Тестирование растений на вирусы

Современные диагностические системы должны характеризо­ваться следующими качествами: более высокой чувствительнос­тью и, главным образом, специфичностью, а также максимальной автоматизацией и, как следствие, стандартизацией большинства этапов анализа. Не менее важно добиваться уменьшения веро­ятности субъективной оценки результатов и снижения роли че­ловеческого фактора, повышать производительность системы при низкой себестоимости выполнения анализа, сокращать об­щее количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа и компьютеризировать ввод и обработку результатов анализов совместимым программным обеспечением.

В современной отечественной практике в области сельско­хозяйственного растениеводства, в основном, применяются диагностические системы, не отвечающие вышеизложенным требованиям и основанные на простых иммуноферментных методах анализа. В определенной степени это могло бы быть обусловлено тем, что развитие ПЦР-методов анализа вирусных, грибных, бактериальных и нематодных поражений лимитиру­ется отставанием по секвенированию их геномов. К примеру, из 222 бактериальных геномов, работа над секвенированием ко­торых велась или была закончена к 2003 году, фитопатогенами были менее 14 (Lopez et al., 2003). С другой стороны, в реальном секторе практически полностью отсутствуют лаборатории, ос­нащенные современным оборудованием и квалифицированны­ми кадрами. Исключение составляют лишь некоторые подраз­деления службы карантина растений.

Говоря о положении в диагностике вирусных фитопатоге­нов картофеля в сегодняшней России в целом, можно упомянуть лишь несколько разработок. Еще в начале 80-х годов прошлого века, в СССР были разработаны ИФА-тесты основных вирусных патогенов картофеля, которые до сих пор производятся на базе ВНИИКХ (Атабеков И. Г., Тальянский, 1997). Довольно качес­твенные моноклональные антитела к ряду вирусов картофеля были получены в ИБХ РАН, однако эти работы не завершились созданием законченных тест-систем.

Следует упомянуть и весьма эффективные гибридизационные методы. С помощью этих методов можно не только диагностиро­вать тот или иной патоген, но и получить при необходимости ко­личественную информацию относительно копий анализируемого гена или фитопатогена. В России на основе гибридизационного метода в МГУ им. М. В. Ломоносова была разработана система идентификации вироида веретеновидности клубней картофеля (Атабеков И.Г., Тальянский, 1997). Важно отметить, что в сис­теме использовался не радиоактивный, а флуоресцентный зонд, что делает этот метод безопасным. Похожие методы диагностики вироида веретеновидности клубней картофеля и других вирои-дов, основанные на радиоактивно-меченных и флуоресцентных зондах, используются в рутинных анализах и за рубежом.

При диагностике бактериальных инфекций основными оста­ются ИФА-методы. Необходимо отметить, что чувствительность ИФА-методов диагностики бактериальных фитопатогенов даже с использованием моноклональных антител не всегда достаточ­но высока, особенно в случае латентной инфекции. Это обстоя­тельство требует предварительного увеличения количества бак­терий в образце путем их специфической репродукции (Caruso et al, 2002). В каждом конкретном случае необходим подбор оп­тимальных условий репродукции (среды, температура, условия инкубации образцов и т.п.). Во многих случаях существует необ­ходимость тестирования большого числа образцов малоквалифи­цированным персоналом, для чего предложены простые коммер­ческие методы, использующие процедуру иммуноферментного анализа отпечатков образцов растительных тканей на нитроцел­дюлозной мембране (tissue print-ELISA). Специфичность этого метода достаточно высока, однако чувствительность, как пра­вило, недостаточна для достоверной диагностики ряда бактери­альных инфекций. Некоторые специфические задачи решаются с использованием метода проточной фотометрии (Alvarez, 2001). Бактериальные клетки при этом идентифицируются с помощью конъюгатов специфических антител с флуоресцентным красите­лем. Исследование растительных экстрактов этим методом поз­воляет отделять неинфицированные образцы от инфицированных на ранних этапах развития бактериальной инфекции. Существен­ным ограничением использования данного метода в настоящее время является высокая стоимость применяемой аппаратуры.

Немаловажными патогенами картофеля являются нематоды, которые поражают практически все виды растений, включая кар­тофель. В связи с тем, что заболевания, вызванные нематодами приводят к очень большим потерям урожаев, мониторинг фитопа-тогенных нематод весьма важен и актуален. В Европе и в России цистообразующие нематоды, поражающие картофель - Globodera rostochiensis и Globodera pallida - имеют статус карантинных па­тогенов.

Изобретение предназначено для использования в сельском хозяйстве в фитопатологии при тестировании растений на вирусы, а также в процессе очистки вирусов и приготовления антисывороток. Способ включает приготовление фосфатного буфера, в который дополнительно вводят гидроксипроизводное бензойной кислоты с последующим заражением травянистых растений-индикаторов соком исследуемых растений. О наличии вирусов судят по результатам проведения иммуноферментного анализа растения-индикатора, при этом тестируемый образец считается зараженным вирусом при превышении оптической плотности образца над оптической плотностью контроля более чем в 2 раза. Способ позволяет увеличить концентрацию вирусов, ускорить заражение растений-индикаторов и процесс тестирования, получить более достоверные результаты. 1 з.п.ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и фитопатологии и может быть использовано при тестировании растений на вирусы.

Известен способ тестирования на древесных индикаторах /см. Патент РФ N 2016509 кл. A 01 H 1/04, A 01 G 7/00 Способ диагностики заражения черной смородины реверсией// Атрощенко Г.П.- опубл. 1994, Б.И. N 14/. Однако указанный способ требует длительного периода и диагностика затягивается до 7- 9 месяцев. Для ускорения диагностики используют травянистые индикаторы.

Наиболее близким техническим решением является способ тестирования на травянистых индикаторах, где в качестве добавки в буфер для заражения используется никотин-основание /см. Технология производства безвирусного посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда // М.: ГПО "Союзплодопитомник". - 1989. - С. 6-7. - прототип/.

Недостатком указанного способа является то, что не во всех случаях наблюдается заражение, накопление вирусов протекает медленно, а симптомы вирусных заболеваний не проявляются, вследствии чего затрудняется диагностика.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является увеличение концентрации вирусов, ускорение заражения растений-индикаторов и процесса тестирования, получение более достоверных результатов.

Кроме того, поставленная задача решается тем, что в способе тестирования растений на вирусы о наличии вирусов судят по результатам проведения иммуноферментного анализа растений-индикаторов после их заражения.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что в состав буфера для заражения вводят гидроксипроизводное бензойной кислоты. Следует отметить, что известна роль фенольных соединений как регуляторов роста и веществ, индуцирующих устойчивость к неблагоприятным условиям, к патогенам грибной и другой природы /Jlja Raskin. Salicylate, a new plant hormonc//Plant Physio/. - 1992. - 99. - P.799 - 803/. Однако способ тестирования с использованием фенольных соединений неизвестен. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "новизна".

Предложенное техническое решение обладает изобретательским уровнем, так как предложенный способ совершенно неочевиден для специалистов, работающих в области вирусологии и ранее не был использован для этих целей, то есть предложен впервые.

Применение предлагаемого способа позволяет получать новый эффект - увеличивать концентрацию вирусов, ускорять процесс тестирования, получать более достоверные результаты. Все компоненты для осуществления предложенного способа производятся промышленностью, поэтому изобретение вполне может быть реализовано в условиях учреждений, работающих в области вирусологии. При этом не требуется разработка специального оборудования.

Пример 1. В экстрагирующий фосфатный буфер вносят навеску листьев тестируемого растения ежевики в количестве 0,5 г, листья с буфером растирают до образования однородной массы. Образовавшимся инокулюмом натирают поверхность предварительно опудренных карборундом листьев травянистого индикатора - табака. Оценку результатов иммуноферментного анализа на наличие вирусов производят на адсорбциометре "Динатек".

Как видно из таблицы 1, при использовании прототипа /никотин-основания/ наличие вируса не подтверждается.

Разница в результатах, полученных по предложенному способу, в сравнении с прототипом составляет 2,2 - 2,8 раза.

Пример 3. Операции осуществляют по примеру 1. Заражение ежевики черной кольцевой пятнистостью томатов при использовании никотин-основания не подтверждается, поскольку оптическая плотность образца по отношению к контролю составляет 1,1 /таблица 3/.

Полученные результаты свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении с известным способом. Разница в результатах между прототипом и предложенным способом составляет в среднем 1,2 - 3,7 раза. Предложенный способ обеспечивает получение более достоверных результатов по зараженности растений вирусами. Тестирование растений с использованием разработанного способа позволяет осуществлять интенсивное накопление вирусов в тканях индикаторов, что может найти широкое применение при идентификации вирусов, в процессе их очистки и приготовления антисывороток.

Получение более быстрых, точных результатов ускоряет процесс тестирования, оздоровления растений и в целом технологический цикл производства посадочного материала высших категорий качества.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что степень зараженности растений-индикаторов вирусами определяют методом иммуноферментного анализа, при этом тестируемый образец считается зараженным вирусом при превышении оптической плотности образца над оптической плотностью контроля более чем в 2 раза.

Сельское хозяйство — область хозяйственной деятельности человека с наиболее быстрой отдачей прибыли. Однако в данной сфере по-прежнему остро стоит проблема высокой степени зараженности аграрных культур фитопатогенами. Исправить сложившуюся ситуацию можно различными способами, в том числе посредством массовой молекулярной диагностики вирусных и бактериальных инфекций растений при помощи специальных методов.

В растениеводстве размер прибыли зависит многих факторов. В их число входят научный, технический и организационный уровни выращивания сельскохозяйственных культур и климатические условия. Большое значение имеет эффективность борьбы с различными вредителями — животными, насекомыми и сорняками, а также микроорганизмами — грибками, бактериями, вирусами и вироидами. Обычно вирусы не беспокоят конечного потребителя, поскольку они не опасны для здоровья. Однако эти инфекционные агенты могут негативно повлиять на урожайность культур или привести к полной гибели посевов.

Вирусные и вироидные инфекции злаковых, овощных, плодовых, ягодных и декоративных культур встречаются повсеместно. Заражение обычно происходит при проникающем ранении клеточной стенки с помощью насекомых и других вредителей либо механически — инвентарем или оборудованием. При этом проводимое массово оздоровление растений через получение апикальной меристемы не гарантирует 100-процентного освобождения от вирусов и вироидов. Именно этот фактор в совокупности с отсутствием доступной диагностики привел к широкому распространению вироида на картофеле в 80-х годах прошлого века за пределами природных очагов этого заболевания в России.

Вирусные и вироидные инфекции причиняют значительный ущерб урожаю, причем наиболее вредны смешанные варианты. Например, заражение картофеля вирусом X приводит к потере урожая на 10 процентов, а совместное инфицирование агентами X и Y — на 50–70 процентов. Чаще всего от данной проблемы страдают предприятия, культивирующие многолетние растения. Так, массовое поражение кокосовых пальм, которые начинают плодоносить лишь на 7–9 годы жизни, вироидом каданг-каданг нанесло экономике Филиппин и острову Гуам катастрофический ущерб от потери 30 млн деревьев. Сегодня растения, зараженные вирусами и вироидами, не лечат, а при постановке диагноза их выбраковывают. В случае карантинной инфекции культуры подлежат уничтожению. Поэтому для предотвращения большого ущерба от распространения заболеваний необходимы решения, позволяющие точно и быстро определить, здоровое или больное растение будет выращиваться в хозяйстве.

Очевидно, что эффективность борьбы с инфекциями многократно выше на начальных стадиях их развития, поэтому окончательный и наиболее точный диагноз о наличии вирусов и вироидов должен ставиться на молекулярном уровне. Диагностика подобных заболеваний является ключевым звеном в производстве оздоровленного семенного материала. Помимо сертификации семян и посадочных растений в массовых масштабах она применяется для контроля оздоровления культур от вирусов, фитосанитарного мониторинга посевов, селекции и карантинной проверки импортируемого семенного материала. При этом методы диагностики на молекулярном уровне не зависят от природы инфицированного организма. Для анализа требуется минимальное количество клеточного сока листовой ткани или проростков.

Повсеместный мониторинг зараженности посевного и полевого материала сельскохозяйственных культур вирусами возможен только на основе простых, надежных, доступных высокоспецифичных и высокочувствительных экспресс-методов. Они должны быть применимы для определения широкого круга вирусов, значительно различающихся по морфологии, структуре и физико-химическим свойствам, и позволять проводить быструю диагностику в полевых условиях без специальных навыков и оборудования. Поэтому одним из главных коммерческих требований, предъявляемых ко всем современным способам внелабораторной иммунодиагностики в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве, является полная готовность набора к тестированию. Он должен включать все необходимые реагенты. Для проведения анализа необходимо лишь добавить анализируемый растительный экстракт образца, что инициирует иммунохимические взаимодействия и формирование регистрируемого сигнала в контрольной и аналитической областях. Идеально в подобных тест-системах использование меток, позволяющих осуществлять обнаружение инфекции путем простого визуального считывания без применения каких-либо проявляющих компонентов. В целях дальнейшего повышения чувствительности технологии могут быть использованы как флуоресцентные маркеры, так и разные усилители регистрируемого сигнала.

Данным требованиям отвечает быстро развивающаяся современная аналитическая технология иммунохроматографического анализа, или ИХА, широкого спектра биологически активных соединений различной природы на тест-полосках. В силу простоты и скорости анализа она постепенно вытесняет традиционные твердофазные методы ИФА. Быстрые и легкие в использовании аналитические иммунохроматографические тест-системы, или ИХТС, позволяют проводить высокочувствительные полуколичественные измерения без специальных навыков и оборудования в полевых условиях. Являясь эффективным средством диагностирования, подобные экспресс-тесты дают возможность в течение нескольких минут визуально определить и оценить содержание диагностически важных фитопатогенов.

Основным компонентом ИХТС является мультимембранная тест-полоска, на которую в определенных зонах нанесены иммунореагенты. Эти первичные антитела, связанные с флуоресцентным красителем или меченные окрашенными наночастицами коллоидного золота, способные связываться с определяемым вирусом. При нанесении клеточного экстракта зараженного растения инфекционный агент капиллярными силами перемещается вместе с фронтом жидкости вдоль полоски. Попав в зону первичных меченых антител, он образует с ними иммунохимические комплексы, которые продолжают мигрировать дальше. Достигнув зоны фиксированных в виде поперечной линии первичных антител, комплекс патогена и меченых антител концентрируется за счет образования тройного комплекса, включающего первичные тела. В аналитической зоне связанные с патогеном частицы коллоидного золота концентрируются, и формируется окрашенная линия. При отсутствии вируса в экстракте у здорового растения меченые первичные антитела свободно проходят через тестовую черту, и цветная полоса в аналитической области не появляется. Она возникает дальше по полоске, где в виде поперечной контрольной линии фиксированы вторичные, антивидовые антитела. Эта зона служит внутренним индикатором определения рабочего состояния иммунокомпонентов. Таким образом, при анализе зараженного растения вирусом видны две красные поперечные линии в аналитической и контрольной зонах, а при проверке здоровой культуры — одна контрольная полоса. Чувствительность определения содержания вируса находится в диапазоне 1–30 нг/мл, время анализа составляет 5–15 мин. Для подавляющего большинства вирусов этого порога вполне достаточно, однако при желании чувствительность можно увеличить с помощью реакции серебряного усиления. В этом случае время анализа будет равняться 30–40 мин.

Тест-полоски предназначены для быстрого качественного определения вирусов в экстрактах из заболевших растений в полевых условиях. Наиболее эффективно они могут быть использованы для оценки зараженности, например, при сертификации элитного и репродукционного семенного картофеля, существенно дополняя его визуальный анализ. Кроме того, полоски можно применять для экспресс-исследования импортируемого семенного и товарного картофеля на карантинные и другие особо вредоносные вирусы, а также в личных, подсобных, мелких фермерских хозяйствах, в которых сегодня сосредоточено основное производство данной культуры в России. ИХТС незаменимы в чрезвычайных обстоятельствах, когда необходимо срочно определить природу фитопатогенов, в частности при эпифитотиях и биотерроризме. К подобным текст-полоскам были разработаны технические условия и регламент, а также инструкции по их созданию и производству.

В последние годы на зарубежном рынке появились иммунохроматографические тесты для определения вирусов растений различных производителей — Adgen, Central Science Laboratory, Agdia, EnviroLogiх и других. По сравнению с перечнем коммерческих тест-систем на основе ИФА данный список пока невелик и включает наборы для диагностики около 50 инфекций — ризомании сахарной свеклы, шарки сливы, тристецы цитрусовых, Y-вируса картофеля, огуречной мозаики, бронзовости томатов и других важнейших патогенов сельскохозяйственных культур. Выпускаются мультиспецифичные тест-полоски для одновременного определения в одном образце нескольких вирусов картофеля. Энергично включились в развитие и поддержку массовой молекулярной диагностики заболеваний растений государство и частный бизнес в Индии, Китае и Бразилии. Серьезным показателем надежности диагностических тест-систем на основе ИХА является включение этого метода в диагностические протоколы ЕРРО, или Европейской организации защиты растений, для определения ряда карантинных объектов.

Использование тест-полосок полностью не решает проблему массового и постоянного контроля за семенами. Так, практика интенсивного культурного растениеводства в западных странах опирается на тотальную сертификацию исходного материала и систематический контроль его качества со стороны аккредитованных инспекций без ущерба для дисциплинированных собственников. В России система подтверждения соответствия оригинального, или предбазисного, сырья предусматривает его обязательную проверку на зараженность возбудителями наиболее вредоносных вирусных и бактериальных болезней в специальных испытательных лабораториях, аккредитованных для выполнения такого рода работ. Формирование цивилизованного рынка семенного материала в России вызвало необходимость коренного улучшения системы его сертификации. В силу этого перспективы развития безвирусного семеноводства прямо зависят от обязательного регулярного применения эффективных методов лабораторной и полевой диагностики вирусных и вироидной инфекций.

Однако основная проблема в России — отсутствие тотального систематического контроля качества сертифицированных семян и исходного посадочного материала для повсеместного культивирования со стороны аккредитованных служб. Положение усугубляется тем, что далеко не полный контроль карантинная служба РФ осуществляет даже в крупных семеноводческих хозяйствах, в то время как в производстве сельхозпродукции значительную часть занимают предприятия мелких собственников. Чтобы включить эти компании в культурное ведение агробизнеса, нужно сначала снабдить их необходимым доступным инструментом отслеживания качества покупаемого и выращиваемого растительного материала, а затем уже вести систематический контроль культуры хозяйствования.

актуальной проблемой молекулярной диагностики выступаетодновременное выявление множества патогенов вирусной и вироидной природы сельскохозяйственных растений. Мультипараметрическое исследование обычно производят на молекулярных чипах. В зависимости от плотности нанесения детекторов их классифицируют на чипы низкой концентрации для анализа единиц и десятков мишеней и высокой плотности — для выявления нескольких миллионов целей, которыми являются вирусные антигены. Для аграрной отрасли вполне подойдут иммуночипы первой категории.

Поскольку сельхозпроизводители специализированы по объектам производства и сбыта, экономически целесообразно разрабатывать диагностический иммуночип для определения местных, районированных инфекций конкретной аграрной культуры. На практике для того или иного растения в конкретной зоне или даже стране опасность представляет небольшое число патогенов различной природы — около 10–20 разновидностей. В частности, для картофеля на территории РФ максимально опасны семь вирусных, одна вироидная и две бактериальные инфекции. Для их определения уже были разработаны диагностикумы, в которых используются поликлональные антитела. Более сложная ситуация складывается с выявлением грибковых патогенов. Для их идентификации лучше применять моноклональные антитела. В этом случае более эффективно обратиться к достоинствам ДНК-чиповой технологии молекулярной диагностики или технологии ПЦР, когда в одном анализе можно получить практически полную информацию о зараженности растения грибками с учетом их штаммового разнообразия. В перспективе для каждой сельскохозяйственной культуры необходимо создать иммуночипы, позволяющие одновременно определять наиболее опасные инфекции вирусного, бактериального и грибкового происхождения. После этого станет возможной разработка макрочипа для установления всех или большей части экономически важных фитопатогенов, поражающих районированные растения, для отдельных регионов России.

На современном этапе для сокращения расходов на практическую молекулярную диагностику в процессе получения суперэлитных семян следует проводить ее в два этапа. На первом экономически выгоднее осуществить частичный скрининг семенного материала мультиплексными иммуночипами или тест-полосками. На этой стадии с меньшими убытками можно оценить долю явно зараженных семян и растений. Если их количество составляет 25 процентов и более от общего объема сырья, то необходимо всю анализируемую партию изучить с помощью тест-полосок или иммуночипа. Главная задача данного этапа — определить явно инфицированные экземпляры и убрать их из последующего размножения.

На второй стадии оставшиеся семена и растения необходимо диагностировать более мощными комбинированными технологиями: ОТ, ПЦР и дотИФА, либо ОТ и ПЦР в реальном времени, либо ДНК-чип и дотИФА. Данные методики позволяют обнаруживать одиночные молекулы РНК вирусов, вироидов и бактерий в анализируемой пробе, однако подобные исследования осуществляются только в лабораторных условиях, требуют большего количества времени, специального оборудования и наличия квалифицированного персонала.

В нашей стране исторически сложилась затратная практика овоще- и плодоводства, требующая государственных субсидий. Данный факт объясняется доступностью просторов сельскохозяйственных угодий России. Например, при меньшей в 2–5 раз урожайности картофеля отечественные сельхозпроизводители снабжают население страны данным продуктом за счет возделывания его на больших площадях, чем в Западной Европе. Экстенсивное ведение сельского хозяйства, когда потребности в сельхозпродукции удовлетворяются не с помощью увеличения урожайности, а за счет возможности использовать территории большой страны, государству экономически невыгодно. Однако переход на интенсивную схему требует повышения производительности труда и сокращения потерь урожаев от различных инфекций.

Необходимость массового внедрения и использования доступных систем диагностики инфекций растений на молекулярном уровне в нашей стране сегодня вполне очевидна. Подобные технологии помогут не только повысить урожайность культур, возделываемых сельхозпроизводителями, но и сформировать отечественный рынок качественного и безвирусного семенного материала.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

Название Создание высокочувствительных тест-систем для одновременной экспресс-диагностики широкого спектра болезней картофеля на основе qPCR-матриц длительного хранения с возможностью быстрой оптимизации архитектуры матрицы в соответствии с запросами регионального потребителя

Руководитель Приданников Михаил Викторович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии", Московская обл

Года выполнения при поддержке РНФ 2016 - 2018

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые слова ПЦР в реальном времени, qPCR матрица, мультиплексный анализ, диагностика болезней картофеля, вирусы и вироиды картофеля, фитоплазма, картофельные нематоды, Phytophthora infestans, Alternaria sp., Dickeya solani, Ralstonia solanacearum, Erwinia sp., Clavibacter sp., Pectobacterium sp., Rhizoctonia solani

Код ГРНТИ 68.37.31

Статус Успешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Ожидаемые результаты
Ожидаемые результаты: 1) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики вирусных и вироидных болезней картофеля (PLRV, PMTV, PVХ, PVA, PVM, PVY, PVYn, PVS, PSTV). 2) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики грибных и оомицетных патогенов картофеля (Phytophthora infestans, Alternaria solani, A. alternatа, Synchytrium endobioticum, Rhizoctonia solani, Fusarim sp.). 3) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики бактериальных болезней картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum, Dickeya sp., Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Ralstonia solanaceaum). 4) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики фитоплазменных болезней картофеля (Candidatus liberibacter, 16 Sr I, 16 Sr III, 16 Sr VI). 5) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики нематодных болезней картофеля (Globodera rostоchiensis, Meloidogyne hapla, Ditylenchus destructor, и внешние карантинные объекты G. pallida, M. chitwoodi, M. fallax, M. enterolobii). 6) Будет выполнен переход на 48-луночный формат qPCR-матрицы, позволяющий увеличить количество одновременно тестируемых патогенов. 7) На основании данных фитосанитарного мониторинга посадок картофеля в различных регионах РФ будет проведено картирование распространенности и вредоносности экономически значимых болезней картофеля, на основании которого будут предложены различные варианты локализации разрабатываемых диагностических тест-систем в соответствии с потребностями регионов. 8) Будут разработаны методические указания по диагностике болезней картофеля различной этиологии с использованием предлагаемых диагностических тест-систем. 9) Будут подготовлены не менее 12 публикаций, из них 8 – в журналах, индексируемых в Web of Science/Scopus и 4 – в журналах, индексируемых в РИНЦ/Google Scholar. Результаты выполнения работ по проекту будут представлены на международных конференциях. 10) На базе ВНИИ фитопатологии будет организована и проведена научно-практическая конференция (с участием не менее 10 юридических лиц – сельскохозяйственных предприятий), в рамках которой будут представлены итоговые результаты проекта. В предлагаемом проекте предполагается максимально расширить спектр диагностируемых фитопатогенов картофеля, включив в них патогенные микроорганизмы, которые отсутствуют в предлагаемых на рынке коммерческих диагностических наборах, но в последние годы приобретают важное экономическое значение (Dikeya solani, фитоплазмы, некротическая форма вируса картофеля Y). На основании биоинформатического анализа ДНК включенных в проект фитопатогенов будут подобраны уникальные праймеры и оптимальные условия проведения qПЦР-анализа. Помимо тест-систем для диагностики вирусных/вироидных, бактериальных, фитоплазменных и грибных болезней картофеля, будет разработана тест-система для диагностики нематодных болезней картофеля, включающая не только распространенные на территории РФ патогенные нематоды картофеля (Globodera rostоchiensis, Meloidogyne hapla, Ditylenchus destructor), но и объекты внешнего карантина (G. pallida, M. chitwoodi, M. fallax, M. enterolobii). Такие тест-системы будут востребованными российской службой карантина; а также могут вызвать интерес сельскохозяйственных служб стран, в которых упомянутые внешние карантинные объекты наносят реальный ущерб сельскому хозяйству. Будут проанализированы данные Россельхознадзора и ВНИИ фитопатологии по фитосанитарному мониторингу посадок картофеля в различных регионах, а также собрана информация о потребностях и запросах региональных производителей картофеля в отношении диагностических тест-систем. На основании полученных результатов будет выполнено картирование распространенности наиболее вредоносных фитопатогенов картофеля, включая те, экономическое значение которых в последние годы в ряде регионов значительно выросло (Dickeya solani, фитоплазмы), что позволит осуществить локализацию разрабатываемых тест-систем в соответствии с нуждами и запросами потребителей путем изменения архитектуры qPCR-матриц. Практическим результатом проекта станет разработка и внедрение новых диагностических тест-систем длительного хранения, обладающих уникальными характеристиками по совокупности таких показателей как стоимость анализа, чувствительность, специфичность, количество одновременно определяемых патогенов, а также простота и удобство проведения анализа. Кроме того, будет проведена локализация этих тест-систем в соответствии с нуждами каждого конкретного региона; в перспективе такая локализация может быть выполнена и для зарубежных потребителей. К настоящему моменту в мире не существует аналогов предлагаемой тест-системе даже на уровне лабораторных исследований, не говоря уже о практическом производстве. Таким образом, практические результаты проекта будут отвечать мировому уровню значимости. Кроме того, поскольку некоторые включенные в исследование патогены вредоносны не только для картофеля, но и для других культур, то в перспективе наработки, полученные в ходе выполнения проекта, могут быть востребованы и в других секторах сельского хозяйства в создании аналогичных тест-систем для других сельскохозяйственных культур.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В течение первого года работы по проекту были достигнуты следующие результаты: А) При помощи программы Oligo 6 и баз данных GenBank и BLAST были подобраны уникальные праймеры для диагностики методом ПЦР или ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией следующих патогенов: 1) Золотистая нематода Globodera rostochiensis Прямой праймер: GCGCAGATATGCTAACATG Обратный: GGCACGGGTCCTAACAC Зонд: [FAM]CAGACATGCCGCAAGGTACG[BHQ1] 2) Некротическая форма вируса Y картофеля (PVYntn) Прямой: TGGCAACTTACACATCAACA Обратный : CGCAATCTGGACATCAGT Зонд: [ROX] CATCTCCAAACTTGCGAAGGG [BHQ2] 3) Вироид веретеновидности клубней (PSTVd) Прямой: GGTTCACACCTGACCTCC Обратный: CTTCAGTTGTTTCCACCG Зонд: [FAM]AGTAGCCGAAGCGACAGCG[BHQ1] 4) Вирус S картофеля (PVS) Прямой: CGAACACCGAGCAAATG Обратный : GAACTCCACGGTCCCAG Зонд: [FAM]TCCCTACTGAACACGTTGCTG [BHQ1] Б) Для всех перечисленных выше тест-систем выполнена оптимизация состава амплификационной смеси и подтверждена возможность применения в универсальном режиме амплификации, т.е. возможность их одновременного использования на одной и той же матрице. В) Для всех перечисленных выше тест-систем была проведена лабораторная проверка специфичности детекции с использованием референтных образцов и оценка предела аналитической чувствительности метода. Полученные результаты подтвердили высокую специфичность используемых праймеров, позволяющую уверенно диагностировать присутствие целевой ДНК или РНК в присутствии генетического материала фитопатогенных микроорганизмов той же группы, а также ДНК растения-хозяина (картофеля). Проведенные испытания показали, что для всех перечисленных выше тест-систем концентрационный предел обнаружения целевой ДНК в пробе составляет 1 нг ДНК(РНК)/мл. Г) Выполнена сравнительная оценка аналитической чувствительности диагностических тест-систем для обнаружения вирусных и вироидных патогенов картофеля при переходе с 30-луночного на 48-луночный формат qPCR-матриц. Показано, что связанное с таким переходом уменьшение объема реакционной смеси до 1 мкл не привело к ухудшению аналитической чувствительности систем.

1. Малько А.M., Живых А.В., Никитин М.М., Французов П.А., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. Мониторинг вирусных инфекций картофеля с использованием матричной ПЦР-диагностики Картофель и овощи, № 12, с. 26-29 (год публикации - 2017).

2. Никитин М.М., Дейч К.О., Павлова Е.А., Иванов А.В., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. Выявление и идентификация возбудителя порошистой парши картофеля Spongospora subterranea методом ПЦР в реальном времени Защита и карантин растений, - (год публикации - 2018).