Тест-системы для обнаружения вирусов

Вопрос тест-систем, выявляющих коронавирус, из чисто медицинского становится вопросом, имеющим отношение ко всем аспектам жизни: от политики до личного дела каждого человека.

В конце прошлой недели сразу несколько российских компаний заявили, что смогут проводить тестирование на коронавирус. Значит ли это, что скоро провериться смогут все желающие? Вопрос, если разобраться, государственной важности: от того, как быстро можно выявить больного, изолировать его и тем самым остановить распространение заболевания, зависит национальная безопасность.

Почему, скажем, в Италии такое количество жертв, а в соседней Германии — нет. По мнению аналитиков, одна из причин — в своевременной диагностике. В Германии сейчас самый высокий в мире процент выявленных случаев среди общего числа обращений, и это не случайно. Одну из самых первых рабочих тест-систем сделали именно в Берлине задолго до того, как в Германии появились первые случаи заражения. Ее разослали во все лаборатории страны и начали бесплатно тестировать всех желающих, чтобы не упустить первые случаи заражения. В Италии ситуация с тестированием с самого начала была принципиально иной: там тестировали только тех, кто приезжал из Китая. Поэтому, в частности, упустили несколько сложных случаев, когда пациенты успевали заразить большое количество людей из своего окружения.

В США (как пишут, в частности, в Twitter врачи из Гарварда) ситуация развивается по итальянскому сценарию. Здесь вирусу на руку сыграла неповоротливость политической системы в целом и системы здравоохранения в частности. Противники Трампа вменяют ему в вину, что он допустил задержку во внедрении тест-систем. Дело в том, что было принято решение не использовать тесты, которые предлагала ВОЗ, а дождаться разработки собственных. В итоге они оказались дефектными, что привело к задержке выявления больных и в целом сделало невозможным получить общую картину распространения вируса. Прогноз однозначный: в условиях избирательной кампании рикошет от медицинской истории для Трампа будет сугубо политическим.

Коммерческие лаборатории, несмотря на ряд прозвучавших заявлений, такие тесты пока не делают. Объясняется это тем, что новая инфекция относится к особо опасным. И обращение с биоматериалами в этом случае требует и специальной подготовки персонала, и специально оборудованной лаборатории, и соответствующей сертификации.

По этому пути, похоже, пойдем теперь и мы.

Как делают анализ?

Для анализа на коронавирус берут мазок со слизистой рта и носоглотки и помещают образец в пробирки. Затем содержимое пробирок в лаборатории исследуется на наличие в них генетического материала вируса — его РНК (молекулы, несущей генетическую информацию).

Для исследования используется метод ПЦР (полимеразной цепной реакции). Смысл его в том, чтобы, говоря упрощенно, увеличить во много раз количество возбудителя, присутствующего в клетках человека. Для этого сначала молекулу РНК преобразуют в ДНК, а затем крошечный участок ДНК начинают копировать миллионы раз, чтобы накопить достаточное количество фрагментов генома, которые уже можно будет проанализировать. На определенной фазе в пробирку добавляется флуоресцентный краситель, который светится только в присутствии ДНК возбудителя. Для получения результатов требуется до 72 часов.

Сегодня это единственный метод, который позволяет выявить возбудителя COVID-19 и обнаружить именно его среди других респираторных вирусов, в том числе и гриппа. И именно этот метод используют практически все страны, создающие свои тест-системы.

Еще в январе, когда китайские исследователи передали научному сообществу полную последовательность генома нового коронавируса, научные институты по всему миру начали разрабатывать, тестировать и публиковать протоколы для его обнаружения с помощью метода ПЦР. ВОЗ ведет список этих протоколов и институтов-разработчиков, готовых поделиться своими наработками.

По другому пути идут разработчики в Сингапуре и Китае. Они создали так называемые серологические тесты, основанные на обнаружении в крови антител, которые организм вырабатывает к возбудителю в процессе болезни. У этого исследования есть и преимущество — оно может обнаружить антитела, даже если человек уже выздоровел. Это как раз тот случай, когда ПЦР уже не увидит возбудителя. По словам вирусолога Даниэль Андерсон из Медицинской школы Duke-NUS, серологические тесты позволяют выявить контакты заболевших и отслеживать людей, перенесших инфекцию. А это важно, поскольку многие случаи передаются от бессимптомных пациентов, которых сложно идентифицировать.

Но есть и минус. Для исследования необходимо, чтобы организм выработал достаточное количество антител — это около недели от начала заболевания. Стало быть, при небольшой вирусной нагрузке анализ ничего не покажет.

И, наконец, еще об одной новой разработке, которая принадлежит Институту химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Его ученые создали прототип тест-системы, которая позволит в оперативном режиме диагностировать новый коронавирус. По мнению ученых, будущее именно за экспресс-тестами. Они не требуют специального оборудования и персонала. А тестирование позволяет экспертам лучше понять, как развивается вспышка, и попытаться предсказать влияние вируса на общество.

Национальные центры по гриппу (НЦГ) и другие лаборатории общественного здравоохранения играют ключевую роль в обеспечении глобальной безопасности здоровья населения путем подтверждения случаев заражения человека новыми вирусами гриппа или другими возбудителями тяжелых респираторных инфекций, такими как вирус птичьего гриппа A(H7N9) и коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КoВ).

ЕРБ ВОЗ поддерживает работу НЦГ по развитию потенциала для выявления новых инфекций по следующим направлениям:

• содействие обмену вирусами среди учреждений Глобальной системы эпиднадзора за гриппом и принятия ответных мер (ГСЭГО);
• оперативное предоставление методических указаний по лабораторному выявлению, проведение учебных мероприятий и программ внешней оценки качества (ВОК);
• регулярное предоставление обновленной информации по гриппу и по вопросам, связанным с ГСЭГО.

В течение ближайших недель со дня обнаружения и определения характеристик вируса пандемического гриппа H1N1, Сотрудничающий центр ВОЗ по справочной информации и исследованиям гриппа при Центрах по контролю и профилактике заболеваний (CDC), Атланта, США, направил наборы для выявления вирусов методом ПЦР в НЦГ по всему миру.

НЦГ в Европейском регионе, как и в других регионах мира, сыграли передовую роль в реагировании на пандемию. В их первоначальные задачи входило обеспечить выявление случаев инфицирования новым вирусом.

В дополнение к предоставлению методических указаний по вопросам лабораторного тестирования, биобезопасности и процедур перевозки образцов, ВОЗ оказала содействие в снабжении лабораторий, не имеющих устойчивых ресурсов, комплектами ПЦР и другими реагентами, предоставляемыми сотрудничающим центром ВОЗ в Атланте, а также материалами для взятия проб. ВОЗ продолжала предоставлять контрольные тест-системы для оценки эффективности в рамках Программы ВОЗ по внешней оценке качества (ПВОК), которая была обновлена путем включения пандемического вируса А(H1N1)pdm09. Были проведены глобальные и региональные телеконференции по вопросам вирусологии, которые были признаны лабораториями как чрезвычайно полезные в плане обмена опытом и передовой практикой.

В период после пандемии 2009 г. ЕРБ ВОЗ провело оценку пандемической готовности НЦГ Региона. Были определены факторы успеха, в том числе: тесное сотрудничество между лабораторными сетями, доступ к международной информации и поддержке, мероприятия, способствующие укреплению лабораторного качества и утвержденные правительствами планы готовности к пандемии.

В работе по обеспечению готовности к пандемии этим вопросам по-прежнему уделяется повышенное внимание.

В 2013 г. оперативное предоставление вирусов A(H7N9) в распоряжение ВОЗ позволило в кратчайшие сроки направить протоколы тестирования, реагентов и контрольные материалы в НЦГ и другие лаборатории общественного здравоохранения. Непосредственно после уведомления ВОЗ в марте 2013 г. о первых случаях A(H7N9) силами ЕРБ ВОЗ в сотрудничестве с ECDC и Сетью европейских референс-лабораторий по гриппу человека (ERLI-Net) было разработано руководство для проведения анализов ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения вируса птичьего гриппа А(H7N9) и проведена экспресс-оценка потенциала лабораторий для обнаружения данного нового вируса.

Через два месяца после того как стала доступной информация о геномной последовательности вируса птичьего гриппа А(H7N9), выделенного от пациента с первым зарегистрированным случаем заболевания, НЦГ Европейского региона ВОЗ получили оперативно разработанные тест-системы для молекулярной диагностики. Благодаря этому в большинстве стран стало возможным обнаружить вирусы птичьего гриппа А(H7N9) на базе предъявленного в НЦГ образца.

В 2014 г. проводятся программы внешней оценки качества лабораторной диагностики гриппа для проверки недавно созданных тест-систем для обнаружения А(H7N9). Кроме того, ЕРБ ВОЗ разрабатывает учебные программы для НЦГ, чтобы повысить уровень готовности к ускоренному выявлению новых вирусов гриппа, а также других респираторных вирусов с пандемическим потенциалом.

"Выполнить анализ, в принципе, можно даже в домашних условиях, так как применяется достаточно простая методика изотермической амплификации. Для уточнения диагноза, если экспресс-тест даст положительный результат, необходимо будет проводить уже более углубленный анализ", - пояснил "РГ" заведующий лабораторией фармакогеномики ИХБФМ СО РАН Максим Филипенко.

Для проведения теста у человека берется мазок из носоглотки палочкой с ватным тампоном, помещается в пробирку. Затем туда добавляется особый реагент, обеспечивающий разрушение вируса. Образец определенным образом обрабатывается, а на заключительном этапе происходит процесс изотермической амплификации. "Это, по сути, нагревание образца на водяной бане, которое проводится в течение 30-40 минут, - рассказал Филипенко. - В итоге происходит визуальная идентификация по принципу "светофора": если в образце есть фрагменты вируса, раствор окрашивается в зеленый цвет. Если вирус отсутствует - раствор становится оранжевым".

Для проверки работы тест-системы не обязательно использовать биоматериал зараженных людей, для этого наши ученые создали синтетическую вирусоподобную частицу на базе данных о геноме COVID-19, опубликованных китайскими коллегами. Исследование показало, что тест чувствителен, если в мазке содержится не менее 20 вирусных частиц.Пока речь идет о прототипе тест-системы, на его базе можно изготовить уже образцы тест-наборов, готовых к производству и применению в обычной медицинской практике.

"Речь идет о первичном выявлении инфицированных людей, - подчеркнул ученый. - Мы ставили задачу сделать простую тест-систему, которой можно пользоваться в быту. Можно сравнить с проведением теста на беременность или использованием домашнего глюкометра, который используют больные сахарным диабетом для контроля уровня глюкозы в крови. При этом для постановки диагноза выполняют более углубленные анализы, выполняемые в лабораторных условиях с применением дорогих реагентов и сложного оборудования".

Филипенко также отметил, что для того, чтобы прототип тест-системы можно было внедрить, производить и применять, необходимо провести клинические исследования и пройти регистрацию, а это достаточно долгий процесс, который требует инвестиций.

Активные исследования по созданию вакцины против COVID-19 сегодня проводят ученые многих стран. Только в России, по сообщениям Роспотребнадзора, идут разработки пяти вариантов вакцины. Вчера о своих наработках сообщили израильтяне, а несколькими днями раньше - США, заявив, что уже готовы начать клинические испытания нового препарата. При этом большинство специалистов сходится в одном: во время нынешней эпидемии широко применить вакцину уже не удастся, первые опытные образцы появятся в лучшем случае к осени, то есть только к новому эпидсезону.

Что касается поисков лекарства от новой инфекции, китайские исследователи сообщили о результатах испытаний арбидола, других антивирусных лекарств, глюкокортикоидов и иммуноглобулинов, которые они применяли против COVID-19. Применение этих препаратов не повысило выживаемость больных, у которых в результате заражения коронавирусом развилось тяжелое воспаление легких. Такие выводы китайские медики сделали в результате исследований, проведенных в "полевых" условиях эпидемии в Центральном народном госпитале Уханя, куда доставляли заболевших. Терапию они получали в течение месяца - со 2 января по 2 февраля. Из пациентов госпиталя была отобрана группа из 53 человек с разной степенью тяжести заболевания, у которых развился острый респираторный синдром - жизнеугрожающее состояние, при котором легкие перестают работать. Исследование подтвердило: известные препараты против вируса не работают.

Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.

Что предлагает ВОЗ

Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.

Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.

Как работает ПЦР-тест

Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.

Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.

В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.

Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.

Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.

Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.

Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.

Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.

На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.

По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.

Новые разработки за рубежом

Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.

Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.

Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.

FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.

Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Елисеева О. В., Латышев О. Е., Гребенникова Т. В., Алипер Тарас Иванович

Разработана тест-система для выявления ПВС методом ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего неструктурный белок NS-1. Данная область генома ПВС является высококонсервативной и позволяет выявлять все штаммы ПВС.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Елисеева О. В., Латышев О. Е., Гребенникова Т. В., Алипер Тарас Иванович

Kit based on Real-time PCR for detection of porcine parvovirus

Parvoviral infection of swine is caused by a small non5enveloped virus (Porcine parvovirus, PPV) and leads to serious reproductive disorders in pregnant sows. The present work it has been shown the results of the development of diagnostic test kits for detection of porcine parvovirus by a TaqMan5based real5time poly5 merase chain reaction. A test system has a high sensitivity, specificity and can detect parvovirus antigen in mummi5 fied fetuses, in the blood and serum, as well as in the semen of boars.

Г.С. Бурмакина, А.С. Малоголовкин, А.В. Николаев, А.В. Луницин, С.Ж. Цыбанов

из расчета 100 LD50. У инфицированных кроликов через 15. 25 ч отмечали клинические проявления болезни: угнетение, отказ от корма, носовое кровотечение и гибель в течение 24.96 ч.

Животных, которые не погибли после инфицирования вирусом ГБК, подвергли эвтаназии на 7-е сутки. Пробы органов и тканей от инфицированных кроликов исследовали методом ОТ-ПЦР.

С использованием ОТ-ПЦР РНК ВГБК была выявлена в печени, селезенке, сердце, легких, мышцах, почках, коже и шерсти зараженных животных. Кроме того, посредством разработанной методики можно выявлять РНК вируса в пробах печени инфицированных кроликов в ранние (1-е сутки) и поздние (4-5-е сутки) сроки после заражения. В ходе экспериментов методом ОТ-ПЦР было установлено наличие РНК возбу-

1. Moss S.R., Turner S.L., Trout R.C., White P.J., Hudson P.J., Desai A., Armesto M., Forrester N.L., Gould E.A. Molecular epidemiology of Rabbit haemorrhagic disease virus // J. Gen. Virol., 2002; 83: 2461—2467.

2. Tian L., Liao J., Li J., Zhou W., Zhang X., Wang H. Isolation and identification of a non-haemagglutinating strain of rabbit hemorrhagic

дителя ВГБК в печени инфицированных кроликов, не павших после заражения, даже в тех случаях, когда результат РГА и ИФА был отрицательным.

Разработана методика ОТ-ПЦР, посредством которой можно обнаруживать геном вируса ГБК в пробах различных органов и тканей. Специфичность метода подтверждена его отрицательными показаниями при исследовании проб органов интактных животных, а также вирусов миксомы кроликов и везикулярной экзантемы. Аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР составляет 101,5 LD5o/мл. Посредством разработанной методики удается выявлять РНК вируса в пробах печени инфицированных кроликов в разные сроки после заражения.

disease virus from China and sequence analysis for the VP60 Gene // Virus Genes, 2007; 35: 745—752.

G.S. Burmakina, A.S. Malogolovkin, A.V. Nikolaev, A.V. Lunitsin, S.G. Cibanov. Identification of the rabbit hemorrhagic disease virus genome by PCR. In the article the results of RT-PCR elaboration for RHDV detection are presented. High specificity and sensitivity of this method were shown experimentally. Samples of different organs (liver, spleen, lungs, heart, kidneys, muscles, skin and hair) of infected animals were tested for RHDV genome identification RT-PCR. The elaborated technique allows to detect RHDV genome in all these organs on different days after infection.

УДК 619: 616.98: 616-076

Тест-система на основе ПЦР

в реальном времени

для обнаружения парвовируса свиней

О.В. Елисеева1, О.Е. Латышев1, Т.В. Гребенникова12, Т.И. Алипер1,2

Ключевые слова: парвовирус свиней, полимеразная цепная реакция в реальном времени Сокращения: КЧС—классическая чума свиней, ПВИС— парвовирусная инфекция свиней, ПВС—парвовирус свиней, п.н. — пары нуклеотидов, ППЭС—перевиваемая линия клеток почек эмбрионов свиней, ПЦР—полимеразная цепная реакция, РГА — реакция гемагглютинации, РРСС—репродуктивно-респираторньй синдром свиней, СПМИ — синдром послеотъемного мультисистемно-го истощения, ЦВС-2 — цирковирус свиней 2-го типа

Парвовирус свиней относится к категории важных патогенов, которые вызывают нарушения репродуктивной функции свиноматок и наносят значительный экономический ущерб свиноводческим хозяйствам [12]. Болезнь, вызванная данным вирусом, клинически проявляется только у супоросных свиноматок и характеризуется малочисленными пометами, гибелью эмбрионов и плодов с рассасыванием и мумификацией, рождением мертвых плодов, бесплодием, повторным

РВЖ • СХЖ • № 1/2012

приходом в охоту, гибелью новорожденных поросят и реже абортами [3, 4]. У животных других возрастных групп заболевание обычно протекает в латентной форме. Однако имеются сообщения, что ПВС вызывает кожные поражения у поросят [10, 11, 19], интерстициальный нефрит у свиней убойного возраста [7] и негнойный миокардит у поросят-сосунов [6]. Согласно последним данным, ПВС может усиливать проявление клинических признаков СПМИ, вызванного ЦВС-2 [9].

ПВС относится к роду Parvovirus семейства Par-voviridae [17]. Его геном представлен однонитевой молекулой ДНК (приблизительно 5 тыс. нуклеотидов), и имеет две основные открытые рамки считывания. Открытая рамка считывания, расположенная на 3' -конце генома, кодирует неструктурные белки (NS). Открытая рамка считывания, расположенная на 5' -конце генома, кодирует структурные белки (VP). Каждая из этих рамок кодирует минимум по два белка [5, 18]. Генетическая вариабельность штаммов ПВС представлена изменениями в структурном белке VP-2. В последнее время выявлены новые антигенные варианты (типы) ПВС, выделенные из полевых изолятов [14, 20].

Классические методы выявления ПВИС — выделение вируса, РГА и иммунофлуоресценция [2, 8, 15]. Для определения вирусного антигена на исследование направляют мумифицированные плоды, мертворожденных поросят, сперму хряков, кровь свиноматок с нарушениями репродуктивной функции. Однако мумифицированные плоды старше 70-дневного возраста и мертворожденные поросята не пригодны для выделения вируса, поскольку содержат вирусный антиген, связанный с антителами. В последнее время для диагностики широко применяют метод ПЦР, основанный на ферментативной амплификации специфических участков генома [1, 16]. Данный метод чувствителен, специфичен, экономичен, прост в исполнении и, кроме того, позволяет выявлять вирус, несмотря на его связь с антителами.

В настоящее время широкое распространение получает современная модификация метода ПЦР — ПЦР с детекцией специфического продукта амплификации в режиме реального времени. Метод обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной ПЦР и позволяет получать результаты в течение нескольких часов, снижает риск контаминации. Кроме того, посредством ПЦР в реальном времени доступен не только качественный, но и количественный анализ.

Разработать тест-систему для выявления ПВС методом ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего неструктурный белок NS-1. Данная область генома ПВС является высококонсервативной и позволяет выявлять все штаммы ПВС.

Материалы и методы

Вирусы, клетки, исследуемые образцы. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали образцы ДНК, выделенные из культур клеток ППЭС, зараженных ПВС (штамм ИЛ-82). Титр данного вируса в РГА сос-

3.68 х |0Л ^ 3.68 х 104

11 16 21 26 31 Номер цикла

Рис. 1. Результаты ПЦР в реальном времени на матрице серии последовательных разведений рекомбинантной плазмиды. Кривые флуоресценции соответствуют положительным результатам обнаружения ДНК ПВС

тавлял 1/1048. Суспензии внутренних органов абортированных плодов и кровь были получены из свиноводческих хозяйств РФ.

Праймеры и зонды. Последовательности синтетических олигонуклеотидов (праймеров и зонда) для детекции фрагмента ДНК (193 п.н.), кодирующего неструктурный белок NS-1, разрабатывали с использованием компьютерных программ Assembly Lign (Oxford Molecular Group PLC, США), Amplify версия 1.0 (University of Wisconsin, США); Oligo версия 4.0 (США). Зонд метили на 5'-конце флуорофором FAM и на З'-конце гаситетелем флуоресценции BHQ1.

Оптимизация проведения ПЦР в реальном времени. Реакцию для наработки фрагмента ДНК проводили в объеме 25 мкл. К 5 мкл ДНК добавляли реакционную смесь для ПЦР, содержащую 2,5 мкл 10X буфера для ПЦР (Fermentas), 10 пМ каждого праймера, 5 пМ зонда, 0,25мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы и 11, 75 мкл деионизованной стерильной воды. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали следующий температурный режим: 1 цикл: при 940С — 5 мин, 35 циклов: при 940С — 15 с, 600С — 15 с, 720С — 1 мин. Ставили реакцию и учитывали результаты с использованием детектирующего амплификатора ДТ-96 (ДНК-технология, Россия). Результаты отображались на экране монитора компьютера в виде зависимости интенсивности флуоресценции от цикла реакции.

О.В. Елисеева, О.Е. Латышев, Т.В. Гребенникова, Т.И. Алипер

5Ю = 0,569 й_2 = 0,9943

Рис. 2. Калибровочный график для количественного анализа

Чувствительность и специфичность ПЦР в реальном времени. Для определения абсолютной чувствительности разработанной тест-системы делали десятикратные разведения рекомбинантной плазмиды на деионизованной стерильной воде. Молекулярная концентрация плазмиды при этом составила от 3,68 х 1010 до 3,68 х 100 копий/мкл. Так же определяли сравнительную чувствительность тест-системы на основе ПЦР в реальном времени, тест-системы на основе ПЦР и РГА, используя 10-кратные разведения культурального ПВС. Специфичность разработанной тест-системы исследовали, используя различные вирусы, вызывающие сходную с ПВИС клиническую картину (вирусы РРСС, КЧС, ЦВС-2).

Для определения чувствительности использовали рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент генома ПВС, кодирующий часть неструктурного белка NS1. Массовая концентрация рекомбинантной плазмиды составила 0,13 мкг/мкл, молекулярная концентрация рекомбинантной плазмиды — 3,68 х 1010 молекул/мкл. Готовили серию стандартных растворов рекомбинантной плазмиды. Диапазон полученных концентраций — от 3,68 х 1010 до 3,68 х 100 копий/мкл.

На рисунке 1 представлены результаты ПЦР в реальном времени серии стандартных растворов калибровочного графика, которые отображены в виде зависимости флюоресценции от номера цикла. В серии экспериментов была определена чувствительность разработанной тест-системы, которая составила 20.30 молекул/мкл в исследуемом образце.

Важной характеристикой метода ПЦР в реальном времени служит возможность проведения не только качественного, но и количественного анализа. Для этого необходимо построить калибровочный график, который выражает линейную зависимость значений порогового цикла Ct и десятичного логарифма концентрации ДНК Log10 (рис. 2). По калибровочному графику, в соответствии с полученным значением &, расчитывают концентрации ДНК исследуемых образцов.

Номер лунки Идентификатор пробирки Ср, Fam Ср, Нех Результат

В1 КЧС_проба_1 (РРУ) -

В5 ЦВС_проба_2 (РРУ) -

Зависимость флуоресценции канала FAM от номера цикла

1 б 11 16 21 26 31

В России для обнаружения парвовирусного антигена в суспензии внутренних органов абортированных плодов обычно используют метод РГА. Сегодня для диагностических исследований также применяют метод ПЦР, основанный на ферментативной амплификации специфических участков генома. Данный метод характеризуется большей чувствительностью по сравнению с РГА и позволяет выявлять вирус несмотря на его связь с антителами, исследовать кровь и сыворотку животных.

В нашей работе мы сравнили чувствительность различных диагностических тест-систем (табл.).

Сравнение чувствительности различных диагностических методов на матрице культуры клеток ППЭС, зараженной парвовирусом свиней

Разведение культуры клеток ППЭС, Метод исследования

РВЖ • СХЖ • № 1/2012

Анализ полученных данных показал, что разработанная тест-система для обнаружения ДНК ПВС на основе ПЦР в реальном времени имеет примерно такую же чувствительность, что и обычная ПЦР тест-система, но в 100 раз чувствительней РГА.

Специфичность тест-системы исследовали с использованием различных штаммов вирусов, вызывающих сходные с ПВИС симптомы заболевания. Результаты исследований приведены на рисунке 3.

1. Гребенникова Т.В. и др. Медицинская вирусология. —

2. Орлянкин Б.Г. и др. Парвовирусные инфекции и их влияние на продуктивность животных. — М.: ВНИИТЭИСХ, 1985.

3. Орлянкин Б.Г. Биология парвовирусов животных // Сельскохозяйственная биология, 1986; 11: 104.

4. Сергеев В.А. Вирусы и вирусные вакцины. — М.: Библи-оника, 2007.

5. Bergeron J. et al. Genomic organization and mapping of transcription and translation products of the NADL-2 Strain of Porcine parvovirus // Virology, 1993. 197: 86—98.

6. Bolt D.M. et al. Non-suppurative myocarditis in piglets associated with porcine parvovirus infection // J.Comp.Pathology, 1997; 117 (2): 107—118.

7. Drolet R. et al. Infectious agents identified in pigs with multifocal interstitial nephritis at slaughter // Vet. Record, 2002; 150 (5): 139—143.

8. Joo H.S. et al. Pathogenesis of porcine parvovirus infec-tion:pathology and immunofluorescence in the foetus // J.Comp.Pathology, 1977; 87: 383—391.

9. Krakowka S. et al. Viral wasting syndrome of swine: Experimental reproduction of Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus // Vet. Pathology, 2000; 37: 254—263.

10. Kresse J.I. et al. Parvovirus infection in pigs with necrotic and vesicle-like lesions // Vet. Microbiology, 1985; 10: 525—531.

11. Lager K.M. et al. Porcine parvovirus associated with cutaneous lesions in piglets // J. Vet. Diag. Investigation, 1994; 6 (3): 357—359.

СТО 42418073-002-2007). Образцы, которые дали положительные результаты в ПЦР, также оказались положительными в ПЦР в реальном времени. По результатам исследований можно сделать выводы о возможности использования разработанной тест-системы для обнаружения ПВС методом ПЦР в реальном времени для диагностики ПВИС у животных.

Разработанная тест-система для обнаружения ПВС методом ПЦР в реальном времени, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Она пригодна для рутинных диагностических исследований в региональных лабораториях для выявления ПВС в пробах биологического материала разного происхождения, полученного от животных.

12. Maldonado J. et al. Identification of viral pathogens in aborted fetuses and stillborn piglets from cases of swine reproductive failure in Spain // The Veterinary J., 2005; 169:454—456.

13. Martinez C. et al. Production of porcine parvovirus empty capsids with high immunogenic activity // Vaccine, 1992; 10: 684—690.