Вирус инфекционного бронхита кур вирусология

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

БОЧКОВ Юрий Александрович

МЕТОД ШТАММОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР И АНАЛИЗ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель-кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ДРЫГИН Владимир Викторович

Научный консультант-кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник БОРИСОВ Александр Владимирович Владимир -1999

а.о. - аминокислотный остаток

ВИБК - вирус инфекционного бронхита кур

ГМ - гепатит мышей

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ИБК - инфекционный бронхит кур

ИФА - иммуноферментный анализ

кДНК - ДНК-копия с РНК-матрицы

КЭ - куриный эмбрион

МАТ - моноклональные антитела

мРНК - матричная РНК

н.о. - нуклеотидное основание

ОРС - открытая рамка считывания

ПААГ - полиакриламидный гель

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РДП - реакция диффузионной преципитации

РИФ - реакция иммунофлюоресценции

РН - реакция нейтрализации

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РЗГА - реакция задержки гемагглютинации

Трис - Трис (гидроксиметил) аминометан

ТГС - трансмиссивный гастроэнтерит свиней

ШЭР - шероховатый эндоплазматический ретикулум

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭИД50 - доза вируса, вызывающая гибель 50% инфицированных эмбрионов HVR - hyper-variable region - гипервариабельная область dNTP - дезоксирибонуклеотидтрифосфат

SPF - specific pathogen free -свободный от специфических патогенов

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ. 10

2.1. Патогенез и эпизоотология инфекционного бронхита кур. 10

2.2. Классификация возбудителя. 14

2.3. Репликация вируса инфекционного бронхита кур. 18

2.4. Антигенная вариабельность вируса инфекционного

бронхита кур. 28

2.5. Изучение иммуногенных свойств пепломерного белка Б. 32

2.6. Диагностика инфекционного бронхита кур. 38

З.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. 46

3.1. Материалы. 46

3.3. Результаты собственных исследований и их обсуждение. 54

3.3.1. Разработка стратегии штаммовой дифференциации вируса ИБК с использованием молекулярно-биологических методов. 54

3.3.2. Индикация генома вируса ИБК методом ОТ-ПЦР. 56

3.3.2.1. Очистка и концентрирование вируса ИБК. 56

3.3.2.2. Разработка метода выделения РНК вируса ИБК и суммарной РНК из различных вируссодержащих материалов. 60

3.3.2.3. Индикация генома вируса ИБК с помощью амплификации фрагмента кДНК консервативной нетранслируемой области (З'-иТЯ) методом ПЦР. 62

3.3.3. Исследование профиля вариабельности гена вируса ИБК

и теоретический расчет праймеров для штаммовой дифференциации. 68

3.3.4. Амплификация кДНК вариабельной области гена методом ПЦР. 72

3.3.5. Секвенирование вариабельной области гена . 73

3.3.6. Анализ генетической вариабельности вируса ИБК. 75

3.3.7. Определение и сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена изолятов вируса ИБК, выделенных на птицефабриках России в 1997-1998 гг. 80

3.3.7.1. Сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена и белка Б1 изолятов, близких к Массачусеттской генетической

3.3.7.2. Сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена и белка "вариантных" изолятов, имеющих низкий уровень генетической гомологии со всеми зарубежными штаммами

6.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 106

7.ПРИЛОЖЕНИ Я. 128

Инфекционный бронхит кур (ИБК) - острое высококонтагиозное заболевание, поражающее кур различного возраста, возбудителем которого является вирус, принадлежащий к роду Coronavirus, семейства Coronaviridae. В зависимости от штамма, вызвавшего инфекцию, могут поражаться респираторные органы, почки, а также герминативные органы и кишечник кур. Инфекционный бронхит регистрируется в птицеводческих хозяйствах мясного и яичного направления.

По данным серологических исследований наличие ИБК в настоящее время подтверждают практически во всех обследованных птицехозяйствах России, а также в странах СНГ, что указывает на широкое распространение инфекции.

В птицеводческих хозяйствах, неблагополучных по ИБК, отход молодняка составляет, в среднем, 18-20%, но при первичной циркуляции в хозяйстве вируса с нефрогенной тропностью смертность птицы может увеличиваться до 57-70% [8]. Вынужденная выбраковка цыплят в хозяйствах, где отмечают ассоциированное течение ИБК с вторичными инфекциями может достигать 40-60% среди цыплят 1-5 месячного возраста.

Проявление ИБК часто маскируется другими болезнями вирусной и бактериальной природы, а также физиологическими нарушениями. Даже при типичном течении постановка диагноза на ИБК по клиническим и па-тологоанатомическим признакам является затруднительной. Кроме того, в крупных птицехозяйствах ИБК может иметь стационарный характер и протекать как хроническая инфекция без ярко выраженных симптомов поражения респираторных органов.

Система лабораторной диагностики ИБК включает в себя выделение вируса на куриных эмбрионах, постановку биопробы на восприимчивых цыплятах, идентификацию выделенного вируса в РН, РИФ и РТГА, выявление антител в сыворотках крови в РН, РТГА и ИФА, а также обнаружение гистологических изменений в органах и тканях.

Вирус ИБК отличается очень высокой генетической изменчивостью, которая обуславливает его антигенную вариабельность. По имеющимся к настоящему времени данным в мире известно более 30 серотипов вируса ИБК, причем перекрестная защита между штаммами разных серотипов практически отсутствует. Эффективность профилактических мероприятий при ИБК во многом обусловлена правильным выбором вакцинного штамма. В нашей стране в 1970-1980 гг. выделяли изоляты вируса ИБК, антиген-но родственные серотипам Массачусеттс и Коннектикут [6, 9], а в последнее время дигностика этого заболевания сводилась, в основном, к исследованию сывороток крови от больной птицы в ИФА и РЗГА. Таким образом, спектр штаммов, циркулирующих сейчас в России, оставался неизвестным. Постоянное появление новых антигенных вариантов вируса ИБК в разных странах мира, в том числе штаммов, способных вызывать заболевание у вакцинированной птицы, определяет актуальность работы и необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых, более эффективных средств индикации и идентификации вируса и профилактики ИБК.

Основными критериями при совершенствовании и разработке методов диагностики ИБК является их высокая чувствительность, специфичность, быстрота проведения анализа, а также возможность не только выявлять, но и идентифицировать вирус.

В последнее время метод ПЦР, основанный на энзиматической амплификации части вирусного генома с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и специфичных праймеров, стал успешно использоваться в диагностике многих инфекционных заболеваний. ПЦР обладает высокой специфичностью и чувствительностью, что позволяет выявлять даже фрагменты вирусного генома. Определение и сравнительный анализ первичной структуры кДНК фрагментов генома, характеризующихся высокой вариабельностью, позволяет наиболее точно установить штаммовую принадлежность вируса.

Метод ОТ-ПЦР для диагностики ИБК был впервые применен Lin и соавт. в 1991 году [114] и в настоящее время используется многими лабораториями в разных странах. Основными недостатками предложенных ранее методов при индикации вирусного генома являются необходимость культи-

вирования полевых изолятов вируса в куриных эмбрионах, а при штаммо-вой дифференциации - анализ консервативных областей генома, что снижает информативность метода. Имеющиеся к настоящему времени данные о первичной структуре различных областей генома вируса ИБК позволяют разработать оптимальную тест-систему не только для индикации, но и для штаммовой дифференциации вируса. Цель и задачи исследования

Основная цель данных исследований заключалась в разработке метода индикации и штаммовой дифференциации вируса ИБК и изучении моле-кулярно-биологическими методами генетических взаимоотношений штаммов вируса ИБК.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать метод индикации генома вируса ИБК в различных вируссо-держащих материалах на основе ОТ-ПЦР;

- разработать метод идентификации вируса ИБК на основе нуклеотидного секвенирования вариабельной области гена Б1, позволяющий определять штаммовую принадлежность вируса;

- провести анализ нуклеотидной последовательности вариабельной области гена 81 полевых изолятов вируса ИБК, выделенных в России и вакцинных штаммов вируса ИБК;

- сравнить первичные структуры вариабельной области гена полевых изолятов и зарубежных штаммов вируса ИБК.

Научная новизна исследования

Впервые определена нуклеотидная последовательность вариабельной области гена 21 изолята вируса ИБК, выделенного на территории России в течение 1997-1998 гг., а также 10 отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Выявлены и дифференцированы генетические группы штаммов вируса ИБК.

Создан банк данных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей вариабельной области гена Б1 вируса ИБК.

Практическая значимость исследования

Разработаны метод очистки и концентрирования вируса ИБК и метод выделения вирусной РНК, позволяющие получать из аллантоисной жидкости РКЭ, инфицированных вирусом ИБК штаммом НПО препараты с концентрацией вирусного белка 0,5-1,5 мг/мл и, соответственно, около 0,3 мг вирусной РНК.

Разработан метод индикации вируса ИБК на основе ОТ-ПЦР с прай-мерами на консервативную область З'-ИТЯ, позволяющий выявлять геном возбудителя в различных вируссодержащих материалах без выделения вируса в куриных эмбрионах в течение 4-6 часов.

Разработан метод прямого секвенирования амплифицированных в ПЦР фрагментов кДНК, позволяющий в течение 2-3 дней определять первичную структуру вариабельной области гена 81, и в результате сравнительного анализа с использованием созданного банка данных, проводить штаммовую дифференциацию новых изолятов вируса ИБК.

С помощью разработанного метода проведена идентификация 21 изолята ВИБК, выделенного на территории России в 1997-1998 гг., а также 10 отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Разработанные методы индикации генома и штаммовой дифференциации вируса ИБК одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ, а также Департаментом ветеринарии МСХиП РФ и в настоящее время используются для индикации генома и штаммовой дифференциации изолятов вируса ИБК, выделяемых на территории России и стран СНГ. Публикация научных исследований

По теме научных исследований опубликовано 5 научных работ. Апробация работы

Основные материалы диссертации были доложены на научно-практической конференции "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных" ВНИИЗЖ, г. Владимир (1997 г.), научной конференции "Современные аспекты ветеринарной патологии животных" г. Владимир (1998 г.) и II Всероссийской конференции "ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" г. Москва (1998 г.).

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 127 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Список литературы включает 188 источников. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 5 таблицами.

Основные положения, выносимые на защиту

-метод очистки и концентрирования вируса ИБК и метод выделения вирусной РНК;

-метод индикации генома вируса ИБК, основанный на амплификации в ПЦР фрагмента консервативной области З'-ИТЯ;

-метод штаммовой дифференциации вируса ИБК, основанный на определении первичной структуры амплифицированных в ПЦР фрагментов кДНК вариабельной области гена и сравнительном анализе с опубликованными последовательностями других штаммов;

- первичная структура вариабельной области гена 81, изолятов вируса ИБК, выделенных на территории России в 1997-1998 гг., а также отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1995-1998 г.г. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ, г. Владимир).

Автор выражает искреннюю благодарность к.б.н. П.К. Аяноту, В.А. Лобанову, к.в.н. В.В. Борисову, Т.Н. Быковой, к.б.н. О.Г. Грибанову, Ю.В. Зинковскому, к.б.н. С.Н. Колосову, к.х.н. А.И. Ломакину, к.б.н. Н.С. Мудрак, д.б.н. H.A. Перевозчиковой, к.б.н. Г.М. Фалиной, к.б.н. A.B. Щербакову, к.б.н. Л.О. Щербаковой - за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы, д.в.н. В.Л. Узюмову - за ценные замечания при обсуждении работы.

2.1 Патогенез и эпизоотология инфекционного бронхита кур

Инфекционный бронхит впервые был описан в США в Северной Дакоте в 1931 году Schalk и Hawn, как неизвестное ранее заболевание дыхательной системы цыплят, сопровождающееся высокой летальностью [148]. В дальнейшем болезнь была установлена и у взрослых кур. Заболевание широко распространено практически во всех странах с развитым промышленным птицеводством и наносит значительный экономический ущерб. Экономические потери при инфекционном бронхите кур складываются, в основном, из снижения яичной и мясной продуктивности, вынужденной выбраковки заболевшей птицы, высокой летальности молодняка до 30-дневного возраста и повышения чувствительности к другим заболеваниям.

В птичниках, неблагополучных по ИБК, отход молодняка составляет в среднем 18-20% [5], при первичной циркуляции в хозяйстве вируса с неф-рогенной тропностъю летальность птицы может достигать 57-70% [8]. По различным данным, снижение яйценоскости у кур-несушек колеблется от 2,4 до 85%. В случае осложнения инфекционного бронхита другими инфекционными заболеваниями болезнь протекает в более тяжелой форме и яйценоскость переболевших кур-несушек никогда не достигает первоначального уровня. В крупных птицехозяйствах ИБК часто имеет стационарный характер и протекает как хроническая инфекция без ярко выраженных симптомов поражения респираторных органов.

Инфекционный бронхит кур, ослабляя организм птицы, создает благоприятный фон для развития вторичных инфекций. В случае ассоциированного течения ИБК с колибактериозом или микоплазмозом воспалительные процессы в респираторных органах наблюдаются более длительный срок, что увеличивает экономический ущерб хозяйства [154]. При одновременном течении ИБК и пуллороза (возбудитель-Salmonella pullorum-gallinarum) клинические признаки обоих заболеваний более ярко выражены, падеж сравнительно выше, ИБК обостряет латентную форму пуллороза [7]. Вынужденная выбраковка цыплят в хозяйствах, где отмечают ассоцииро-

ванное течение ИБК с вторичными инфекциями может достигать 40-60% среди цыплят 1-5 месячного возраста [4]. Инфекционный бронхит может протекать в комплексе с другими вирусными инфекциями, такими как ла-ринготрахеит и аденовирусная инфекция. Сочетание воздействия холодом и заражения Mycoplasma synoviae через 5 дней после заражения вирусом ИБК вызывало аэросаккулит, который отличался по контагиозности и остроте протекания от заболевания, вызванного одним штаммом вируса ИБК [85]. Комбинированное интраназальное заражение различными штаммами вируса ИБК и Escherichia coli вызывало высокую смертность у молодых цыплят, причем инфицирование этими возбудителями отдельно не приводило к их гибели [58].

Инфекционный бронхит поражает кур и цыплят всех возрастов. Наиболее остро заболевание протекает у цыплят до 30-дневного возраста, вызывая высокую смертность. Чувствительность к этому заболеванию отличается у различных пород домашних кур [62, 140]. Вирус ИБК был выделен также от фазанов,

Инфекционный бронхит (ИБ) — высококонтагиозная болезнь, проявляющаяся у цыплят респираторным и уремическим синдромом, а у кур — поражением герминативных органов и снижением яйценоскости.

Заболевание распространено во всех странах с развитым промышленным птицеводством. Наносит огромный экономический ущерб, заключающийся в снижении мясной и яичной продуктивности на 50—60 %, гибели цыплят первого месяца жизни до 30 %, выбраковке до 60 % птицы при хроническом течении болезни с осложнениями бактериальными инфекциями.

В естественных условиях восприимчивы куры всех возрастных групп; наиболее подвержены заболеванию цыплята до 30-дневного возраста. Человек переболевает с легкими признаками поражения верхних дыхательных путей.

Характеристика возбудителя. Возбудитель ИБ — РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Coronaviridae. Вирионы его изометрической формы, размером 70—120 нм, заключены в суперкапсидную оболочку с редкими булавовидными выступами, напоминающими солнечную корону.

Все штаммы вируса ИБ очень чувствительны к УФ-облучению, в течение трех минут обезвреживаются 1%-ными растворами фенола, крезола, формалина, 70%-ным раствором этилового спирта. В аллантоисной жидкости при минус 25 °С сохраняют активность до 537 дней.

Антигенная вариабельность. Вирусу присуща значительная антигенная вариабельность. Определены 7 серотипов. Выделенные в нашей стране штаммы относятся к серотипам Массачусетс и Коннектикут. Выделение полевых изолятов, отличающихся по антигенному составу от этих серотипов, вынуждает вести работу по созданию новой вакцины.

Антигенная структура. Белки вируса различаются по тканевому тропизму. Патогенность штаммов вируса связана с изоэлектрическими точками их белков. Классификация белков на основе изоэлектрических точек позволяет идентифицировать высокопатогенные и персистентные штаммы. На поверхности вируса обнаружено пять агглютининов: А, В, С, D, Е, из которых первые четыре ответственны за нейтрализацию вируса.

Из 16 моноклональных антител все реагировали с белками пепломеров, а один тип антител нейтрализовал инфекционность и подавлял гемагглютинирующую активность вируса.

Антигенная активность. Переболевание птицы сопровождается образованием антигемагглютинирующих, вируснейтрализующих антител и практически пожизненным иммунитетом к гомологичному типу вируса. У кур-реконвалисцентов вируснейтрализующие антитела обнаруживались 482 дня. Преципитирующие антитела появлялись в сыворотке крови через 2—3 нед, но исчезали раньше, чем вируснейтрализующие антитела. В крови кур-реконвалисцентов найдены комплементсвязывающие антитела.

Гемагглютинирующая активность. У большинства штаммов вируса ИБ она не наблюдается. Штамм Коннектикут способен агглютинировать эритроциты кур, штамм же Массачусетс проявляет такую активность только после обработки трипсином или фосфолипазой С.

Клинические признаки. Отмечают три клинических синдрома болезни: респираторный, нефрозо-нефритный и репродуктивный.

Респираторный синдром проявляется чаще у цыплят до 1-месячного возраста и характеризуется кашлем, трахеальными хрипами, носовыми истечениями, затрудненным дыханием, конъюнктивитом, синуситом и высокой летальностью. У цыплят 1—2-месячного возраста болезнь протекает хронически с колибактериозом и микоплазмозом.

Нефрозо-нефритный синдром наблюдают у цыплят до 2-недельного возраста при заражении их нефротропными штаммами вируса. Появляется диарея, гибнет до 70 % цыплят.

Репродуктивный синдром регистрируют обычно у кур старше 6 мес; характеризуется резким снижением яйценоскости, неправильной формой скорлупы яиц. У 20—25 % кур-несушек, переболевших ИБ в раннем возрасте, отмечают недоразвитость яйцевых фолликул.

Патологоанатомические изменения. При вскрытии обнаруживают серозный катаральный и казеозный экссудат в трахее и бронхах (при респираторном синдроме), поражение почек и мочеточников (при нефрозо-нефритном синдроме), недоразвитость яйцевых фолликулов (при репродуктивном синдроме).

Локализация вируса. В первые две недели болезни вирус адсорбируется на клетках слизистых оболочек респираторного тракта и размножается в них. Развитие инфекционного процесса сопровождается виремией с локализацией вируса в лейкоцитах и эритроцитах в течение нескольких недель после заражения. С кровью вирус попадает в почки, легкие, яичники и яйцеводы, в клетках которых размножается и вызывает патологический процесс. Удается обнаружить его также в селезенке (до 49 дней), в почках (до 35 дней), в клоаке (до 45 дней).

Выделяется вирус с истечениями из глаз и носа, а также с фекалиями, у петухов — со спермой в течение 20 дней после заражения. С содержимым яиц от больных кур вирус выделяется до 6 недель после их заражения.

Источник инфекции. Основной источник инфекции — больные и переболевшие цыплята и куры. Выздоровевшие птицы остаются вирусоносителями, а хозяйство ряд лет считается неблагополучным по заболеванию. Вирус передается аэрогенно, алиментарно, прямым и непрямым контактом, а также трансовариально.

Диагностика. Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков болезни, патологоанатомических изменений и лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика. Патологическим материалом для лабораторных исследований служат смывы с гортани, трахеи от больных птиц и соскобы от трупов, кусочки легких, почек, а от взрослой птицы — почки и яйцеводы.

Обнаружение вирусной нуклеиновой кислоты в патологическом материале проводят с помощью ПЦР. Антиген вируса можно быстро обнаружить в РДП и РИФ. Использование в РИФ группоспецифических моноклональных антител или гипериммунной сыворотки позволяет сразу же провести серотипизацию.

Активный вирус ИБ обнаруживают биопробой. Наиболее результативно проведение ее на цыплятах 10—25-дневного возраста из хозяйств, благополучных по респираторным болезням. Суспензией, полученной из патологического материала, заражают цыплят интратрахеально и через 1—5 дней наблюдают появление респираторных симптомов и патологоанатомических изменений, характерных для ИБ.

Идентификация. Материал, полученный в результате биопробы, содержит вирус, который необходимо идентифицировать в РДП, PHГА и РИФ, а типовую принадлежность определяют в PH на куриных эмбрионах и в РТГА.

Быстрее поставить диагноз позволяют серологические исследования.

Серодиагностика основана на выявлении у больных и переболевших птиц антител в PH, РНГА и ИФА. Причем если PH определяет накопление антител в организме в период с 10-го по 36-й день болезни, то РНГА — со 2-го по 14-й день, ИФА — с 3-го дня.

Установлено, что серологические данные не позволяют судить о резистентности конкретного поголовья птиц к заражению вирусом ИБ, так как не всегда уровень антител коррелирует с резистентностью. В последнем случае важную роль играет местный тканевый иммунитет респираторного трахеита.

Дифференциальная диагностика. Следует учитывать, что ИБ сходен с инфекционным ларинготрахеитом, ньюкаслской болезнью и гриппом птиц. Дифференциальную диагностику этих заболеваний проводят лабораторными методами.

Иммунитет и специфическая профилактика. Переболевшая птица резистентна к заражению гомологичным штаммом вируса в течение 3—6 мес. Трудность обеспечения специфической профилактики инфекционного бронхита кур обусловлена большой антигенной и иммунологической вариабельностью полевых штаммов вируса.

Для профилактики инфекции применяют как живые, так и инактивированные вакцины. Материнские антитела от иммунных кур-несушек передаются через яйцо цыплятам и защищают их в первые 2—4 нед жизни. Наиболее выраженный иммунный ответ получен при вакцинации в 3—4-недельном возрасте живой вакциной, а в 16-недельном — инактивированной. Учитывая факт образования местного тканевого иммунитета в респираторном тракте, живые вакцины применяют орально (с питьевой водой) или путем закапывания в нос.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Батченко Галина Владимировна. Выделение, идентификация и характеристика изолятов вирусов инфекционного бронхита кур и инфекционного ларинготрахеита птиц : Дис. . канд. биол. наук : 03.00.06 : Владимир, 2004 156 c. РГБ ОД, 61:05-3/509

Введение к работе

Актуальность темы. В связи с постоянной интенсификацией промышленного птицеводства, выведением новых высокопродуктивных пород птицы, расширением международных экономических связей, включающих закупку племенной птицы за рубежом, на территории нашей страны регистрируются новые инфекционные болезни домашней птицы. Кроме того, появляются вариантные изоляты уже известных вирусов, способные вызывать заболевания даже у вакцинированной птицы. Поэтому постоянный мониторинг таких экономически значимых заболеваний, как инфекционный бронхит кур и инфекционный ларинготрахеит птиц, позволяет контролировать их распространение и обеспечивать эффективность профилактических мероприятий. Большое значение при этом имеют выделение изолятов вирусов и изучение их биологических свойств, в частности, для создания новых вакцин.

Инфекционный бронхит кур (ИБК) - высококонтагиозное заболевание, которое поражает птиц различного возраста в хозяйствах мясного и яичного направления и широко распространено во многих странах. Возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус ceu.Coronaviridae, рода Coronavirus. При развитии заболевания норажакмея респираторные органы, почки, а также рснродукіивньїе органы и кишечник кур. Экономические потери связаны со снижением прироста массы тела у цыплят-бройлеров, снижением яичной продуктивности, ухудшением качества яиц у несушек и родительского поголовья кур.

Вирус ИБК исключительно разнообразен и имеет большое количество серотипов и вариантов (Сюрин В.Н.,1998, Garcia М., 2001, Liu S., 2004, Picault J.P., 1986, Schikora В.М., 2003, Wang C.H., 2000, Zanella A., 2003). Причиной такого антигенного многообразия вируса ИБК является его чрезвычайно высокая изменчивость. Антигенные различия между вирусами возникают в результате спонтанных мутаций в определенных участках структурных генов, кодирующих иммунодоминантные области. Известно большое количество серотипов вируса (по разным данным от 20 до 30), при этом иммунитет, приобретенный к одному серотипу, не дает перекрестной защиты от заражения другим серотипом, что значительно осложняет профилактику ИБК.

—миотии |

В результате исследования патологических материалов, полученных из птицехозяйств в 1999-2004 гг., методами ПЦР и секвенирования было выявлено и типировано 57 изолятов вируса ИБК. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что спектр вирусов ИБК, циркулирующих в настоящее время в России, очень разнообразен. Наряду с изолятами группы Массачусетс, выявляемыми ранее (41%), и изолятами европейского происхождения (13%), широко распространены эндемичные для России вариантные изоляты (46%) (Борисов А.В , 2002).

Постоянное выявление и изучение новых изолятов вируса ИБК, а также широкий генетический спектр уже выявленных, указывают на необходимость изучения их иммуно-биологических свойств, получения на их основе живых и ннактивированных вакцин, а также мониторинга за данным заболеванием с использованием всех имеющихся диагностических методов исследований, что свидетельствует об актуальности работы.

Инфекционный ларинготрахеит птиц (ИЛТ) - контагиозная вирусная болезнь кур. индеек, цесарок, фазанов, характеризующаяся поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и глаз. Заболевание вызывается вирусом ИЛТ, относящимся к сем. Herpesviridae, подсемейству a-Herpesviruses. В естественных условиях к инфекционному ларинготрахеиту восприимчивы куры всех возрастных гр\пп. Вирус поражает кур-несушек, материнское поголовье, бройлеров. В настоящее время ИЛТ встречается повсеместно во всех странах мира (Бабкин В.Ф., 1986, Timurkaan N.. 2003, Vander Кор М.,1993, Wieliczko А., 2004).

Источником возбудителя при инфекционном ларинготрахеите являются больные, переболевшие, а также птицы с бессимптомным течением ИЛТ. После лсреболевания ИЛТ у кур наблюдается длительное вирусносительство - до двух лет и более. После острой фазы инфекции может наступить латентный период с сохранением^ генетическвго- -материала вируса в ДНК нейроцитов ганглия тройничного Hepga,.gt Выделение, идентификация и характеристика изолятов вирусов инфекционного бронхита кур и инфекционного ларинготрахеита птиц

Грипп птиц ( Avian influenza Viruses ). Синонимы: тиф кур, брауншвейгская болезнь, классическая чума птиц.

Грипп птиц — острая септическая болезнь, вызываемая вирусом. Для нее характерны высокая инфекционность, большая смертность среди кур, индеек и домашней птицы других видов, характеризующаяся угнетением, отеками, поражением органов дыхания, пищеварения.

Особое значение грипп птиц приобрел в настоящее время, в связи с распространением в конце 2003 г. в 10 странах Юго-Восточной Азии высокопатогенного ВПГ H 5 N 1. Весной 2003 г. крупные вспышки высокопатогенного гриппа птиц H 7 N 7 произошли в Западной Европе.

Эпизоотическая ситуация по гриппу птиц в мире. Согласно отчетам МЭБ, в мире очень мало стран, где не был бы зарегистрирован грипп птиц. В последние годы вспышки гриппа птиц периодически возникали в Африке (Сенегал — 1993 г.), Америке (Мексика — 1995 г., США — 1984-2003 г., Чили — 2002 г., Гватемала — 2000 г., Сальвадор — 2001 г.), Азии (Пакистан — 2000 г., Киргизстан, Лаос — 1999 г., Ливан, Мьянма, Непал, Туркменистан — 1996 г.), Европе (Италия — 2000 г., Армения — 1985 г., Турция, Великобритания — 1992 г., Нидерланды, Бельгия, Германия — 2003 г.), Океании (Австралия — 1997 г.).

Наибольшее распространение грипп птиц получил на территории США. Первые вспышки были отмечены в 1983-1985 гг. в мелких птицехозяйствах и на рынках, где торговали живой птицей.

Эпизоотия началась в Пенсильвании в апреле 1983 г. Слабопатогенный вначале штамм H5 N2, вызывавший легкое переболевание цыплят с респираторными признаками, снижение яйценоскости и незначительную смертность в пределах 0-15%, активно мутировал и уже к октябрю 1983 г. был охарактеризован как высокопатогенный. Несмотря на принимаемые меры, осуществить полный контроль за распространением заболевания не удалось. В июле 1983 г. началась новая волна заболевания в Вирджинии. В итоге пало 17 млн голов птиц, а экономический ущерб составил 60 млн долларов.

В 1986 г. вирус H 5 N 2 вновь появился в пяти северо-восточных штатах США. Исследования показали, что куры в 26 из 44 рынков, торгующих живой птицей в Нью-Йорке, и в 12 из 26 в Нью-Джерси были инфицированы ГП H 5 N 2.

По результатам вирусологических и серологических исследований варианты возбудителя гриппа птиц, содержащие 11 из 15 известных гемагглютининов (Н1-7, 9-11, 13) и 8 из 9 известных нейраминидаз, были выделены в 24 штатах США (D . J . Alexander , 2002).

С 1994 г. в этой стране стали распространяться новые разновидности вируса гриппа, вызываемые вначале умеренно патогенными штаммами, а затем высокопатогенными с антигенной формулой H 7 N 2, иногда H 7 N 3. При обследовании 110 упомянутых рынков в Нью-Йорке и Нью-Джерси в 70% случаев был найден вирус ГП, особенно там, где вместе с курами продавали уток и кроликов.

В штате Вирджиния было уничтожено или утилизировано (сжигали, закапывали, компостировали) 4,5 млн голов птиц. Инфекция распространялась посредством транспорта и людей, содержащих в домашнем хозяйстве птицу. В Калифорнии в 2000-2001 гг. была вспышка гриппа у индюков, вызванная штаммом H6 N2, которая не сопровождалась массовой гибелью, но характеризовалась респираторными расстройствами и снижением продуктивности. В общей сложности, в 8 штатах США было выявлено 195 неблагополучных ферм. Последняя вспышка гриппа в США была зарегистрирована 02.07.02 г.

Возбудитель болезни. Возбудитель болезни — вирус семейства Orthomyxoviridae типа А. Вирионы полиморфные, размером 80-120 нм, представлены двумя антигенными комплексами. Наружный V -антиген состоит из гемагглютинина Н и фермента нейраминидазы N. Внутренний S -антиген включен в ядро вируса и определяет типовую принадлежность.

По степени вирулентности различают 4 группы возбудителей: высоко-, средне-, низко- и апатогенные, хотя это деление считают условным, поскольку штаммы часто мутируют, как правило, в сторону усиления патогенности.

На основе антигенных особенностей строения наружного антигена, все известные штаммы вируса гриппа птиц разделены на 15 подтипов по гемагглютинину и на 9 — по нейраминидазе. Наиболее вирулентными считаются возбудители, имеющие 5-й или 7-й подтип гемагглютинина (Н5, Н7).

РНК вируса состоит из 8 сегментов, что способствует быстрому изменению антигенного состава путем генетических рекомбинаций, часто возникающих при одновременном циркулировании в организме возбудителей гриппа различного происхождения.

Вирус хорошо редуцируется в эмбрионах кур, обладает широким спектром гемагглютинации.

Формальдегид, надуксусная кислота (в 0,5-1,0%-ной концентрации), гипохлорид натрия, 1-3%-ные растворы едкой щелочи надежно инактивируют возбудитель при экспозиции 1-6 ч.
Эпизоотологические данные. Грипп зарегистрирован среди всех домашних и многих видов диких птиц. Доказана широкая циркуляция вируса гриппа человека в популяции птиц. Межконтинентальный перенос вируса гриппа осуществляют пернатые дикой фауны, являющиеся природным резервуаром возбудителя инфекции. Межхозяйственная передача возможна горизонтальным и вертикальным путями. Внутри хозяйства вирус передается с помощью обслуживающего персонала, грызунов, кошек, синантропной и дикой птицы. Однако основными путями распространения возбудителя являются аэрогенный и алиментарный.

Наиболее опасным источником инфекции считают переболевшую птицу, которая является вирусоносителем не менее 2 месяцев. Вирус сохраняется в организме реконвалесцентов в присутствии антител, формируя латентную инфекцию, и под воздействием экстремальных условий может легко активизироваться и длительно выделяться во внешнюю среду. Поэтому вспышки гриппа чаще всего возникают после стрессовых состояний (отравление, охлаждение, водное голодание и др.). Пассирование вируса через ослабленный организм повышает его вирулентность и способствует последующему заболеванию птицы, содержащейся в нормальных условиях.

Заболеваемость птицы гриппом варьируется от 80 до 100%, смертность — от 10 до 90%, что зависит от степени вирулентности штаммов и условий содержания восприимчивого поголовья.

Патогенез. В зависимости от вирулентности, тропизма вируса, естественной резистентности птицы развивается генерализованная или респираторная форма болезни.

После попадания вируса на слизистые оболочки дыхательных путей происходит его активное размножение и проникновение в кровеносную систему. На это уходит от 4 до 12 ч. Вирус в большом количестве содержится на оболочке и внутри эритроцита, а также в сыворотке крови. Развитие болезни происходит в 4 фазы: активное размножение вируса и накопление его в паренхиматозных органах, виремия — в этой фазе вирус удается обнаружить в крови, затем происходит начало образования антител, что указывает на прекращение дальнейшего редуцирования вируса. Последняя стадия характеризуется активным образованием антител и иммунитетом.

Ввиду того, что вирус выделяет токсические продукты в стадии виремии, происходит интоксикация и гибель птицы. Обычно это наблюдается при остром течении ГП. Под острое и хроническое течение растягивается на 10-25 дней, исход зависит от резистентности организма.

Все наиболее вирулентные штаммы вируса, независимо от принадлежности к тому или иному подтипу, вызывают генерализованную форму инфекции. При гриппе птиц, выделенных подтипом А, происходит гипоплазия лимфоидных органов, лимфоцитопения и подавление защитных механизмов, что способствует виремии и репликации вируса в различных клетках органов и тканей. Нарушение гемодинамики, геморрагический диатез и экссудативные процессы связаны с нарушением порозности стенок кровеносных сосудов.

Клинические признаки болезни. Грипп птиц протекает обычно в острой, а иногда и в подострой форме. Для острого течения болезни характерны: короткий скрытый период (2-4 дня), лихорадка до 43-44°С, угнетение, прекращение яйцекладки, поражение дыхательных органов, желудка, кишечника, понос, выраженный цианоз гребня и сережек, быстрая (через 20-40 ч) и высокая смертность. Гибель птицы достигает 80-100%.

В настоящее время нередко регистрируются отдельные небольшие вспышки подострого течения болезни, при котором отмечают: угнетение, снижение яйценоскости, поражение органов дыхания, желудка и кишечника. В таких случаях болезнь длится 2-3 недели и гибель больной птицы составляет 5-10%.

У уток основными клиническими признаками гриппа являются: частое чихание, массовые риниты, конъюнктивиты, кератиты с выделением серозно-слизистого экссудата, склеивающего веки (инфекционный синусит утят). При осложнении секундарной инфекцией отход утят достигает 30-60%.

Патологоанатомические изменения. Патологоанатомические изменения при гриппе не характерны и варьируют в зависимости от тяжести переболевания, вида и возраста птицы. Наиболее часто встречаются: катарально-геморрагические гастроэнтериты, перитониты, перикардиты, сплениты, воспаления и отеки легких, оофориты и нефриты. Находят кровоизлияния под кожей, в скелетной мускулатуре, сердце, паренхиматозных органах. Различия между возбудителями гриппа и ньюкаслской болезни птиц

Дифференцирующие признаки, устанавливаемые у птиц

Диагноз ставят по результатам лабораторных исследований (вирусовыделение или ретроспективные серологические исследования), обнаружение генома в ПЦР с учетом указанных эпизоотологических особенностей, клинических признаков и патологоанатомических изменений с обязательным исключением ньюкаслской болезни — по данным реакции задержки гемагглютинации, с помощью диагностического набора и по ряду других отличительных свойств вирусов (табл. 1).

— пастереллеза — по результатам бактериологического исследования с постановкой биопробы на кроликах и путем обнаружения очагов некроза в печени павших птиц; спирохетоза — на основании обнаружения возбудителя этой болезни в мазках крови больных птиц;

— инфекционного ларинготрахеита — по отрицательным результатам заражения кур и по наличию у больных птиц характерных для ларинготрахеита гнойных пробок и кровянисто-слизистого экссудата в трахее;

Иммунитет. Переболевшие куры приобретают иммунитет. В сыворотках крови переболевших птиц выявляют вируснейтрализующие и антигемагглютинирующие антитела.

Лечение
Для лечения рекомендуются следующие препараты: ремантадин (адамантан), виразол (рибамидил), тамифлю (озелтамивир). Ремантадин блокирует ионные каналы М-белка. Виразол ингибирует активность фермента инозиндегидрогенезы, синтезирующего гуанинмонофосфат, а также РНК-полимеразы вируса. Тамифлю подавляет синтез нейраминидазы.

В экстренном порядке были созданы инактивированные вакцины из аутогенных и гетерогенных штаммов. Недостатком аутогенных вакцин является невозможность дифференциации вакцинированных птиц от естественно инфицированных, поэтому применение их требует использования групп индикаторных птиц, что является довольно сложной процедурой и не исключает вероятности ошибок. Вакцины из гетерогенных штаммов считаются более перспективными, поскольку в их

состав вводят вирус с подтипом гемагглютинина, аналогичным возбудителю, вызвавшему заболевание, но с другим подтипом нейраминидазы. Обнаружение антител против нейраминидазы может быть использовано в качестве маркера антительного ответа на вакцинный и полевой вирус.

Так, в случае возникновения гриппа, вызванного средне-или слабопатогенными штаммами, вводят ограничения, а при появлении высокопатогенного гриппа на хозяйство накладывается карантин. Процедура оздоровления хозяйства практически не отличается от инструкций о мероприятиях по борьбе с ньюкаслской болезнью.

Изменчивость вируса гриппа птиц (ВГП) затрудняет борьбу с птичьим гриппом. Первое, что необходимо сделать после изоляции возбудителя в птицеводческом хозяйстве, это определить вирулентность изолянта. Штамм агента считают вирулентным для птицы, если он относится к подтипам Н5 и Н7 или имеет высокий патогенный индекс, определяемый по результатам внутривенного заражения 6-недельных цыплят.

Международное эпизоотическое бюро (МЭБ) на основании анализа информации о вспышках гриппа птицы за последние 8 лет и результатов проводившихся мероприятий по борьбе с ними рекомендует в неблагополучном хозяйстве и на всех птицефермах, находящихся от него на расстоянии 1-10 км, уничтожать все поголовье птицы с последующим закапыванием или сжиганием трупов (стампинг аут) или организацией контролируемой продажи тушек и других продуктов убоя. Выбор любого из этих вариантов должен основываться на учете патогенности выделенного изолянта ВГП, плотности поголовья птицы на фермах, находящихся вблизи ОИ (очага инфекции),а также экономического положения неблагополучного хозяйства. Например, в Италии стампинг аут применяют в основном для бройлеров и откармливаемых на мясо молодых индюшек, а продукцию, полученную при убое взрослой птицы, продают под тщательным контролем.

Новые партии птицы из благополучных источников целесообразно завозить в хозяйства не раньше, чем через 2-3 недели после уничтожения инфицированного поголовья и заключительной дезинфекции.

Вокруг очага инфекции (ОИ) высококонтагиозного вирулентного штамма ВГП возникает зона повышенного риска распространения инфекции. В связи с этим ограничивают перемещения птицы, столовых и инкубационных яиц, транспортных средств и обслуживающего персонала как в самом очаге инфекции, так и за его пределы. В зоне повышенного риска распространения инфекции птицу вакцинируют.

В настоящее время для иммунизации птицы против гриппа используют три типа вакцин — инактивированные гомологичные, инактивированные гетерологичные и рекомбинантные.

В России гидроокисьалюминиевую инактивированную вакцину против гриппа птиц выпускают с 1974 г. Этот препарат создает через 2-3 недели после вакцинации напряженный иммунитет, который сохраняется не менее 6 месяцев.

Согласно инструкциям МЭБ свежее мясо от птицы, привитой против гриппа, разрешено продавать в другие страны в том случае, если благополучие стада по данной инфекции регулярно подтверждается.