в ядрах, предполагает активную репликацию вируса. Он демонстрирует, что вирусные частицы MCPyV присутствуют в опухолевых клетках MCC. К сожалению, из-за фиксации обработанных материалов электронная микроскопия может быть выполнена только на одном первичном МКЦ в нашем исследовании.
В заключение мы обнаружили MCPyV-ДНК в 40% MCC и метастазировании одного пациента. MCPyV был обнаружен как в интегрированной форме, так и в виде вирусных частиц, о чем свидетельствует электронная микроскопия у другого пациента. В морфологическом сходном SCLC не удалось обнаружить MCPyV-ДНК, которая либо предполагает другой онкогенный путь, либо существование еще неидентифицированных генотипов MCPyV. Когда демонстрируются трансформирующие и иммортализующие свойства MCPyV, это в конечном итоге докажет свою канцерогенную природу у людей.
Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Финансирование: авторы не имеют поддержки или финансирования для отчета.
| клетка полиомавирусов Меркель | |
|---|---|
| классификация Вирус | |
| Группа: | |
