Вирус гепатита культуральные свойства

Вирусный гепатит утят (ВГУ) - высоко контагиозная, остро протекающая среди утят и латентно среди уток болезнь, с преимущественным поражением печени. Эта болезнь до настоящего времени имеет широкое распространение в утководческих хозяйствах промышленного типа и сопровождается высокой смертностью утят 1-30 - суточного возраста, достигая до 30-95 % [4,5,17].

Вирус гепатита утят типа I относится к семейству Picarnoviridae роду Avihepatovirus [14,16].

Вирус удается культивировать на первичных клетках печени и почки эмбрионов уток и гусей [1,6], а также на фибробластах утиного и куриного эмбрионов с коллагеназой [1,7,8].

Метод тканевых культур находит все большее применение в генетических исследованиях с вирусами животных и человека. С его помощью изучен целый ряд важных генетических признаков вирусов: цитопатогенная, бляшкообразующая, интерфероногенная активность, чувствительность к экзогенному интерферону, способность к репликации при различных температурах и другие.

Способность вирусов к репродукции и способность вызывать цитопатогенное действие в клеточных культурах, а также их репликация при различных температурах культивирования являются наследственными биологическими признаками.

Работами ряда исследователей показана возможность изменения наследственных свойств вирусов путем пассажей в культуре клеток при пониженной и повышенной температурах. Усиленное применение этого метода оказалось тесно связано с глубоким изучением способности вирусов к репликации при определенной температуре, так называемого rct - признака.

Доказано, что rct - маркер вирусов является наследственным свойством и даже отдельные штаммы одного вируса обладают не одинаковым rct - признаком [3,9, 11,12,15].

Зависимость между rct - признаком и патогенностью составляет в настоящее время сущность теоретического обоснования применения метода пассажей у культуре клеток при неоптимальных температурах для получения вирусных вакцин с измененными биологическими свойствами [13,15].

Учитывая, что в литературе слабо освещен вопрос о способности вируса гепатита утят к репликации в тех или иных видах тканевых культурах и отсутствие данных по культивированию вируса при различных температурах, целью наших исследований явилось изучение способности вакцинных штаммов вируса гепатита утят к репликации в культурах клеток при различных температурах культивирования ( TC и rct - маркеры).

Материалы и методы исследований

Вирус. В работе использовали производственные вакцинные штаммы ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП вируса гепатита утят, культивируемые в культуре утиных фибробластов при температуре 37 º С, и хранили при минус 20 º С.

Культуры клеток: культура фибробластов 10-12 - суточных куриных эмбрионов (ФЭК); культура фибробластов 14-15 - суточных утиных эмбрионов (ФЭУ); культура клеток печени 25-27 - суточных утиных эмбрионов; культура клеток почки 25-27 - суточных утиных эмбрионов.

Первично-трипсинизированную культуру клеток готовили из кожно-мышечной ткани, печени и почек куриных и утиных эмбрионов по методике Dulbecco R.&Vogt M. (1954) в модификации Younger J.S. (1954) [10].

В качестве питательной ростовой среды использовали среду Игла МЕМ/ДМЕМ и среду 199 в соотношении 2:1 с добавлением 10 % нормальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков: бензилпенициллина 100 ЕД/см 3 и стрептомицина сульфата - 100 мкг/см 3 . Раствор для диспергирования ткани состоял из 0,25 % раствора трипсина, 0,02 % раствора версена и раствора Хенкса в соотношении 1:2:2. Трипсинизацию проводили на магнитной мешалке при температуре 36-37 ºС в течение 10-15 мин до полного расщепления фрагментов ткани на отдельные клетки. По истечении указанного времени клеточную взвесь сливали во флаконы с охлажденной смесью сыворотки крови крупного рогатого скота до 10 % и среды Игла (соотношение 1:1) с целью нейтрализации действия трипсина.

Суспензию клеток центрифугировали при 900-1000 об/мин в течение 20 мин. Из осадка после ресуспензирования готовили суспензию клеток в питательной ростовой среде с содержанием 650-750 тыс. кл./см 3 . Клеточную суспензию разливали в пробирки и матрасы по 2 и 220 см 3 соответственно и инкубировали в стационарных условиях при температуре (37,0±0,5)º С. В течение 48 часов на поверхности стекла формировался клеточный монослой.

Определение Rct TC признака. Способность вакцинных штаммов к репликации при неоптимальных температурах изучали путем 5-кратного пассирования в культуре фибробластов утиных эмбрионов. Культивирование зараженных и контрольных клеток проводили при температурах 32 и 40 ° C, учитывая время наступления и характер ЦПД в культуре клеток. Инфицирование ФЭУ проводили в дозе 1,0 ЦПД₅₀ на клетку. После 1, 3 и 5-го пассажа определяли инфекционный титр вируса методом титрования и выражали в lg ТЦД₅₀/см 3 .

Rct TC признак штаммов вируса, определяли по методу М. Беньеш-Мельник и Дж.Л. Мельник (1961) [2] , в основе которого лежит вычисление разности между титрами изучаемых штаммов вируса при 37 и 32 ° C или 37 и 40 ° C. Так, rct_32° - /rct_40° - / - разница титров вируса больше 4 lg ТЦД₅₀/см 3 ; rct_32° + / rct_40° + / - разница титров вируса меньше 2 lg ТЦД₅₀/см 3 ; rct₃₂ о± / rct₄₀ о± / - разница титров вируса от 2,1 до 4 lg ТЦД₅₀/см 3 .

Титрование вируса на культуре клеток по цитопатогенному действию (ЦПД) проводили в культурах клеток методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями.

Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench H. (1938) [10] и выражали в lg ТЦД₅₀ в 1.0 см 3 (тканевая цитопатогенная доза).

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методам.

Результаты исследований и обсуждение

Вакцинные штаммы ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП вируса гепатита утят вызывали острую форму вирусной инфекции в культурах клеток куриных и утиных эмбрионов при температурах культивирования 32, 37 и 40 º С. Цитопатогенное действие сопровождалось округлением клеток на ограниченных участках монослоя, появлением симпластических образований с зернистостью в цитоплазме клеток через 72-96 часов после инокуляции, а на последней стадии репликации вируса формированием синцития и дегенерацией клеточного монослоя через 96-120 часов культивирования. Латентная фаза штамма ВГНКИ-К при температуре 37 º С составила 24 часов и 48 часов штамма ЗМ-УНИИП, а при температуре 32 и 40 º С она равнялась у штаммов ВГНКИ-К и ЗМ-УНИИП 72 и 48 часам соответственно. .Данные определения активности штаммов в различных первично-трипсинизированных культурах клеток при температуре 37 º С представлены в табл. 1.

Биологическая активность вакцинных штаммов ВГНКИ-К и 3М-УНИИП вируса гепатита утят в культурах клеток при 37 º С

Активность штаммов, lg ТЦД₅₀,M±m*

Гепатит А. Острая инфекционная болезнь, с лихорадкой, поражением печени. Антропоноз.

Таксономия, морфология, антигенная структура: Семейство Picornaviridae род Hepatovirus. Типовой вид —имеет один серотип. Это РНК-содержащий вирус, просто организованный, имеет один вирусоспецифический антиген.

Культивирование: Вирус выращивают в культурах клеток. Цикл репродукции более длительный, чем у энтеровирусов, цитопатический эффект не выражен.

Резистентность: Устойчивостью к нагреванию; инактивируется при кипячении в течение 5 мин. Относительно устойчив во внешней среде (воде).

Эпидемиология. Источник-больные. Механизм заражения — фекально-оральный. Вирусы выделяются с фекалиями в начале клинических проявлений. С появлением желтухи интенсивность выделения вирусов снижается. Вирусы передаются через воду, пищевые продукты, руки.

Болеют преимущественно дети в возрасте от 4 до 15 лет.

Патогенез: Обладает гепатотропизмом. После заражения репликация вирусов происходит в кишечнике, а оттуда через портальную вену они проникают в печень и реплицируются в цитоплазме гепатоцитов. Повреждение гепатоцитов возникает в результате иммунопатологических механизмов.

Клиника. Инкубационный период - от 15 до 50 дней. Начало острое, с повышением т-ры и тошнотой, рвотой). Возможно появление желтухи на 5-й день. Клиническое течение заболевания легкое, без особых осложнений. Продолжительность заболевания 2 нед. Хронические формы не развиваются.

Иммунитет. После инфекции - стойкий пожизненный иммунитет, связанный с IgG. В начале заболевания в крови IgM, которые сохраняются в организме в течение 4 месяцев и имеют диагностическое значение. Помимо гуморального, развивается и местный иммунитет в кишечнике.

Микробиологическая диагностика. Материал для исследования - сыворотка и испражнения. Диагностика основана главным образом на определении в крови IgM с помощью ИФА, РИА и иммунной электронной микроскопии. Этими же методами можно обнаружить вирусный антиген в фекалиях. Вирусологическое исследование не проводят.

Профилактика. Неспецифическая профилактика. Для специфической пассивной профилактики используют иммуноглобулин. Иммунитет сохраняется около 3 мес. Для специфической активной профилактики – инактивированная культуральная концентрированная вакцина. Рекомбинантная генно – инженерная вакцина.

Вирус гепатита В - семейство Hepadnaviridae род Orthohepadnavirus.

Морфология: ДНК-содержаший вирус сферической формы. Состоит из сердцевины, состоящей из 180 белковых частиц, составляющих сердцевинный НВс-антиген и липидсодержащей оболочки, содержащей поверхностный HBs-антиген. Внутри сердцевины находятся ДНК, фермент ДНК-полимераза, обладающая ревертазной активностью, и концевой белок НВе-антиген.

Геном представлен двунитевой ДНК кольцевой формы.

Культуральные свойства. Не культивируется на куриных эмбрионах, не обладает гемолитической и гемагглютинирующей активностью. ВГВ культивируется только в культуре клеток.

Резистентность. Высокая к факторам окружающей среды и дезинфицирующим веществам. Вирус устойчив к длительному воздействию кислой среды, УФ-излучению, действию спирта, фенола.

Антигенная структура. Сложная. В суперкапсиде вируса находится HBs-антиген, который локализован в гидрофильном слое на поверхности вириона. В формировании HBs-антигена участвуют 3 полипептида в гликозилированной форме:preSl — большой полипептид; preS2 — средний полипептид; S — малый полипептид.

Эпидемиология: Развитие инфекционного процесса при попадании в кровь. Заражение происходит при парентеральных манипуляциях (инъекциях, хирургических вмешательствах), переливании крови.

Патогенез и клиника заболевания. Инкубационный период 3—6 месяцев. Инфекционный процесс наступает после проникновения вируса в кровь. ВГВ из крови эндоцитозом проникает в гепатоцит. После проникновения вируса происходит достраивание плюс-нити ДНК ДНК-полимеразой до полноценной структуры. Клиническая картина характеризуется симптомами поражения печени, в большинстве случаев сопровождается развитием желтухи.

Иммунитет. Гуморальный иммунитет, представленный антителами к HBs-антигену, защищает гепатоциты от вируса, элиминируя его из крови.

Клеточный иммунитет освобождает организм от инфицированных гепатоцитов благодаря цитолитической функции Т-киллеров. Переход острой формы в хроническую обеспечивается нарушением Т-клеточного иммунитета.

Микробиологическая диагностика. Используют серологический метод и ПЦР. Методами ИФА и РНГА в крови определяют маркеры гепатита В: антигены и антитела. ПЦР определяют наличие вирусной ДНК в крови и биоптатах печени. Для острого гепатита характерно обнаружение HBs антигена, НВе антигена и анти-HBc-IgM антитела.

Лечение. Использование интерферона, интерфероногенов: виферона, амиксина, ингибитора ДНК-полимеразы, препарата аденинрибонозида.

Профилактика. Исключение попадания вируса при парентеральных манипуляциях и переливаниях крови (применением одноразовых шприцев, проверкой на гепатит В по наличию HBs-антигена в крови доноров крови).

Специфическая профилактика осуществляется вакцинацией рекомбинантной генно-инженерной вакциной, содержащей HBs-антиген. Вакцинации подлежат все новорожденные в первые 24 часа жизни. Длительность поствакцинального иммунитета — не менее 7 лет.

Вирус гепатита С относится к семейству Flaviviridae роду Hepacivirus.

Антигенная структура. Вирус обладает сложной антигенной структурой. Антигенами являются:

1. Гликопротеины оболочки

2. Сердцевинный антиген НСс-антиген

3. Неструктурные белки.

Культуральные свойства. ВГС не культивируется на куриных эмбрионах, не обладает гемолитической и гемагглютинирующей активностью. Резистентность. чувствителен к эфиру, УФ-лучам, нагреванию до 50С.

Эпидемиология. Заражение ВГС аналогично заражению ВГВ. Наиболее часто ВГС передается при переливаниях крови, трансплацентарно, половым путем.

Клиника: Часто встречаются безжелтушные формы, течение инфекции в острой форме, в 50 % случаев процесс переходит в хроническое течение с развитием цирроза и первичного рака печени.

Микробиологическая диагностика: Используются ПЦР и серологическое исследование. Подтверждением активного инфекционного процесса является обнаружение в крои вирусной РНК ПЦР. Серологическое исследование направлено на определение антител к NS3 методом ИФА.

Профилактика и лечение. Для профилактики – тоже, что и при гепатите В. Для лечения применяют интерферон и рибовирин. Специфическая профилактика – нет.

Вирус гепатита D - дефектный вирус, не имеющий собственной оболочки. Вирион имеет сферическую форму, который состоит из однонитчатой РНК и сердцевинного HDc-антигена. Эти белки регулируют синтез генома вируса: один белок стимулирует синтез генома, другой — тормозит. Различают три генотипа вируса. Все генотипы относятся к одному серотипу.

Резервуаром BFD в природе являются носители ВГВ. Заражение BFD аналогично инфицированию ВГВ.

Микробиологическая диагностика осуществляется серологическим методом путем определения антител к BFD методом ИФА.

Профилактика: все те мероприятия, которые используют для профилактики гепатита В. Для лечения используют препараты интерферона. Вакцина против гепатита В защищает и от гепатита D.

Антропоноз, фекально – оральным механизмом передачи.

Таксономия: семейство Caliciviridae. Недавно переведен из семейства в группу гепатит Е-подобных вирусов.

Структура. Вирион безоболочечный, сферический.. Геном — однонитевая плюс-РНК, которая кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу, папаинподобную протеазу и трансмембранный белок, обеспечивающий внедрение вируса в клетку.

Эпидемиология, клиника. Основной путь передачи — водный. Инкубационный период 2—6 недели. Поражение печени, интоксикацией, желтухой.

Иммунитет. После перенесенного заболевания стойкий.

Микробиологическая диагностика: 1) серологический метод — в сыворотке, плазме крови с помощью ИФА определяют: антитела к вирусу (анти-HEV IgM, анти-HEV IgG); 2) молекулярно-генетический метод — применяют ПЦР для определения РНК вируса (HEV RNA) в кале и в сыворотке крови больных в острой фазе инфекции.

Лечение. Симптоматическое. Беременным рекомендуется введение специфического иммуноглобулина.

Профилактика. Неспецифическая профилактика - улучшение санитарно-гигиенических условий и снабжение качественной питьевой водой. Созданы неживые цельновирионные вакцины, разрабатываются рекомбинантные и живые вакцины.

Вирус гепатита В - семейство Hepadnaviridae род Orthohepadnavirus.

Геном представлен двунитевой ДНК кольцевой формы.

Вирус гепатита С относится к семейству Flaviviridae роду Hepacivirus.

Антигенная структура. Вирус обладает сложной антигенной структурой. Антигенами являются:

1. Гликопротеины оболочки

2. Сердцевинный антиген НСс-антиген

3. Неструктурные белки.

Резервуаром BFD в природе являются носители ВГВ. Заражение BFD аналогично инфицированию ВГВ.

Основные факты

Вирус гепатита D (HDV) представляет собой вирус, для репликации которого необходим вирус гепатита B (HBV). Инфицирование HDV происходит только одновременно с HBV или в виде суперинфекции по отношению к HBV.
Передача вируса чаще всего происходит перинатальным путем от матери ребенку, а также при контакте с кровью или другими биологическими жидкостями.
Вертикальная передача от матери ребенку происходит редко.
Не менее 5% всех людей с хронической инфекцией также инфицированы HDV. Другими словами, во всем мире число инфицированных HDV составляет 15-20 млн. человек. Тем не менее, это только приблизительная цифра, поскольку многие страны не ведут учета распространенности гепатита D.
С 1980 г. наблюдается снижение общего числа случаев инфекции гепатита D в мире. Эта тенденция, главным образом, связана с успехами глобальной программы вакцинации против гепатита В.
Коинфекция HDV-HBV считается самой тяжелой формой хронического вирусного гепатита ввиду более быстрого смертельного исхода от болезней печени и гепатоклеточной карциномы.
В настоящее время показатели эффективности курсов лечения, в целом, невысоки.
Инфекцию гепатита D можно предотвратить посредством иммунизации против гепатита В.

Гепатит D — это болезнь печени, протекающая как в острой, так и хронической форме, вызываемая вирусом гепатита D (HDV), для репликации которого необходим вирус HBV. Заражение вирусом гепатита D происходит только в присутствии вируса гепатита B. Коинфекция HDV-HBV считается наиболее тяжелой формой хронического вирусного гепатита гепатита ввиду более быстрого смертельного исхода от болезней печени и гепатоклеточной карциномы.

Единственным способом предотвращения инфекции HDV является вакцина против гепатита B.

Острый гепатит: одновременное инфицирование HBV и HDV может приводить к гепатиту в умеренной или тяжелой форме или даже к фульминантному гепатиту, но обычно за этим следует полное выздоровление, и хронический гепатит D развивается редко (менее чем в 5% случаев острого гепатита).

Суперинфекция: HDV может инфицировать человека, уже имеющего хроническую инфекцию HBV. Суперинфекция HDV при хроническом гепатите B ускоряет развитие более тяжелых форм болезни в любом возрасте у 70-90% людей. Суперинфекция HDV ускоряет развитие цирроза почти на 10 лет по сравнению с моноинфекцией HBV, несмотря на то, что HDV подавляет репликацию HBV. Механизм, ввиду которого HDV вызывает более тяжелый гепатит и ускоренное развитие фиброза по сравнению с моноинфекцией HBV остается неясным.

Риску инфицирования HDV подвержены хронические носители HBV.

Люди, у которых нет иммунитета к HBV (как естественного после болезни, так и в результате иммунизации вакциной против гепатита B), подвергаются риску инфицирования HBV, что сопряжено с риском инфицирования HDV.

Высокая распространенность гепатита D среди людей, употребляющих инъекционные наркотики, указывает на то, что употребление наркотиков является серьезным фактором риска коинфекции HDV.

Сексуальные контакты с высоким уровнем риска (например, у работников секс-индустрии) – также фактор повышенного риска инфекции HDV.

Миграция из стран с высокой распространенностью HDV в страны с низкой его распространенностью может оказывать влияние на эпидемиологическую ситуацию в принимающей стране.

Инфекция HDV диагностируется путем выявления высоких титров иммуноглобулина G (IgG) и иммуноглобулина M (IgM), антител к HDV, и подтверждается путем выявления РНК HDV в сыворотке.

Однако широкий доступ к диагностике HDV отсутствует, как и стандартизированный подход к анализу на наличие РНК HDV, который используется для мониторинга ответа на противовирусную терапию.

При отсутствии возможности количественного анализа РНК HDV целесообразным маркером для мониторинга реакции на лечение является HBsAg. Снижение титра HBsAg часто свидетельствует об исчезновении поверхностного антигена и клиренсе HDV, хотя исчезновение поверхностного антигена редко встречается при лечении.

В текущих руководствах обычно рекомендуется прием пегилированного интерферона альфа в течение как минимум 48 недель независимо от форм ответа на лечение. Общий уровень устойчивого вирусологического ответа низкий, однако это лечение является независимым фактором, ассоциированным с меньшей вероятностью прогрессирования заболевания.

Для пациентов с фульминантным гепатитом и болезнью печени на последних стадиях может рассматриваться возможность трансплантации печени. Необходимы новые терапевтические средства и стратегии. Новые препараты, такие как ингибитор пренилирования или ингибиторы входа HBV, дали предварительные положительные результаты.

ВОЗ не публиковала конкретных рекомендаций в отношении гепатита D. Тем не менее, рекомендованные меры по предотвращению передачи HBV, такие как иммунизация против гепатита B, безопасная практика инъекций, обеспечение безопасности крови и услуги по снижению вреда, заключающиеся в предоставлении стерильных игл и шприцев, эффективны для предотвращения передачи HDV.

В мае 2016 г. Всемирная ассамблея здравоохранения приняла первую “Глобальную стратегию сектора здравоохранения по вирусному гепатиту на 2016-2021 гг.”. В этой стратегии подчеркивается решающая роль всеобщего охвата услугами здравоохранения, а задачи стратегии находятся в соответствии с задачами в рамках Целей в области устойчивого развития. Главной целью стратегии является ликвидация вирусного гепатита в качестве проблемы общественного здравоохранения, и это отражено в глобальных задачах по сокращению числа новых случаев инфекции вирусного гепатита на 90% и сокращению смертности от вирусного гепатита на 65% к 2030 году. Действия, которые должны проводить страны и Секретариат ВОЗ для выполнения этих задач, изложены в стратегии.

Для оказания поддержки странам в ходе выполнения глобальных целей по гепатиту в рамках Повестки дня в области устойчивого развития на период до 2030 г. ВОЗ проводит работу по следующим направлениям:

повышение осведомленности, укрепление партнерств и мобилизация ресурсов;
разработка основанной на фактических данных политики и сбор данных для информационного обеспечения практических действий;
предотвращение передачи инфекции;
расширение услуг в области скрининга, ухода и лечения.

Кроме того, ежегодно 28 июля ВОЗ проводит Всемирный день борьбы с гепатитом для повышения осведомленности о вирусном гепатите и более глубокого осмысления связанных с ним проблем.

Страница 2 из 14

Острый вирусный гепатит А, или HAV - гепатит (инфекционный гепатит, или болезнь Боткина) вызывается РНК- вирусом, который относится к семейству пикорнавирусов и по совокупности физико-химических характеристик сходен с энтеровирусами. Вирус представляет собой сферическую частицу с диаметром 27 нанометра (нм). В клетке печени вирус локализуется в цитоплазме. Во внешней среде он более устойчив, чем типичные пикорнавирусы. Вирус гепатита А (ГА) может сохраняться в течение нескольких месяцев при температуре +4 °С, несколько лет - при температуре -20 °С, несколько недель - при комнатной температуре. Носителем генетической информации является рибонуклеиновая кислота. Вирус полностью инактивируется при температуре +100 °С в течение 5 минут, ультрафиолетовое облучение (1 минута, 1,1 Вт) разрушает вирус, частичная гибель вируса в воде происходит в течение 1 часа при концентрации остаточного хлора 0,5-1,5 мг/л, полная инактивация - при воздействии 2,0-2,5 мг/л в течение 15 минут. Вирус стабилен к действию кислот и жирорастворителей (эфира). Известен только один серологический тип вируса ГА. Специфическая диагностика ГА может быть осуществлена путем обнаружения вируса в фекалиях методом иммунноэлектронной микроскопии (ИЭМ), выявления антигена вируса в фекалиях радиоиммунньш (РИА) и иммуноферметным анализом (ИФА), а также PIT М-антител к вирусу ГА (анти - ВГА ИГ М) или существенного (в 4 раза и более) увеличения титра суммарных антител в процессе инфекции (РИА, ИФА). Ретроспективная диагностика ГА, имеющая важное значение для изучения иммуноструктуры населения, может быть осуществлена с помощью ИГ М-антител ВГА методами ИФА или РИА.

Вирус ГА начинает выделяться и достигает высоких уровней задолго до клинической манифестации инфекции (за 7-10 дней до клинических симптомов). Элиминация вируса прекращается в течение 1-2 недель после появления симптомов заболевания. В связи с ограничением выделения вируса сроками инкубационного и продромального периодов методы определения самого возбудителя или его антигенов имеют относительное значение. Большее значение для практики имеет определение анти - ВГА Ig M. Эти антитела начинают вырабатываться в организме инфицированных в инкубационном периоде и сохраняются 4-6 месяцев после выздоровления. Выявление анти - ВГА Ig M обеспечивает диагностику ВГА у 100% больных. Разработаны методы определения этих антител в ИФА и РИА. Определение анти - ВГА Ig G, которые выявляются с 3-4 недели заболевания и сохраняются длительно (годы), позволяет оценить состояние иммуноструктуры населения, динамику специфического гуморального иммунитета.

Гепатит В (ГВ) - самостоятельное инфекционное заболевание, вызываемое вирусом ГВ, который относится к семейству гепаднавирусов. Инфекция вызывается ДНК-содержащим, единственным хозяином которого является человек. Он представляет собой частицу размером 42 нм, содержащую частично скрученную сдвоенную ДНК. ДНК вместе с концевым белком и ферментом ДНК-полимеразой заключена в ядерный белок (HBcAg) в нуклеокапсиде размером 27 нм, который в свою очередь окружен защитной оболочкой толщиной 7 нм, представляющий собой поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg). Первичной клеткой мишенью для ГВ - инфекции является гепатоцит. Вирус гепатита В во многом уникален.

Геном ВГВ. Он представлен двухцепочечной кольцевой молекулой ДНК, (состоящей из 3200 нуклеотидов) с молекулярной массой 21000 кД - наименьшей из известных в настоящее время вирусов Он имеет высокую информационную емкость о вирусных белках, необходимых для постройки вирусной частицы и ее жизнедеятельности (HBsAg; ядерном антигене - HBcAg; E-антигена; ДНК-полимеразе; Х-белке). Это достигается тем, что в ДНК-ВГВ имеются 4 гена и 6 открытых рамок считывания, перекрывающих друг друга.

S-ген HBsAg. Оболочка вируса представлена тремя формами HBsAg, обозначаемыми как малый, средний и большой белок. Области S-гена, обозначенные pre-Sl и pre-S2, несут информацию о рецепторах, способствующих прикреплению ВГВ на поверхности гепатоцитов. На гепатоците имеется большое количество рецепторов, на которых адсорбируется ВГВ. Количество синтезируемого HBsAg может достигать 1012 - 1013 частиц в 1 мл крови. Только часть этого антигена используется для построения новых вирусных частиц, а основное же количество поступает в кровь в форме сферических 22 нм частиц и палочковидных форм длиной до 200 нм.

Важным свойством HBsAg является его способность вызывать образование антител, которые предохраняют от последующего заражения гепатитом В. Это стало основой создания вакцин против гепатита В.

С-ген. HBcAg: Ядерный (коровский) белок, нерастворим, непосредственно в крови инфицированных не определяется. Ядро ВГВ построено приблизительно из 180 копий белковых частиц, которые самопроизвольно собираются в 27 нм структуру. Помимо информации о HBcAg в С-гене имеется участок (pre-с), отвечающий за синтез белка, который влияет на размножение ДНК-ВГВ. HBcAg определяется только в ядрах, зараженных гепатоцитов. HBcAg является сильным имунногеном. Антитела к HBcAg могут быть двух классов -Ig G и Ig M, что имеет различное значение для оценки фазы развития HBV. НВс - антитела IgM являются признаком либо острого вирусного гепатита, либо хронического заболевания печени с продолжающейся репликацией вируса, антитела IgG -признаком имунной реконвалесценции гепатита В.

Е-антиген. HBeAg обнаружен в сыворотках крови больных острым и хроническим гепатитом В. Он является растворимым компонентом ядерного белка. Информация об HBeAg заложена в С-гене. Установлена связь HBeAg с инфекционностью и наличием вируса. Инфекционность сыворотки крови с HBeAg в миллион раз выше, чем с анти-НВе. Однако, эта связь неабсолютна. Выявлены мутантные формы ВГВ, при которых блокируется синтез HBeAg. При этом, несмотря на наличие анти-НВе в сыворотке крови, удается тестировать ДНК-ВГВ. Предполагают, что у матерей-носителей ВГ, HBeAg, проходя через плаценту, вызывают у плода развитие иммунной толерантности, приводящей к прогрессированию в хронический гепатит.

Х-ген HBxAg. Считают, что Х-антиген является как регуляторным белком, усиливающим синтез вирусных белков, так и белком, включенным в структуру ВГВ. HBxAg играет особую роль в развитии первичной гепатоклеточной карциномы.

Р-ген. ДНК-полимераза - фермент, информация о котором заложена в ДНК-ВГВ. Он обладает ферментативной активностью как РНК зависимая - ДНК-полимераза и необходим для достройки внутренней короткой цепи ДНК-ВГВ в процессе ее репликации.

Серологическими маркерами HBV являются; HBV ДНК, ДНК - полимераза, НВе Ag, HBs Ag, анти - НВе, анти -HBs, анти - НВе IgG, анти - НВе IgM.

Серологическими маркерами репликации ВГВ являются; НВV ДНК, ДНК-полимераза, HBeAg, анти-НВеIgM.

Интеграция ДНК-ВГВ. В процессе инфекции может произойти встраивание ДНК-ВГВ в клеточные гены, что приводит к синтезу вирусных антигенов. ДНК-ВГВ может быть обнаружена в интегрированном состоянии в геноме гепатоцитов. Может происходить встраивание всего генома вируса или участка, отвечающего за синтез HBsAg, который выявляется в высоких концентрациях. В настоящее время отсутствуют методы удаления интегрированной ДНК-ВГВ. Следовательно, полная элиминация вируса ГВ из организма возможна только в фазе репликации вируса и невозможна, если наступила фаза интеграции.

Серологическими маркерами интеграции ВГВ являются: HBsAg, анти - НВс IgG, анти - НВе.

Вирус ГВ устойчив к воздействию многих физических и химических факторов. Он сохраняет свою активность при длительном (более 20 лет) хранении в замороженном
состоянии при -20 °С, после многократного замораживания и оттаивания, а также после обработки спиртом и эфиром в течение 18 часов. Вирус ГВ остается жизнеспособным в
высушенном состоянии при 25 °С в течение 7 суток и более.

Вирус ГВ инактивируется при температуре 60 °С в течение 10 часов, при обработке 0,1 % формалином или 2 -5% фенолом (экспозиция в течение 24 часов), 3 - 5 % хлорамином, комбинированным воздействием УФО и бетапропиолактона.

Автоклавирование при 120 °С в течение 45 минут, сухой
жар при 180 °С в течение 60 минут, кипячение в течение 30 минут приводят к инактивации вируса ГВ.

Специфическая диагностика ГВ может быть осуществлена путем выявления вируса в сыворотке крови методом иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ), однако большее распространение получили методы определения маркеров вируса - поверхностного антигена (HBs Ag ), ядерного антигена (HBcAg ) и антигена инфекционности (HBeAg ), а также соответствующих антител (анти - HBs, анти - НВс, анти - НВе).

HBsAg - исторически первый маркер вируса ГВ, идентифицированный в 1964 году. Он является поверхностным белком вируса, появляется в крови инфицированных лиц через 6-12 недель после заражения, т.е. в инкубационном периоде. Определение этого антигена широко используется практикой здравоохранения для диагностики ГВ. В настоящее время имеется более 15 методик определения HBsAg, Наибольшее распространение получили реакция иммунодиффузии в геле (РИД), встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), ИФА и РИА. Эти методы различаются по чувствительности и специфичности. Выявление HBsAg свидетельствует о текущей острой или хронической инфекции. Для решения вопроса о форме инфекции необходимо руководствоваться результатами клинико-биохимического обследования и определения других маркеров ВГВ. HBsAg присутствует в крови в течение 4 месяцев и исчезает при выздоровлении. У инфицированного вирусом гепатита В человека, который впоследствии избавляется от этого вируса, титр HBsAg и HBeAg нарастает до максимума, а затем снижается с последующим нарастанием титра трех антител, в первую очередь анти - НВс, присутствие которых определяется в первые дни заболевания и сохраняется многие месяцы, затем анти - НВе (с 4-ой недели от начала болезни) и наконец анти - HBs спустя 2 месяца после исчезновения в крови HBs Ag (или через 6 месяцев от начала болезни). О развитии иммунитета к вирусному ГВ судят по адекватному уровню анти-HBs (более 10 mME/мл), тогда как неспособность организма избавиться от HBsAg и продуцировать анти- HBs считается четким признаком того, что больной становится хроническим вирусоносителем.

HBeAg. У тех больных, кто приобретает иммунитет к вирусному гепатиту В, HBeAg в крови определяется в течение 2 недель от начала заболевания. Антитела к HBeAg появляются примерно через 2 недели от начала острого вирусного гепатита, свидетельствуя либо о выздоровлении больного, либо о хронизации процесса. Появление анти - НВе сопровождается снижением активности инвазионной способности вируса и инфекциозности больного. Обнаружение в плазме крови HBeAg в течение более 10 недель свидетельствует о статусе вирусоносительства. Характерным маркером, отличающим больных, у которых острая фаза ВГВ и началась стадия выработки иммунитета, является присутствие анти-НВе и отсутствие HBsAg или анти - HBs.

Гепатит С (ГС) - самостоятельное инфекционное заболевание, вызываемое вирусом гепатита С, который относится к роду Flaviviridae семейства Togavirus. Вирус содержит одноцепочечную РНК и имеет липоидный суперкапсид. Размеры вируса 85 нм. Он очень вариабелен. В настоящее время известно 6 генотипов ВГС и более 80 субтипов. Между 3 и 5 нетранслируемыми концевыми областями вирусного генома имеется несколько структурных и неструктурных генов. Структурные гены (С, El, E2) содержат информацию о строении капсидных и суперкапсидных гликопротеинов, а неструктурные гены (NS2, NS3, NS4 и NS5) -ферменты, участвующие в репликации вируса.

Специфическая диагностика ГС основана на обнаружении анти-HCV и HCV-PHK с помощью полимеразной цепной реакции (PCR). Показано, что антитела к HCV образуются медленно, что занимает в среднем 20 недель от момента инфицирования или через 15 недель от начала гепатита. У некоторых больных для образования антител требуется около года. У 15 % больных с доказанным ГС антитела не образуются вообще. Антитела длительно персистируют в организме и требуется до 4-х лет для их исчезновения после ликвидации вируса. Отсутствие антител к HCV не исключает диагноз ГС.

Гепатит Д (дельта), или ГД - также самостоятельное инфекционное заболевание, вызываемое вирусом ГД. Возбудитель близок к вироидам и сателлитным вирусам растений. Он содержит РНК. Для репродукции ему необходим вирус - помощник, роль которого исполняет HBV. Оболочку вируса - дельта формирует HBsAg, поэтому всегда встречается смешанная инфекция HDB + HBV. Размеры вируса 27 нм. Облигатная связь вируса ГД с вирусом ГВ определяет возможность развития инфекции Д при наличии одной из форм ГВ (суперинфекция) или при одновременном инфицировании обоими вирусами (ко - инфекция).

Присоединение дельта - инфекции к гепатиту В ведет к развитию тяжелых, нередко фульминантных форм болезни, хронических форм заболевания с ранним формированием цирроза печени. Специфическая диагностика основана на выявлении в крови анти - HDV, анти - HDV Ig у.

Гепатит G, или ГДжи - самостоятельное инфекционное заболевание, вызываемое вирусом гепатита G. Он относится к РНК - вирусам, вероятно, семейства флавовирусов. Геном вируса представлен одноцепочечной РНК с позитивной полярностью. По своей организации геном HGV подобен РНК HCV, т. е. структурные гены расположены у 5' области генома, а неструктурные - у 3' конца. На обоих концах генома расположены нетранслируемые зоны. Протяженность РНК HGV колеблется от 9103 до 9392 нуклеотидов. Одна открытая рамка считывания несет информацию о вирусспецифическом полипептиде, состоящем из 2873 - 2910 аминокислотных остатков. Сравнение последовательностей геномов GBV-A, GBV-В, GBV-C и HGV с HCV показало, что их РНК не обладает более чем 32 % идентичности, подтверждая тем самым постулат о самостоятельности этих вирусов. Исследование неструктурного региона РНК HGV определило наличие пяти белков, информация о которых находится в зонах NS2, NS3, NS4b, NS5a, NS5b. Их вес находится в пределах от 20*103 до 70 * 103 дальтон. Эти белки выполняют функции протеазы, хеликазы и РНК - зависимой РНК- полимеразы. У вируса имеется липидная оболочка, наличие которой мешает взаимодействию его с антителами во время персистенции вируса.

Специфическая диагностика вирусного гепатита G основана на выявлении в крови больных анти - Е2 HGV. Антиген Е2, представляет оболочечный антиген вируса и главную мишень гуморального иммунитета. Антитела появляются после исчезновения вируса гепатита G из организма. При хронизации гепатита в крови выявляется PHK-HGV методом амплификации с предварительным этапом обратной транскрипции (RT-PCR). Максимально документированный срок выявления РНК - гепатита G вируса составляет 9-12 лет, средний титр РНК - гепатита G вируса находится на уровне 2,5 МО3 -2,5-104 .
Вирус гепатита G может выступать не только в качестве возбудителя самостоятельного заболевания, но и в качестве ко - инфекции HCV и HBV. Обнаружен в сыворотке доноров как с нормальным, так и с повышенным уровнем АЛТ.

Следовательно, можно говорить о HGV - носительстве и HGV -хроническом гепатите.

Острый вирусный гепатит Е, или HEV - гепатит - самостоятельное инфекционное заболевание, вызываемое РНК-вирусом. HEV достаточно теплолюбив, малоустойчив к термическим и химическим воздействиям.
Методы специфической диагностики: обнаружение в крови анти-HEV или анти-HEV Ig M. Хроническая форма и вирусоносительство на сегодняшний день неизвестны.

Острый вирусный гепатит F, или HFV-гепатит - самостоятельное острое инфекционное заболевание, вызываемое вирусом гепатита F. Открыт в 1992 году.
Методов специфической диагностики нет.

Читайте также: