Тест система для выявления антител к вирусу африканской чумы свиней непрямым иммуноферментным методом
Цибезов В.В., Терехова Ю.О., Баландина М.В., Латышев О. Е.,
Гребенникова Т. В., Верховский О.А. АНО "Научно-исследовательский
институт диагностики и профилактики болезней человека и животных"
Клипер Т.Н. "НПОНАРВАК"
Шевкопляс В.Н. Кубанский госагроуниверситет
Африканская чума свиней (АЧС) - вирусная болезнь свиней, характеризующаяся высокой контагиозностью. Возбудителем заболевания является ДНК-содержащий вирус семейства Asfarviridae с размером вириона 175—215 нм [8]. В естественных условиях к АЧС восприимчивы домашние и дикие свиньи всех возрастов. Скорость распространения и степень патогенности вируса АЧС таковы, что эта инфекция способна в короткие сроки (3-5 месяцев) привести к огромным экономическим потерям или даже полной утрате поголовья свиней [1, 6].
Эпизоотологическая особенность АЧС заключается в чрезвычайно быстром изменении форм течения инфекции среди домашних свиней от острого со 100%-ной летальностью до хронического и бессимптомного носительства и непредсказуемого распространения.
Для эффективного использования различных методов диагностики АЧС. направленных на выявление возбудителя или специфических антител, следует учитывать особенности протекания болезни и ее формы. При сверхострой и острой формах выявление вирусоспецифических антител возможно только в пробах селезенки, так как специфические антителопродуцирующие клетки и. следовательно, антитела появляются там на 2-3 сутки после инфицирования, в то время как животные гибнут уже на 3-7 сутки [5]. При подостром и хроническом течении болезни виру-соспецифические антитела в крови появляются на 7-10 сутки, до этого времени целесообразно проводить выявление вирусного антигена или генома в крови, так как данный период течения АЧС характеризуется виремией [7] .
В более поздний срок прижизненная идентификация вирусного антигена возможны только при наличии устойчивой ви-ремии. которая характерна для циркуляции высокопатогенных штаммов и изолятов. Вирус умеренно вирулентных изолятов вызывает перемежающуюся виремию. невысокий уровень смертности при высоком уровне заболеваемости, поэтому в этом случае диагностика АЧС. в основном, базируется на обнаружении антител в сыворотке крови [5. 7]. Таким образом, для эффективной диагностики АЧС необходимы методы специфического определения, как возбудителя, так и антител, образующихся после заражения вирусом.
Одним из перспективных методов определения вирусных антигенов и антител к ним является иммуноферментный анализ (ИФА). Преимущества ИФА заключаются в высокой специфичности, скорости и простоте постановки реакции, сравнительна невысокой стоимости и универсальности применяемого оборудования, возможности автоматизации процедуры анализа. За последнее десятилетие произошли значительные изменения в технологии производства ИФА-наборов. обусловленные результатами научно-практических разработок, связанных с применением моноклональных антител (МкА). которые практически полностью вытеснили поликлональные не только в "сэндвич"-вариантах ИФА. предназначенных для обнаружения антигена, но и в большинстве тест-систем, направленных на выявление антител, где они используются либо в качестве конъюгатов или для адсорбции антигена [9. 10]. Помимо этого, в качестве компонентов ИФА эффективно используются рекомбинантные антигены, обладающие иммунохимическими свойствами нативных белков и представляющие собой хорошо охарактеризованные и стандартизированные препараты [2. 3. 4].
Целью настоящей работы являлась разработка современных иммуноферментных тест-систем для выявления как антител к вирусу АЧС. так и самого вируса АЧС в биологическом материале.
Материалы и методы исследования. Для создания высокоспецифичных иммуноферментных тест-систем необходимо было разработать методику синтеза рекомбинантного белка vp73 вируса АЧС. а также, используя в качестве антигена полученный рекомбинантный белок, получить и охарактеризовать специфические моноклональные антитела к вирусу АЧС. Часть работы была проведена в сотрудничестве с сотрудниками фирмы INGENASA (Испания).
Получение рекомбинантного белка vp73. Для получения рекомбинантного белка фрагмент гена B646L размером 485 п.о., кодирующий конформационный эпитоп белка vp73. был амплифицирован с рекомбинантной плазмидной ДНК pSG72a, несущей полную последовательность этого гена. Экспрессию рекомбинантного белка проводили в клетках E.coli штамма BL21(DE3)pLysS (Novagen). Белок очищали из микробной массы Е. coli BL21(DE3)pLysS на NI-NTA агарозе (Qiagen. USA).
Идентификацию и степень чистоты полученного препарата проверяли методом SDS- электрофореза в 12% полиакриламид-ном геле, его активность и специфичность - в непрямом ИФА и иммуноблоттинге с использованием МкА и референтных положительных и отрицательных сывороток крови свиней.
Получение МкА к рекомбинантному белку vp73. Для получения МкА мышей линии BALB/c 3 раза иммунизировали ре-комбинантным белком vp73 (200 мкг/мышь) с двухнедельным интервалом между иммунизациями. Бустерную дозу (200 мкг/ мышь) вводили за 3 дня до выделения селезенки.
Гибридомные клеточные линии получали путем слияния спленоцитов с перевиваемой клеточной линией миеломы Sp2/0.
Скрининг и оценку иммунологической активности МкА в сыворотке крови или культуральной жидкости проводили методом непрямого ИФА. Позитивные гибридомы реклонировали и наращивали в культуральных флаконах, увеличивая объем (Greiner. Германия). Асцитные жидкости, содержащие МкА, получали после введения гибридомных клеток в брюшную полость праймированных пристаном мышей линии BALB/c. Очистку МкА из асцитных жидкостей осуществляли методом аффинной хроматографии с использованием Белок-А-агарозы (Sigma. США).
Конъюгаты МкА с пероксидазой хрена получали периодатным методом.
Иммуноферментный метод выявления антител к вирусу АЧС в формате конкурентного ИФА. Очищенный рекомбинантный белок vp73 сорбировали в лунках микропланшета в 0.1 М карбонатном буфере. рН=9.5 (концентрация 5 мкг/мл) по 100 мкл в лунку в течение ночи при 4°С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл пероксидазного конъюгата МКА. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл субстратного раствора с тетраметилбензидином (МДЛ. Россия). Инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляли 0.1 мл 1 М H2S04 для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм (А450) измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan EX (Thermo, США).
Иммуноферментный метод выявления антигена вируса АЧС в формате "сэндвич"-ИФА. Для "сэндвич"-ИФА очищенные МкА сорбировали в лунках микропланшета в 0.1 М карбонатном буфере. рН=9.5 (концентрация 10 мкг/мл) по 100 мкл в лунку в течение ночи при 4°С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл очищенного рекомбинантного vp73 в серийных разведениях (от 5 нг/мл до 320 нг/мл) или подготовленные образцы биоматериала. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл пероксидазного конъюгата детектирующих МкА в рабочих разведениях на ФСБТ. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл субстратного раствора с тетраметилбензидином и определяли оптическую плотность как описано выше.
Полимеразная цепная реакция в реальном времени для выявления ДНК вируса АЧС. Выделение ДНК вируса АЧС из биологических образцов проводили с использованием набора для выделения ДНК на колонках ("Ветбиохим". Россия).
ПЦР в реальном времени проводили на приборе ДТ-96 ("ДНК-Технология". Россия) в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл ДНК. 10 пмоль каждого прайме-ра. 5 пмоль зонда. 0.25 мМ каждого dNTP. 1.25 ед. Taq-полиме-разы, 10 мМ Tris-HCI (рН=9.0). 50 мМ KCI. 0.1% Triton Х-100. 1.5 мМ MgCI2.
Результаты и обсуждение. Рекомбинантный фрагмент конформационного эпитопа белка vp73 вируса АЧС был охарактеризован биохимическими и иммунохимическими методами (электрофорез, иммуноблоттинг. ИФА). Показано, что полученный продукт обладает электрофоретической гомогенностью и детектируется АЧС-специфическими сыворотками. Неспецифические сыворотки не взаимодействуют с полученным продуктом. Рекомбинантный белок был использован в качестве антигена для получения МкА.
После проведения гибридизации было получено 523 гибридных клеточных линий, устойчивых к селективной среде HAT. При первичном тестировании культуральных жидкостей было отобрано 67 клонов реагировавших с рекомбинантным белком vp73.
После повторного клонирования были отобраны 2 клона, обладающих максимальной активностью по отношению к vp73 в непрямом ИФА. Полученные МкА были использованы в дальнейшей работе.
При разработке тест-системы для выявления антител к вирусу АЧС был использован принцип конкурентного ИФА. применяемый в наборе для определения антител к вирусу АЧС INGEZIM РРА СОМРАС (INGENASA. Испания). INGEZIM РРА СОМРАС на основе белка vp73 вируса АЧС обладает 100% чувствительностью и специфичностью и используется в Европе в качестве основного для первичного исследования сывороток при диагностике АЧС. Набор INGEZIM РРА СОМРАС успешно применялся в Испании в рамках национальной программы по искоренению АЧС.
В результате проведенных исследований с использованием полученных рекомбинантного белка vp73 и МкА была разработана тест-система для определения антител к вирусу АЧС "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС". Оценка диагностической чувствительности и специфичности тест-системы проводилась в компании INGENASA на широкой панели референтных сывороток крови сывороток крови, полученных от экспериментально зараженных животных и сывороток крови свиней, охарактеризованных референтными методами в соответствии со стандартами OIE (иммуноблоттинг. реакция непрямой иммунофлуорес-ценции. РИФ) [10] .
При исследовании в системе "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС" 120 сывороток, показавших негативный результат методами непрямого ИФА и иммуноблоттинга. АЧС-позитивных 21 сывороток не выявлено, т.е. специфичность тест-системы составила 100%.
23 сыворотки, положительные в непрямом ИФА, но отрицательные в иммуноблоттинге были определены как отрицательные. Поскольку иммуноблоттинг является официальным референтным методом по рекомендации OIE. специфичность системы "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС" в данном случае также составляет 100%.
30 сильноположительных в непрямом ИФА и иммуноблоттинге сывороток и 5 слабоположительных в непрямом ИФА и сильноположительных в иммуноблоттинге сывороток определены как положительные, т.е. чувствительность системы составила 100%.
Тест-система не выявила перекрестных реакций с антителами к вирусам болезни Ауески. болезни Тешена. КЧС и РРСС.
Диагностическая чувствительность системы была определена при исследовании сывороток свиней, экспериментально зараженных вирулентным штаммом вируса АЧС Ug03H (табл. 1) и слабовирулентными штаммами Е75 и Е70 (табл. 2).
Таблица 1. Результаты анализа сывороток крови свиней после экспериментального заражения штаммом Ug03H в системе "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС
3 Мищенко А.В., Мищенко В.А., Мельников В.П., Черных О.Ю. Чума мелких жвачных животных
Приведены данные о трансграничной высококонтагиозной вирусной болезни овец и коз, характеризующейся лихорадкой, диареей, язвенно-эрозионными поражениями слизистой оболочки ротовой и носовой полостей, конъюнктивитами, геморрагическим гастроэнтеритом, поражением лимфоидной системы и пневмониями. Экономический ущерб, наносимый козоводству и овцеводству, чрезвычайно велик. Смертность в первичных очагах может достигать 100 %, а на стационарно неблагополучных территориях – до 50 %. Наиболее восприимчивыми к заболеванию ЧМЖ козы, смертность среди них достигает 95 %. Возбудителем чумы мелких жвачных является вирус, относящийся к роду Morbilivirus семейства Paramixoviridae. По данным филогенетического анализа нуклеотидной последовательности генома вируса, все штаммы формируют 4 филогенетические линии, возбудители 3 были выявлены в пробах патологического материала из Африки. В 4-ю генетическую линию вошли возбудители чумы мелких жвачных животных, циркулирующие на индийском субконтиненте, Китае, Ближнем и Среднем Востоке, Таджикистане, Киргизии, Иране, Казахстане, Турции и Грузии. Ключевые слова: чума мелких жвачных животных, морбилливирус, овцы, козы, дикие жвачные, аэрогенный, алиментарный и контактные пути передачи возбудителя.
ПРАКТИКА: ОПЫТ, ПРОБЛЕМЫ, ПЕРСПЕКТИВЫ
10 Целуева Н.И., Мясникова Н.Г. Эпизоотическая ситуация по лейкозу КРС в Смоленской области
В статье приведен анализ эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в Смоленской области. Ключевые слова:лейкоз крупного рогатого скота, оздоровление, экономический ущерб, эпизоотическая ситуация.
13 Евглевский А.А., Михайлова И.И., Михайлова О.Н., Тарасов В.Ю., Евглевская Е.П. Энергометаболическое средство для глубокостельных и отелившихся коров
Патобиохимические процессы достигают у глубокостельных коров критических значений, что ведет к выбраковке большинства высокопродуктивных животных сразу после отела или в первый месяц лактации. Ведущей причиной является дефицит энергии, который чаще всего обусловлен недостатком в рационе легкоусвояемых углеводов. Для профилактики дефицита энергии у коров разработан энергометаболический состав на основе янтарной кислоты. Ключевые слова: биохимические изменения, задержание последа, метаболизм, отел, свекольная патока, янтарная кислота.
18 Шуралев Э.А. Образование антител у северного оленя, инфицированного Mycobacterium bovis
Мультиплексным иммуноферментным анализом с хемилюминесцентной меткой определили значение микобактериальных антигенов для диагностики туберкулеза северных оленей. Установили, что мажорными иммуногенами M. bovis для северного оленя являются MPB70, MPB83 и PPD-b. Титры антител к ранним секретируемым антигенам бактерии (Rv3616c, ESAT-6 и CFP-10) по мере развития инфекции претерпевают периодические колебания. В отдаленные сроки после заражения M. bovis туберкулиновая реакция провоцирует выработку специфических антител. Ключевые слова: антигены, антитела, микобактерии, мультиплексный иммуноферментный анализ, туберкулез.
21 Аманова Ж.Т., Таранов Д.С., Ершебулов З.Д., Жугунисов К.Д., Баракбаев К.Б., Булатов Е.А., Хайруллин Б.М., Сансызбай А.Р. Оценка эффективности ассоциированной вакцины против чумы мелких жвачных животных и оспы овец
В опытах на 6 – 7-месячных ягнятах установили, что ассоциированная вакцина против чумы мелких жвачных животных и оспы овец по эффективности не уступает моновалентным вакцинам против этих болезней. Ключевые слова: вакцина, иммуногенность, оспа овец, реактогенность, чума мелких жвачных животных.
24 Стаффорд В.В., Забережный А.Д., Гулюкин М.И. Патоморфологические изменения паренхиматозных органов поросят, экспериментально зараженных вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней и цирковирусом свиней типа 2
В статье описаны патоморфологические изменения паренхиматозных органов поросят при экспериментальном заражении цирковирусом свиней типа 2 и вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Наиболее тяжелые изменения выявили в легких, предлопаточных и паховых лимфатических узлах и в почках. Ключевые слова: вирус репродуктивно-респираторного синдрома, патоморфология, свинья, цирковирус типа 2.
28 Лыска В.М. , Новикова М.Б. , Балашова Е.А. , Сидлик М.В. , Кушнир С.Д., Куриннов В.В . Биологические свойства изолятов вируса классической чумы свиней, выделенных в Российской Федерации в 1995 – 2012 гг.
Изучены биологические свойства 16 штаммов вируса классической чумы свиней, выделенных в разных регионах страны во время вспышек 1995 – 1996 и 2012 гг., а также в межэпизоотический период. Ключевые слова: вирус, кабан, классическая чума свиней, культура клеток, патогенность, свинья.
32 Шакарбоев Э.Б., Сафарова Ф.Э., Азимов Д.А., Акрамова Ф.Д. Распространение лигулидозов карпообразных рыб в водоемах северо-востока Узбекистана
Всего в рыбоводных прудах и естественных водоемах Республики Узбекистан было обследовано 1356 рыб. Лигулидозы карпообразных рыб в условиях республики регистрируют во все сезонах года. В естественных водоемах экстенсивность инвазии составляет 8,8 – 27,2 %, а в искусственных – 3,1 – 9,6% при интенсивности инвазии от 1 до 45 экз. Заболеванию подвержены восточный лещ, плотва, красноперка, карась, пескарь, храмуля, белый амур, толстолобик, маринка, сазан и др. Ключевые слова: Ligula intestinalis, Digramma interrupta, лигулидозы, карпообразные рыбы, Узбекистан.
35 Сафиуллин Р.Т., Яблонский С.А., Олейникова В.П. Эффективность Делеголя против ооцист кокцидий птиц
В производственных условиях Московской области Делеголь 4%-ный в дозе 0,5 л/м 2 и экспозиции 2 ч показал 92,4%-ную интенсэффективность против ооцист кокцидий птиц. При этом эффективность базового препарата Фенол составила 61,81 %. Ключевые слова: цыплята, кокцидиоз, ооцисты, заражение, копроскопия, дезинвазии, Делеголь, Фенол, интенсэффективность, производственное испытание.
38 Нежданов А.Г., Митина А.О., Скориков В.Н., Юдин С.М. Восстановление половой цикличности и плодовитости молочных коров с гипофункцией яичников, используя препарат Сат-Сом
Изучена эффективность негормонального препарата Сат-Сом для терапии бесплодных коров с гипофункцией яичников. Препарат обладает специфическим действием на систему гипофиз-гонады и по лечебному эффекту не уступает гонадотропным препаратам. Допускается сочетанное применение Сат-Сома и гонадотропинов. Ключевые слова: коровы, гипофункция яичников, терапия, препараты Сат-Сом, Фоллигон.
42 Требухов А.В. Взаимосвязь показателей белкового обмена больных кетозом коров и их телят
В условиях интенсивного животноводств даже незначительные погрешности в кормлении, условиях содержания и эксплуатации нередко приводят к развитию у крупного рогатого скота заболеваний обмена веществ. Среди них одно из первых мест по встречаемости занимает кетоз. У коров черно-пестрой породы с данной патологией не выявили статистически значимых отклонений от референсных значений по содержанию в крови общего белка, альбуминов и альфа-глобулинов в течение 2 мес до отела и 10 сут после него. В последние месяцы стельности концентрация сывороточных бета-глобулинов снижалась, а уровень гамма-глобулинов, напротив, повышался. Характер изменений биохимических показателей крови свидетельствует о значительном нарушении у коров при кетозе белково-образовательной функции печени, как до, так и после отела. В крови рожденных ими телят регистрировали более высокое содержание общего белка, альбуминов, альфа- и гамма-глобулинов, а также кетоновых тел. Концентрация бета-глобулинов напротив, была ниже, чем у приплода здоровых коров. Выявленные биохимические изменения крови телят, рожденных больными кетозом коровами, свидетельствуют о нарушении белково-жирового обмена в их организме. У обследованных здоровых животных концентрация кетоновых тел в крови несколько превышала референсные значения в течение всего периода наблюдений, что, вероятно, связанно с низким качеством кормов и недостатком энергии в рационе в последний период стельности и отела. Отметили поступление кетоновых тел с молоком в организм рожденных ими телят. Ключевые слова: альбумины, биохимический анализкрови, глобулины, крупный рогатый скот, нарушение обмена веществ, кетоз, общий белок крови.
45 Ипполитова Т.В., Хомутинникова Ю.А. Особенности альфа ритма головного мозга немецкой овчарки с рождения до полового созревания
Изучали изменения альфа ритма головного мозга щенков немецкой овчарки в 7, 14, 21, 90-дневном возрасте и после полового созревания. Впервые 3 недели жизни он был низкочастотным, а в последующем – высокочастотным. Учащение альфа ритма на электроэнцефалограмме, характерное для созревания мозга человека, проявлялось у собак в незначительной степени. Ключевые слова: альфа ритм, собака, немецкая овчарка, электроэнцефалография.
49 Мима К.А., Бурмакина Г.С., Васильев А.П., Казакова А.С., Дубровская О.А., Малоголовкин А.С., Колбасов Д.В. Сравнение методов серологической диагностики африканской чумы свиней
Сравнили различные методы серологической диагностики африканской чумы свиней: иммуноферментный анализ (ИФА, Ingenasa), иммуноблоттинг на основе рекомбинантного белка р30 (ИБ р30, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии) и очищенного вирусного антигена (ИБ МЭБ), реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии) и иммунопероксидазный тест (ИПТ). Все перечисленные методы проявили высокую специфичность (за исключением ИПТ, специфичность которого составила 66,7 %), но различались по чувствительности. Установили, что иммуноферментный анализ выявляет сывороточные антитела у экспериментально зараженных домашних свиней и кабанов не ранее 14-х суток, а оба варианта иммуноблоттинга (ИБ р30 и ИБ МЭБ) – на 6 – 8-е сутки после заражения. Использование РНИФ, ИБ р30 и ИБ МЭБ в протестированных модификациях, позволяет проводить более раннее выявление антител для подтверждения сомнительных результатов ИФА. Для реализации стратегий мониторинга в эндемичных и неблагополучных по АЧС территориях рекомендованы различные иммунологические тесты, основанные на выявлении антител к вирусу АЧС. Ключевые слова: африканская чума свиней, иммуноблоттинг, иммунопероксидазный тест, иммуноферментный анализ, реакция непрямой иммунофлюоресценции, серологическая диагностика.
ИЗ ИСТОРИИ ВЕТЕРИНАРИИ
55 Никитин И.Н. Формирование и развитие государственной ветеринарной службы России
Ключевые слова: АЧС, африканская чума свиней, ТФ ИФА, иммуноферментный анализ, антиген.
Keywords: ASF, African swine fever, ELISA, enzyme linked immunosorbent assay, antigen.
Введение. Африканская чума свиней (АЧС) – контагиозная септическая болезнь всех видов домашних свиней и диких кабанов. Болезнь проявляется остро, подостро, хронически и бессимптомно, и характеризуется лихорадкой, геморрагическим диатезом, воспалительными изменениями паренхиматозных органов [1,2].
В отсутствии эффективных вакцин обнаружение в пробах биоматериала антител или участка ДНК вируса АЧС позволяет с уверенностью говорить об инфекционном процессе, поэтому в лабораторной диагностике заболевания используются как прямые методы, направленные на выявление генетического материала или антигенов вируса, так и косвенные методы обнаружения вирусспецифических антител.
Ежегодно справочная лаборатория по африканской чуме свиней (CISA-INIA, Мадрид, Испания)
Европейского Союза (ЕС) для проверки компетенции и уровня подготовки специалистов диагностических лабораторий ЕС и других заинтересованных стран организует проведение международных межлабораторных сличительных испытаний (МСИ) по диагностике АЧС. Принимающим участие организациям рассылаются зашифрованные панели образцов патматериала и сывороток крови.
Материалы и методы. Образцы: панель замороженных шифрованных сывороток крови в количестве 12 штук, полученная из справочной лаборатории по африканской чуме свиней ЕС. Подробное описание образцов указано в таблице 1.
Для подтверждения результатов методом иммуноблоттинга использовали коммерческие тест- полосы с перенесённым на них разделённым в полиакриламидном геле препаратом частично очищенного цельного вируса (производитель CISA-INIA) в соответствии с инструкцией производителя.
Описание панели образцов
Описание способа заражения
Образец от интактной свиньи
NH/P68 в/м 105ТЦД50/мл +
в/м L60 10 ГАдЕ/мл + Arm07
10 ГАдЕ/мл. Сыворотка получена на 9 день после Arm07
контрольно го заражения
NH/P68 в/м 105ТЦД50/мл +
в/м L60 10 ГАдЕ/мл + Arm07
10 ГАдЕ/мл. Сыворотка получена на 63 день после Arm07
Образец от интактной свиньи
Образец от интактной свиньи
От свиньи, содержащейся в
контакте со свиньями которым в/м инъецировали
LT14/1492 в дозе 10 ГАдЕ/мл
Arm07 10 ГАдЕ/мл
(Португалия)- Arm07 (Армения)
NH/P68 в/м 102 ТЦД50/мл +
Arm07 10 ГАдЕ/мл.
(Португалия)- Arm07 (Армения)
NH/P68 в/м 102 ТЦД50/мл +
Arm07 10 ГАдЕ/мл.
Образец от интактной свиньи
ДПЗ – день после заражения;
ТЦД – тканевая цитопатогенная доза; ГАдЕ – гемадсорбирующая единица
Таблица 2. Серологические исследования
сл. пол – слабоположительно сомн. – сомнительный результат
ЕС - справочная лаборатория по АЧС Европейского Союза РЛАЧС-ИФА – тест система реф. лаб. по АЧС
МЭБ-ИФА – непрямой ТФ ИФА, описанный в Руководстве по диагностике АЧС (раздел 2.8.1., 2012 год) Ingenasa K3 – коммерческий блокирующий ТФ ИФА Ingezim PPA Compac (11.PPA k3), основанный на P72 IDVet – коммерческий ТФ ИФА набор ID Screen, основанный на рекомбинантных P32, P62 и P72
ИБ – иммуноблоттинг, описанный в Руководстве по диагностике АЧС (раздел 2.8.1., 2012 год)
ИЦХ – непрямой иммуноцитохимический метод на основе инфицированных изолятом E70М, согласно протоколу справочной лаборатории по АЧС Европейского Союза
Различия наблюдались только для образца №9, который справочная лаборатория обозначили как слабоположительный. Данный образец отобран на 7 день после заражения, что, сообразно механизму выработки иммунного ответа, является сроком часто недостаточным для успешного образования высокоспецифичных антител в выявляемых количествах. Тест-системы, использующие в качестве компонентов антигена белки, накапливаемые в больших количествах на ранние сроки после интернализации вируса, имеют преимущества при исследовании таких образцов. Например, белок р30 (также называемый p32 или продуктом экспрессии гена CP204L), ответственный за интернализацию вируса в клетку и индуцирующий развитие гуморального и клеточного иммунного ответа в in vitro инфицированных клетках, выявляется на более ранних сроках, чем некоторые другие вирусные белки [5]. Это позволяет тест- системам, направленным на выявление антител к этому белку, иметь более высокую чувствительность на ранних стадиях инфекции, по сравнению с методами, направленными на выявление антител к антигенам очищенного вируса или белкам, продуцируемым на более поздних стадиях инфекции [5]. Так, справочная лаборатория ЕС при исследовании сыворотки №9 получила ложноотрицательные результаты при применении набора Ingezim PPA Compac, использующем в качестве антигена рекомбинантный белок p72, и в методе ТФ ИФА, описанном МЭБ, в котором используется препарат частично очищенного вируса.
Таблица 3. Оптическая плотность субстрата в экспериментальной тест-системе референтной лаборатории по АЧС
| Позиция | Кол. | Ед. изм | Цена | Сумма | Доля |  |  | ||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1. Тест-система для выявления антител к нуклеопротеиду вируса гриппа А конкурентным иммуноферментным | 1 | НАБОР | 24 163,61 ₽ | 24 163,61 ₽ | 3,75 % | ||||||||||||||||||||||||
| 2. Тест-система для выявления антител к вирусу АЧС свиней непрямым иммуноферментным методом в сыворотке и плазме крови, мясном соке свиней, а также в образцах крови на фильтровальной бумаге | 2 | ШТ | 141 775,23 ₽ | 283 550,46 ₽ | 44,02 % | ||||||||||||||||||||||||
| 3. Комплект реагентов для выделения из клинического материала ДНК-сорб-B" 100 определений | 17 | ШТ | 2 203,74 ₽ | 37 463,58 ₽ | 5,82 % | ||||||||||||||||||||||||
| 5. Комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК | 1 | ШТ | 2 517,48 ₽ | 2 517,48 ₽ | 0,39 % | ||||||||||||||||||||||||
| 6. Комплект реагентов для выделения из клинического материала РИБО-сорб" 100 определений | 1 | ШТ | 2 485,30 ₽ | 2 485,30 ₽ | 0,39 % | ||||||||||||||||||||||||
| 7. Тест-система "АЧС " (диагностика африканской чумы свиней) методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени | 19 | ШТ | 11 151,92 ₽ | 211 886,48 ₽ | 32,90 % | ||||||||||||||||||||||||
| 10. Комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала | 2 | ШТ | 2 137,59 ₽ | 4 275,18 ₽ | 0,66 % | ||||||||||||||||||||||||
| 12. Тест-система для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени | 1 | ШТ | 8 152,49 ₽ | 8 152,49 ₽ | 1,27 % | ||||||||||||||||||||||||
| 13. Набор для идентификации бактерий рода Листерия | 1 | ШТ | 9 198,61 ₽ | 9 198,61 ₽ | 1,43 % |
Протокол подведения итогов
| Когда опубликовано | Подать заявку до | |||||||||||||||||||||
| 223-ФЗ - №32009089469 | 17.04.2020 13:41 МСК | 06.05.2020 18:00 МСК |   | ||||||||||||||||||||||||||
| 223-ФЗ - №32009089464 | 17.04.2020 13:41 МСК | 06.05.2020 09:00 МСК | | ||||||||||||||||||||||||||
Посмотреть все закупки заказчика
Карточка будет добавлена в Избранное
В случае публикации текущей закупки, она заменит отслеживаемую будущую, Вы получите уведомление
Понравилась закупка? Оцените свои возможности, примите решение об участии, подготовьте необходимые документы
Вы подали заявку на участие в аукционе?
Допущены к торгам?
Организатор торгов отклонил Вашу заявку и Вы не согласны с данным решением?
Аукцион! Выигрывает тот, кто предлагает наиболее выгодные условия и цену.
Ожидайте результатов аукциона, отслеживайте соблюдение сроков:
Вы победитель? Поздравляем! Предоставьте Заказчику обеспечение исполнения контракта и подпишите контракт
Строго соблюдайте сроки. Соотношение рабочих и выходных дней не принципиально:
Соотношение рабочих и выходных дней принципиально:
Преимущества для Субъектов Малого Предпринимательства и Социально Ориентированных Некоммерческих организаций:
- Сумма обеспечения - до 2% от стоимости контракта.
- Оплата закупки - не более 15 дней с момента подписания документа о приемке.
Возможно увеличение цены контракта до 15%, но не более начальной цены в случаях:
- Если продавец - организация инвалидов
- Если продавец - предприятие уголовно-исполнительной системы
- Товарам/работам/услугам, произведенным на территории государств - членов Евразийского экономического союза
В данной закупке могут принималь участие только организации - субъекты малого предпринимательства и социально ориентированные некоммерческие организации
Установлен запрет на продажу товаров, происходящих из иностранных государств, работ, услуг, соответственно выполняемых, оказываемых иностранными лицами
В отношении участников закупки установлено требование о привлечении к исполнению договора субподрядчиков (соисполнителей) из числа субъектов малого и среднего предпринимательства
Участниками закупки могут быть только субъекты малого и среднего предпринимательства
Читайте также:
