Несмотря на несомненные успехи медицины, болезни полностью не побеждены и остаются для человечества опасными факторами, способными влиять на ход демографических процессов.
![]()
Основным источником этих ферментов являются почвенные бактерии, грибы и дрожжи. Скрининг микроорганизмов, продуцентов секретируемых нуклеаз, позволил установить, что наиболее активными продуцентами РНКаз среди бактерий являются представители рода Bacillus, нуклеазы, обладающие РНКазной и ДНКазной активностями, продуцируют бактерии родов Staphylococcus и Serratia [1]. Результаты испытаний противовирусных свойств нуклеаз, проведенных рядом авторов, показали, что эти ферменты могут стать одним из достаточно эффективных средств профилактики и лечения различных вирусных заболеваний человека и животных. Показано, что рибонуклеазы обладают выраженной противовирусной активностью в отношении таких РНК-содержащих вирусов, как вирус гриппа, полиомиелита, клещевого энцефалита, бешенства [2, 4-6]. Обнаружение РНКаз и ДНКаз с новыми свойствами позволит создать препараты, расширяющие диапазон действия имеющихся в настоящее время противовирусных средств.
Целью данной работы является изучение свойств и оценка противовирусной активности водных экстрактов нового штамма бактерии Aeromonas bestiarum Bp-1010.
Материалы и методы
Количественную оценку нуклеазной активности проводили по превращению субстратных нуклеиновых кислот во фрагменты, растворимые в 4-х %-ной HClO4, с появлением кислоторастворимого материала с абсорбцией при D260 нм. [7]. За единицу нуклеазной активности (Е) принимали количество фермента, вызывающего увеличение адсорбции на 1,0 оптическую единицу при D260 нм за 20 мин при 37 °С.
Удельную активность измеряли в Е/мг белка. Концентрацию белка в образцах определяли по формуле: С мг/мл=(D228,5-D234,5):3 х n, где D-оптическая плотность, n-разведение образца.
Для приготовления образцов препаратов использовали бактериальные клетки, наработанные в среде LB или среде S с использованием термостатированной качалки (КТ-104, Россия, 180 об./мин, 30 °C). Для получения клеточных экстрактов (КЭ) влажную биомассу в количестве 1 г подвергали разрушению в 4-х мл дистиллированной воды на ультразвуковом дезинтеграторе MSE при 4-5 °C, контролируя на спектрофотометре падение величины D560 до уменьшения оптической плотности суспензии на 80-90 % от исходной. Суспензию клеток освобождали от клеточных остатков центрифугированием (10 тыс. об./мин, 20 мин, при температуре 4-5 °C). Далее полученные образцы исследовали на противовирусную активность in vitro.
Для определения противовирусной активности образцов в монослой культур клеток вносили по 50 мкл/лунку выбранного разведения образца, через 1 ч инкубации при температуре 37 ºC, 5 % СО2 и 100 % влажности вносили по 50 мкл/лунку разведений вирусалантоисной жидкости (ВАЖ) от 1 до 8. Клетки инкубировали в течение 2-х суток для вируса гриппа и 3-х суток для ДНК-содержащих вирусов при температуре 37 ºC в атмосфере 5 % СО2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Затем в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали цитопатическое действие (ЦПД) в монослое клеток и определяли титр вируса. Дополнительно наличие вируса гриппа в среде культивирования тестировали по реакции гемагглютинации (РГА) с 1 % эритроцитами петуха. Определяли титры инфекционных вирусов в клетках в lg ТЦД50/мл в опыте и контроле (ИД50 in vitro с образцом и без него), а затем высчитывали индексы нейтрализации (ИН) вирусов под влиянием образцов.
Результаты и обсуждение
Методом скрининга на селективных средах с добавлением ДНК и РНК отобраны бактериальные изоляты, обладающие нуклеазной активностью, которые затем были проанализированы на наличие нуклеаз методом электрофореза в агарозе. В результате анализа выяснено, что изолят Вр-1010 обладает наиболее высокой РНКазной активностью, по сравнению с другими изолятами. Средняя удельная РНКазной активность бактериального штамма составила 110,0 Е/мг белка. В соответствии с выявленными фенотипическими признаками и по результатам молекулярно генетического анализа (сходство по фрагментам последовательностей 16S рРНК с имеющимися в GenBank на уровне 99 %) эта бактерия была отнесена к виду Aeromonas bestiarum.
В процессе работы было показано, что основная нуклеазная активность (РНКазная и ДНКазная) штамма бактерии A. bestiarum Bp-1010 содержится в клеточной биомассе и в меньшей степени в культуральной жидкости (КЖ). В дальнейшем для исследования его противовирусной активности использовали клеточные экстракты (КЭ), полученные после разрушения биомассы ультразвуком. Оптимальные условия работы ферментов, гидролизующих РНК, определяли при 3-х значениях рН: 6,0, 7,0 и 8,5. Максимальный уровень активности метаболитов КЭ наблюдали в буфере W при рН 8,5. При анализе отдельных колоний штамма A. bestiarum Bp-1010 был выделен клон, с активностью РНКазы в культуральной жидкости (КЖ) - 178,2 ед./мл, а в клеточном экстракте 732,6 ед./мл, (использована среда S, культивирование в течение 24 ч, при температуре 30 °C).
Определение противовирусной активности водорастворимых метаболитов КЭ штамма A. bestiarum Вр-1010 по отношению к вирусу гриппа показало, что КЭ данного штамма при профилактической схеме введения вызывает в культуре клеток MDCK выраженное ингибирование репродукции вируса гриппа субтипа A/H3N2 и практически полное ингибирование репродукции вируса гриппа субтипа A/H5N1 (табл. 1).
Таблица 1
Противовирусная активность клеточного экстракта штамма A. bestiarum Вр-1010 в культуре клеток MDCK относительно вируса гриппа разных субтипов
Полиомиелит – это острое инфекционное заболевание человека, которое сопровождается поражением нервной системы, развитием парезов и параличей.
![]()
Из исторических данных. Впервые были описаны случаи заболевания в 19 веке. В 1908 году Ландштейнер К. и Поппер Е. доказали вирусную природу полиомиелита. Также в 20 веке Эндерс Д., Веллер Т. и Робинс Ф. культивировали вирус, за что были награждены Нобелевской премией. Несколько позже была разработана лабораторная диагностика полиомиелита и создана вакцина.
Актуальность. По данным Всемирной организации здравоохранения полиомиелит в основном поражает детей в возрасте до 5 лет. 1 из 200 инфекций приводит к необратимому параличу. Среди тех парализованных, от 5% до 10% умирают, когда их дыхательные мышцы становятся неподвижными.
Случаи, связанные с диким полиовирусом, уменьшились более чем на 99% с 1988 года (350 тысяч случаев) до 22 случаев заболевания в 2017 году. В результате глобальных усилий по искоренению этой болезни более 16 миллионов человек были спасены от паралича.
Пока один ребенок остается инфицированным, дети во всех странах рискуют заразиться полиомиелитом. Невозможность искоренить полиомиелит в этих остаточных пунктах может привести к 200 тысячам новых случаев каждый год, в течение 10 лет во всем мире.
Рис. 1. Глобальные случаи полиомиелита и полиовируса, полученные в результате вакцинации - последние 12 месяцев - по состоянию на 17 апреля 2018 года.
Возбудителем полиомиелита является РНК- содержащий полиовирус, который принадлежит к роду Enterovirus, сімейства Picornaviridae. Он имеет три серотипа (Брунгильда, Лансинг, Леон). Непосредственными возбудителями заболевания являются дикие штаммы вируса, которые циркулируют в природе. Вирус стоек в окружающей среде.
![]()
Источником инфекции является больной человек или бактерионоситель, которые выделяют вирус с испражнениями. В первые пять дней заболевания возбудитель также выявляют в слизистой носоглотки. Передается полиовирус фекально-орально, иногда – воздушно-капельным путем. Восприимчивыми являются практически все люди, особенно дети до 1 года.
![]()
Первично вирус попадает в эпителий пищеварительного тракта или на слизистую носоглотки. Чаще всего вирус не выходит за границы первичного очага и, таким образом, развивается инапарантная (субклиническая, без развития клинических симптомов) инфекция. После того, как вирус проникнет в кровь, он разносится ко всем внутренним органам, изменения которых незначительны. Симптомы заболевания возникают после того, как возбудитель проникнет через гематоэнцефалический барьер (преграда, которая препятствует проникновению веществ из крови в нервную ткань).
При этом могут развиваться паралитическая или менингеальная формы. При паралитической форме вирус попадает в структуры головного и спинного мозга, которые отвечают за двигательную функцию человека (двигательные ядра черепно-мозговых нервов и передних рогов спинного мозга). Там полиовирус размножается, тем самым повреждая эти структуры, что приводит вначале к парезам, потом – к параличам, а также к косоглазию, нарушениям глотания и дыхания.
Клиника полиомиелита
Все формы полиомиелита подразделяются на непаралитические (инапарантная, абортивная, менингеальная) и паралитические (спинальная, бульбарная, понтинная).
Период от заражения до первых клинических симптомов от 5 дней до 35 дней.
Чаще всего встречается инапарантная форма инфекции, при которой нет никаких жалоб и клинических изменений при осмотре больного. Но эти люди с испражнениями выделяют большое количество вируса, в следствии чего являются эпидемиологически опасными для окружающих людей.
При абортивной форме у больных нет никаких специфических симптомов. Наблюдается кратковременное повышение температуры, вялость, слабость, боль в животе, жидкий стул. Очень быстро эти симптомы полностью исчезают и человек выздоравливает.
Менингеальная форма характеризуется повышением температуры до 39-40⁰С, интенсивной головной болью, рвотой. Может начинаться, как абортивная форма, а потом развивается клиника менингита.
В течении паралитической формы полиомиелита выделяют 4 периода, включая препаралитический, паралитический, период восстановления и резидуальный.
Препаралитический период начинается с повышения температуры и симптомов общей интоксикации. На начальном этапе могут возникнуть катаральные (покраснение и першение в горле, насморк, покашливание) и диспепсические (тошнота, нарушения стула) явления. Далее присоединяются головная боль, рвота, менингеальные признаки, боль по ходу нервных стволов, повышеная чувствительность к раздражителям, которые влияют на органы чувств. К концу этого периода состояние больного улучшается, нормализуется температура тела, но усиливается болевой синдром. Это указывает на переход в следующий паралитический период.
Паралитический период длится от 2дней до 2 недель. У больного усиливается потливость. Для паралитической формы полиомиелита характерно быстрое возникновение вялых параличей в течении нескольких часов, при этом они ассиметричны. В начале паралитического периода тонус мышц снижен, рефлексы ослаблены. Быстро развиваются мышечные атрофии. Отличительной особенностью является то, что болевая и тактильная чувствительность при полиомиелите сохраняется.
![]()
Существует несколько следующих видов паралитического периода: бульбарная (поражения двигательных ядер продолговатого мозга), понтинная (патологический процесс происходит в мосте мозга), спинальная (вирус поражает двигательные нейроны спинного мозга).
При бульбарной форме с самого начала заболевания состояние больных тяжелое. У больных наблюдается повышение температуры, интоксикация. На этом фоне развиваются нарушения глотания и речи, повышается секреция слизи, что особенно опасно возможностью перекрывания дыхательных путей.
При повреждении центров дыхания и сердечно-сосудистой системы наступает цианоз, одышка, нарушения дыхательного и сердечного ритмов. При этой форме возможен летальный исход, но примерно со второй недели состояние может улучшиться вплоть до полного исчезновения симптомов.
В следствии повреждения двигательных нейронов спинного мозга возникает спинальная форма полиомиелита. Она встречается наиболее часто. Отличительной особенностью является выраженные мышечные боли. Развиваются параличи (чаще ног, но бывают и рук, шеи, туловища). Наиболее тяжелыми являются поражения межреберных мышц и диафрагмы. Также могут развиваться нарушения подвижности грудной клетки при дыхании, одышка, цианоз, ослабление кашлевого рефлекса. Частично нарушенные функции могут восстановиться в течении полугода, но большинство из них являются безвозвратными.
При повреждении ядра лицевого нерва возникает понтинная форма, которая сопровождается развитием паралича мимических мышц. Визуально мы можем видеть асимметрию лицевых мышц, опущение угла рта, сглаживание носогубной складки, несмыкаемость глазной щели со стороны поражения. Расстройств всех видов чувствительности не наблюдается.
Для того, чтобы выделить полиовирус и подтвердить диагноз необходимо исследовать слизь из носоглотки (первые 5 дней заболевания) и испражнения (не менее 2 проб в связи с тем, что вирус выделяется не постоянно) методом заражения культуры клеток. Также используются серологические методы (реакция связывания комплемента), полимеразная цепная реакция (для дифференциальной диагностики дикого и вакцинального штамма вируса). Для того, чтобы установить степень повреждения двигательных нейронов используется электронейромиография. При менингеальной форме исследуется спинномозговая жидкость вирусологическим методом и полимеразной цепной реакцией.
Осложнения, вызванные полиомиелитом
К наиболее частым осложнениям полиомиелита относят следующие: пневмония, ателектазы легких, миокардит, острое расширение желудка, кишечные кровотечения.
![]()
Больные полиомиелитом подлежат экстренной госпитализации не менее, чем на 40 суток в специальные боксы.
В препаралитической и паралитической фазе больному необходим полный покой. Кровать должна иметь твердый матрас без подушки, ноги должны быть вытянуты и стопы фиксированы шиной в физиологическом положении.
Специфическим лечением в препаралитический период является введение иммуноглобулина в расчете 0,5 мл/кг массы тела, а также введение интерферона, рибонуклеазы. При сильных мышечных болях назначают анальгетики. При нарушениях глотания необходимо введения желудочного зонда, при дыхательных расстройствах – искусственная вентиляция легких.
В период восстановления больной должен принимать препараты группы В, прозерин, анаболические гормоны, ноотропные препараты, а также применять физиотерапию (парафин, УВЧ), для профилактики контрактур использовать лечебную гимнастику, массаж.
Профилактика полиомиелита – как не заразиться
Выпуск эффективных вакцин для профилактики паралитического полиомиелита стал одним из самых больших медицинских достижений 20-го века. В результате создания и оценки в 2009 году двухвалентной оральной полиовакцины, в Глобальной инициативе по ликвидации полиомиелита теперь имеется арсенал из 5 различных вакцин для прекращения передачи полиомиелита: оральная полиовакцина (ОПВ); моновалентная пероральная полиовакцина (mOPV1 и mOPV3); двухвалентная оральная полиовакцина (BOPV); инактивированная полиовакцина (IPV).
![]()
Если достаточное количество людей будет вакцинировано в любой популяции, вирус потеряет восприимчивых организмов и исчезнет. Чтобы остановить передачу и предотвратить вспышки, необходимо поддерживать высокий уровень охвата вакцинацией. Глобальная инициатива по искоренению полиомиелита постоянно оценивает оптимальное использование различных вакцин с целью предотвращения паралитического полиомиелита и прекращения передачи полиовируса в различных областях мира.
![]()
![]()
На 68-й сессии Всемирной Ассамблеи здравоохранения в рамках глобальной инициативы ВОЗ по борьбе с полиомиелитом было объявлено о глобальном изъятии с апреля 2016 года компонента 2-то типа из трехвалентной оральной полиомиелитной вакцины. Эта инициатива была поддержана всеми странами - участниками, в том числе Российской Федерацией. Таким образом трехвалентная вакцина заменена на бивалентную. Оставшиеся трехвалентные вакцины были утилизированы.
Вакцинация детей для профилактики полиомиелита проводится в возрасте 2 месяца, 4,5 месяца, 6 месяцев, 18 месяцев, 20 месяцев и 14 лет.
Инактивированная вакцина для профилактики полиомиелита (далее - ИПВ) применяется для первых двух прививок, а при противопоказаниях к введению оральной полиомиелитной вакцины (далее - ОПВ) - для всех последующих прививок.
Вакцина ОПВ применяется для 3-6-го прививок (прививки по возрасту – 6 месяцев, 18 месяцев, 20 месяцев и 14 лет) при отсутствии противопоказаний к ОПС. Вакцина ИПВ может быть применена для 3-6-го прививок как отдельно, так и в составе комбинированных вакцин.
Детям, находящимся в закрытых детских дошкольных учреждениях (дома ребенка, детские дома, специализированные интернаты (для детей с психоневрологическими заболеваниями и др.), противотуберкулезные санитарно-оздоровительные учреждения), детских учреждениях закрытого типа с ВИЧ-инфицированными или с лицами, которым противопоказано введение ОПС, прививка проводится исключительно ИПВ-вакциной.
По эпидемологическим показаниям вакцинация против полиомиелита проводится контактным лицам в очагах полиомиелита или при подозрении на заболевание:
- дети с 3 до 18 лет – однократно;
- медицинские работрники – однократно;
- дети, которые прибыли из неблагополучных (эндемичных по полиомиелиту стран), с 3 мес до 15 лет – однократно (при наличии достоверных данных о предшествующих вакцинациях) или трехкратно (при их отсутствии);
- лица без определенного места жительства, с 3 мес до 15 лет – однократно (при наличии достоверных данных о предшествующих вакцинациях) или трехкратно (при их отсутствии);
- лица, которые контактировали с прибывшими из эндемичных регионов, с 3 мес без ограничения возраста – однократно;
- лица, работающие с живым полиовирусом, с материалами инфицированными (потенциально инфицированными) диким вирусом полиомиелита без ограничения в возрасте, - однократно при приеме на работу.
![]()
В мире под контролем Всемирной организации здравоохранения активно уделяется внимание эпиднадзору за полиомиелитом. Глобальное наблюдение за полиовирусом имеет основополагающее значение для достижения и поддержания полной ликвидации полиомиелита. Наблюдение жизненно важно для того, чтобы быстро обнаружить весь циркулирующий полиовирус и сообщить руководству, которое занимается деятельностью по искоренению заболевания. Наблюдение за острым вялым параличем остается основным механизмом обнаружения полиовируса, с особым акцентом на эндемичные и высокорисковые страны. Кроме того, экологический надзор был дополнительно расширены как дополнение к наблюдению за оральной полиовирусной вакциной для выявления присутствия полиовируса в зараженных районах и популяциях. Это облегчает более быструю идентификацию вспышек в зонах повышенного риска, предоставляет дополнительную информацию для подтверждения прерывания передачи и устранения штаммов, связанных с вакциной, после прекращения использования оральной полиомиелитной вакциной.
Был утвержден стратегический план по борьбе с полиомиелитом на 2013-2018 гг, который представляет собой всеобъемлющую долгосрочную стратегию, направленную на обеспечение мира без полиомиелита к 2018 году. Он был разработан Глобальной инициативой по ликвидации полиомиелита в консультации с национальными органами здравоохранения, всемирным здравоохранением, научными экспертами, донорами и другими заинтересованными сторонами в ответ на директиву Всемирной ассамблеи здравоохранения.
В этом плане рассматривается ликвидация всех случаев заболевания полиомиелитом независимо от того, был ли он вызван диким полиовирусом или вакцинальным.
План имеет четыре цели:
- Обнаружение и прерывание всех видов передачи полиовируса.
- Укрепление системы иммунизации и выведение оральной полиовакцины.
- Сохранить выделенный полиовирус, но удостовериться в прерывании его передачи.
- Планирование предотвращения последствий полиомиелита.
В скором времени Всемирная организация здравоохранения предоставит отчет по данной стратегии, но всем известны низкие охваты вакцинацией в некоторых странах, благодаря чему невозможно было достигнуть предполагаемых идеальных показателей.
Вакцинация — самое эффективное медицинское вмешательство, когда либо изобретённое человеком
Читайте также:
Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.
Copyright © Иммунитет и инфекции
