Тест-систем для диагностики вирусных инфекций
УДК: 616.61-036.22:578.7(047.3)(476), 578.4(047.3)(476)
Год издания: 2015
Разработка ПЦР тест-системы для диагностики BK вирусной инфекции
Следует отметить, что зарубежные тест-системы для генодиагностических исследований BK вирусной инфекции имеют достаточно высокую стоимость, что делает их мало доступными для практического здравоохранения. В этих условиях создание отечественной количественной ПЦР тест-системы для диагностики данной инфекции и оценки уровня вирусной нагрузки у пациентов является сегодня актуальной задачей.
Разработку осуществили в несколько этапов, начиная с подбора праймеров, и заканчивая определением аналитических характеристик тест-системы.
Исходя из биологии BK вируса и анализа научной литературы по данной проблеме разработано 2 набора праймеров и зондов, локализованных в различных регионах его генома. Праймеры подобраны к наиболее консервативным участкам генома BK вируса и обозначены как BK-VP3 и BK-T, так как локализованы в участках генома, кодирующих капсидный белок VP3 и большой Т-антиген.
Выполнена оптимизация реакции ПЦР, которая включала два этапа: оптимизацию состава реакционной смеси (ПЦР-буфер, концентрация MgCl2) и подбор условий проведения реакции (температурный профиль и длительность каждого из сегментов цикла).
В качестве положительного контроля и количественного ДНК-стандарта для разработанной тест-системы на базе вектора pUC18 создана плазмида pBK-1,2VT, содержащая вставку размером 1228 пар оснований, кодирующая фрагменты-мишени для обоих наборов разработанных диагностических праймеров.
Концентрацию очищенного препарата плазмиды измеряли спектрофотометрически и определяли число молекул плазмиды. Из исходного препарата pBK-1,2VT готовили серию 10-кратных разведений с концентрацией ДНК от 1х10 6 до 1 ГЭ/мкл. Полученные разведения использовали в качестве матрицы в реакции с праймерами для изучения аналитической чувствительности тест-системы и приготовления ДНК-стандартов. Полученные результаты показали, что порог чувствительности набора в отношении BK вирусов был менее 10 копий/мкл. В качестве ДНК-стандартов выбраны две стандартные концентрации ДНК: 1х10 4 и 10 копий/мкл. Данные стандарты будут использованы как калибраторы при проведении количественной ПЦР для определения уровней ВК вирусной нагрузки в организме пациентов.
Изучение диагностической специфичности и чувствительности разработанной тест-системы проводили в параллельных исследованиях клинического материала - 46 проб клинического материала (24 пробы мочи и 22 пробы сыворотки крови), в которых ранее мультиплексной ПЦР с системой праймеров для выявления BK и JC вирусов было (в 8 пробах) или не было обнаружено (в 38 пробах) наличие ДНК BK и JC вирусов. При использовании созданной тест-системы BK вирус был выявлен во всех 8 положительных пробах. В установленных ранее 32 отрицательных пробах вирус не определялся.
Таким образом, разработанная тест-система для детекции ДНК BK вируса выявила все отобранные положительные и отрицательные пробы без ложноположительных и ложноотрицательных результатов, что указывает на ее 100% диагностическую чувствительность и специфичность.
В ходе полевых испытаний тест-системы с использованием 466 образцов клинического материала, полученного в период с 2011 по 2014 гг. от реципиентов почки, выявлено 42 положительных пробы с уровнем вирусной нагрузки, варьировавшей от 4,2х10 7 до 1,3х10 4 копий/мл.
Созданная ПЦР тест-система для количественного выявления ВК вируса в клиническом материале не имеет аналогов в Беларуси и сопредельных странах-членах ЕАЭС, что указывает на хорошие перспективы ее востребованности на отечественном и зарубежном рынках диагностических средств. Актуальность данной разработки очевидна в связи с активным развитием трансплантации органов и тканей в последние годы. Кроме того, она может найти широкое использование для диагностики полиомавирусных осложнений при ряде заболеваний, сопровождающихся иммунодефицитными состояниями, с целью количественной оценки уровня ВК вирусной нагрузки и коррекции проводимой терапии (например, в онкологии, при обследовании пациентов со СПИД и др.).
Область применения: лабораторная диагностика вирусных инфекций, трансплантология, онкология.
Рекомендации по использованию: разработанная тест-система рекомендуется для использования в специализированных лабораториях учреждений здравоохранения республки, занимающихся диагностикой вирусных инфекций.
Предложения по сотрудничеству: консультативная и техническая помощь по лабораторной диагностике полиомавирусных инфекций, молекулярному типированию, дифференциации возбудителей и биоинформационному анализу полученных результатов.
ОРВИ и грипп имеют респираторные симптомы и общие. Их можно распознать по катаральным признакам со стороны дыхательных путей и общей симптоматике, характерной для большинства заболеваний.
Современные методы диагностики данной группы заболеваний
Различают несколько видов диагностики, которые различаются по особенностям проведения и методу выявления возбудителя. Это:
- экспресс-методы;
- серологическая диагностика;
- вирусологическая диагностика.
Первая группа - экспресс-методики. Это быстрый способ подтвердить или исключить наличие болезни. Используется метод флюоресценции и ПЦР. Рассмотрим их подробнее.
Изучение флюоресцирующих антител - МФА. Способ основан на определении антигенов к вирусу в эпителиальных клетках носовой слизистой, на конъюнктиве (если есть глазные поражения). Антитела при действии антигена реагируют специфическим свечением, которое легко заметить при микроскопическом исследовании. Этот параметр считается маркером диагностики и является основой для подтверждения результата. Способ имеет диагностическую ценность начиная с 3 и заканчивая 5 днем заболевания. Чувствителен к таким антигенам: вирус гриппа типа А, В, вирус парагриппа, аденовирусы и возбудитель РС-инфекции. Это удобный и быстрый метод, не требующий особых ресурсов, который часто применяется в ходе диагностики.
Метод полимеразно-цепной реакции базируется на основе обнаружения участков нуклеиновых кислот генетического материала вируса и определении их групповой принадлежности по этому критерию. Методика имеет высокую диагностическую ценность, является современным и качественным способом подтверждения заболевания. Считается “золотым стандартом” диагностики, так как не дает ложных результатов и является специфическим для определения конкретных патогенов, широко применяется в стационарных и амбулаторных условиях.
Вирусологические методики основаны на чистом выделении вирусных микроорганизмов и их конкретных штаммов, за чем следует их прикрепление к клеточным культурам в лабораторных условиях. Далее следует определение вида вируса с помощью ПЦР или других реакций. Метод требует значительных ресурсов, довольно длительный и трудоемкий. Его ценность заключается в получении эпидемиологических данных и основе для научных работ. То есть, детальное изучение вируса, частоты его распространения позволяет прогнозировать эпидемическую картину, создавать вакцины. Для исследования берется мазок из носа и носоглотки. Материал пригоден в течении 3-5 дня заболевания. С помощью вирусологических методов можно определить такие возбудители:
Серологические методы диагностики - это ретроспективное исследование, которое дает точные данные относительно стадии процесса, степени активности и типа возбудителя. Используется для эпидемиологических целей.
Для анализа используется сыворотка крови, в которой необходимо определить количество и виды антител. Используется известный антиген вируса. При возникновении реакции с материалом пациента формируются иммунные комплексы антиген-антитело, что подтверждает диагноз. Для диагностики также важен прирост титра антител, для чего используются парные сыворотки.
Результат имеет высокую точность и может определиться даже если все другие методы не дали результата, так как имеет высокую чувствительность. особенно важно использование метода для стертых форм с минимальными клиническими проявлениями. Сыворотки для анализа берутся в начале болезни, а также через 10-14 дней после её завершения. Используется метод для подтверждения наличия в организме таких возбудителей: вирусы гриппа А, В, возбудители парагриппа, аденовирусы и РС-вирусы.
Наличие вируса гриппа можно подтвердить с помощью РТГА - реакции торможения геммааглютинации. Метод основан на свойстве снижения гемагглютинирующих способностях вируса, если в крови есть антитела к нему. Для этого используется кровь с эритроцитами, антиген. Препараты крови берутся парными, в начале болезни, и в период выздоровления. Метод имеет высокую диагностическую ценность, точный и чувствительный.
Виды исследуемого материала и особенности сдачи
Для диагностики используются смывы из носа, мазки из носовых ходов, носоглотки, а также препараты крови.
Забор мазка и смыва проводит медицинский персонал. Он следит за тем, чтобы препараты строго соответствовали должной локализации. Забор проходит в чистых условиях, стерильными инструментами и в стерильную тару. До того, как взять мазки пациента просят высморкаться, чтобы очистить носовые ходы от слизи. Зонд вводится легко, на глубину 2-3 см. Проводится стандартное движение по нижней части носового хода и под раковиной носа. Необходимо, чтобы забор происходит в современной клинике, где есть возможность правильно хранить и транспортировать собранный материал в короткий срок до лаборатории.
Мазок из глотки берется по похожей методике, чтобы затронуть те участки слизистой, на которой скапливается возбудитель. Перед забором необходимо легко прополоскать рот, чтобы взятый материал был чистым. Желательно забирать материал на 3-й день после начал болезни.
Нормы и отклонения от них, расшифровка результатов
Экспресс-тест дает результаты сразу после диагностики, его расшифровка не вызывает трудностей, так как определяет наличие вируса или его отсутствие в организме.
Серологические реакции более сложные и могут расшифровываться по разному: наличие антител класса М говорит об острой стадии процесса, антитела G формируются при хроническом течении.
Сроки готовности результатов
Результаты исследования готовы на 1-2 день после сдачи. Экспресс-тест дает результат сразу. Серологические методы требуют больше затрат времени для сравнения титров антител. Более быстрые методы важны для диагностического процесса, а те, что более затратны - для эпидемиологического и научного исследования.
Скорость диагностики зависит от правильности сдачи препаратов, условий лаборатории, качества реактивов.
Вовремя сданный анализ позволяет точно и быстро определить диагноз. Это - залог правильного и эффективного лечения. Если болезнь запустить, она грозит осложнениями, которые особенно опасны, если у человека грипп. Это актуально для детей, пожилых людей, беременных женщин и лиц с дефицитом иммунной системы, ведь осложнения чаще всего проявляются у них.
Лаборатория АО "СЗЦДМ" предлагает услуги, обеспечивающие комплексное и преемственное лабораторное обследование пациента
Диагностика В медицинских центрах АО "СЗЦДМ" проводят качественные диагностические исследования всего организма
Лечение Наши медицинские центры ориентированы на обслуживание пациентов в амбулаторном режиме и объединены единым подходом к обследованию и лечению пациентов.
Реабилитация Реабилитация - это действия, направленные на всестороннюю помощь больному человеку или инвалиду для достижения им максимально возможной полноценности, в том числе и социальной или экономической.
Выезд на дом Внимание! Действует акция "Выезд на дом - 0 рублей"
Профосмотры АО "СЗЦДМ" проводит профилактические осмотры работников, которые включают в себя - комплексы лечебных и профилактических мероприятий, проводимых для выявления отклонений в состоянии здоровья, профилактики развития и распространения заболеваний.
Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.
Что предлагает ВОЗ
Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.
Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.
Как работает ПЦР-тест
Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.
Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.
В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.
Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.
Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.
Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.
Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.
Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.
На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.
По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.
Новые разработки за рубежом
Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.
Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.
Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.
FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.
Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.
Фоновое изображение: Realstock | Shutterstock.com
Что должен включать набор для выявления РНК коронавируса в образцах? Три компонента: реагенты для экстракции РНК, реагенты для обратной транскрипции, то есть перевода РНК в ДНК, и реагенты для ПЦР. Последний компонент состоит из ферментов, буфера и праймеров — олигонуклеотидов, комплементарных каким-либо последовательностям генома коронавируса.
Однако обычно тест-системы включают еще и внутренний контрольный образец — молекулу РНК, защищенную от действия нуклеаз, которую при анализе добавляют в образец на первой стадии — стадии выделения, чтобы она вместе с мишенью проходила все этапы лабораторного исследования и в конце дала свой собственный сигнал, который покажет, что на всех этапах все было хорошо.
У уже зарегистрированного набора ЦСП чувствительность как раз 10 3 в мазках со слизистой (так указано в инструкции к набору, которая имеется в распоряжении редакции). По нашей информации, примерно такой же чувствительности добиваются в разработке НИЦ им. Н.Ф. Гамалеи.
Чем плоха низкая чувствительность? Возможна ситуация, когда пациент явно инфицирован, но концентрация вируса в пробе у него ниже, чем 10 5 . В этом случае результат тестирования будет отрицательным. Тест не выявит начало заболевания, либо слишком рано будет принято решение о том, что выздоравливающий пациент больше не выделяет вирусы и не может никого инфицировать. А он ходит по улице, и он заразен. (По данным китайских исследователей, выделение вируса может продолжаться до 37 дней.)
С ложноотрицательными результатами теста разобрались. Теперь о ложноположительных срабатываниях, то есть о специфичности. Любой тест может показывать у некоторого числа здоровых людей заболевание. В спокойной обстановке в этом нет ничего страшного, поскольку можно десять раз перепроверить анализы у каждого пациента. Совсем другое дело — ситуация эпидемии. В этом случае диагностика опять выдает управленческим структурам недостоверную информацию о количестве инфицированных, принимается решение о проведении клинических и лечебных мероприятий в отношении пациентов, которые вообще не болеют. Ресурсы здравоохранения направляются на ложные цели.
Однако это вопрос про праймеры для реакции амплификации. Если праймеры специфичны именно к этому вирусу, то все хорошо, если же праймеры могут отжигаться на нецелевую мишень, то получим ложнопозитивный результат. К сожалению, саму последовательность праймеров многие разработчики — не все — держат в секрете, поэтому редакция не располагает информацией, на гены каких именно белков и на какие участки этих генов они созданы.
С другой стороны, ВОЗ пишет, что в настоящее время известно о циркуляции среди населения четырех сезонных коронавирусов (HCoV-229E, -OC43, -NL63 и -HKU1), которые, как правило, вызывают заболевания верхних дыхательных путей — от легких до средней тяжести. Поэтому испытания теста должны проводиться на как можно более широкой панели, чтобы отсечь ложные срабатывания. Желательно, чтобы образцы были от пациентов, либо в панель должны быть включены вирусы, генетически наиболее близкие этому коронавирусу и достаточно широко распространенные.
Сколько именно неспецифичных срабатываний дает тест, сказать нельзя, но из общих соображений эксперты называют цифру до 10%.
По тест-системам, разрабатываемым другими группами, у редакции достоверной информации нет.
Теперь самый болезненный для общества вопрос: какие структуры могут диагностировать коронавирус SARS-CoV-2 в России? И вопрос, который следует из первого: будут ли использованы разработки тех организаций, которые мы перечислили выше?
Что это значит? Это значит, что СанПин позволяет работать с вирусами из II группы методом ПЦР в условиях III–IV группы. Так, например, работают по всей стране с ВИЧ, который тоже отнесен ко II группе. В том случае, если опасный патоген не собираются наращивать в культуре или инфицировать им лабораторных животных, а исследуют его генетический материал, пробирку с образцом открывают в ламинарном шкафу и добавляют в нее вещество, разрушающее вирус (например, гуанидинизотиоцианат). После этого фактически речь идет не о вирусе, а о его белках, ДНК или РНК.
Тем не менее сейчас круг лабораторий, которые могут диагностировать инфекцию SARS-CoV-2, ограничен Роспотребнадзором.
Понятно, что если коммерческие лаборатории в России захотят проводить тестирование на SARS-CoV-2, то они смогут воспользоваться любой тест-системой, которая получит регистрационное удостоверение. Однако неясно, как в этом случае будет выстраиваться взаимодействие с системой Роспотребнадзора.
Отсутствие конкуренции — это рай?
Когда в мире произошла вспышка атипичной пневмонии, в 2003 году четыре организации в России разработали ПЦР-тесты на выявление возбудителя — коронавируса SARS-CoV. Роспотребнадзор издал приказ о сравнительных испытаниях. Был очень быстро получен вирус, и все разработчики могли испытывать на нем свои системы. Сравнительные испытания проводились в 48 ЦНИИ МО РФ, панели контрольных образцов были зашифрованы. Затем результаты всех тестов вскрыли и сравнили.
Довольно большая разница с тем, что происходит сейчас, не так ли?
Все наши источники сходятся в том, что нужно дать возможность работать с клиническим материалом и применять свои тест-системы и государственным и коммерческим игрокам этого рынка. Но сейчас в условиях распространяющейся эпидемии только структуры Роспотребнадзора (и то не все) имеют эксклюзивное право на получение всех федеральных денег по этой тематике на исследования, разработку вакцин и тестирование препаратов, диагностику всех инфекционных материалов в сети своих организаций.
Как мы написали выше, мы не получили ответа от Роспотребнадзора на наш официальный запрос на информацию. В таком же положении находятся все СМИ в стране. Но мы открыты к сотрудничеству и с удовольствием опубликуем ответы на наши вопросы. Предварительно проверив, разумеется.
- Специальность ВАК РФ 03.00.06
- Количество страниц 239
- Скачать автореферат
- Читать автореферат
Оглавление диссертации доктор биологических наук Чирков, Сергей Николаевич
Глава 1. Иммунохимические методы определения вирусов растений
Метод иммуноферментного анализа (ИФА)
Метод иммунохроматографии (ИХА)
Глава 2. Молекулярные методы определения вирусов растений
Молекулярно-гибридизационный анализ (МГА)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
ПЦР в реальном времени
Глава 3. Разработка и усовершенствование методов препаративного 51 выделения вирусов растений и получение моноспецифических анти сывороток
Препаративное выделение вируса кольцевой пятнистости малины 57 Препаративное выделение неповирусов черной кольцевой пятнистости томатов и вируса мозаики арабиса Препаративное выделение латентного вируса кольцевой пятнистости 61 земляники
Препаративное выделение вируса некроза табака
Препаративное выделение вируса А картофеля
Препаративное выделение вируса шарки (оспы) сливы
Препаративное выделение вирусов X картофеля, табачной мозаики,
Y картофеля и крапчатости гвоздики
Препаративное выделение вируса мягкой мозаики фасоли
Определение таксономического положения ВММФ
Глава 4. Разработка тест-систем для иммуноферментного определения 83 вирусов растений
Аналитические характеристики тест-системы для диагностики вируса шарки сливы
Аналитические характеристики тест-систем для диагностики 93 вирусов картофеля
Аналитические характеристики тест-систем для диагностики неповирусов
Аналитические характеристики тест-систем для диагностики вирусов некроза табака, мягкой мозаики фасоли, табачной мозаики и крапчатости гвоздики Разработка и характеристика наборов для диагностики вирусов картофеля и вируса шарки сливы
Глава 5. Определение вирусов растений методом виробактериальной агглютинации (АБВ-тест)
Глава 6. Разработка имунохроматографических тест-систем для диагностики вирусов растений
Конструирование и оптимизация тест-полосок
Определение аналитических характеристик тест-полосок
Апробация тест-полосок для анализа зараженности растений картофеля 126 Разработка набора для внелабораторного применения тест-полосок
Глава 7. Определение вирусов растений с помощью МГА-ИФА-технологии 129 Разработка нового метода экстракции нуклеиновых кислот из вирусных частиц и растений с помощью трихлорацетата аммония Аналитические характеристики МГА-ИФА-технологии и ее применение для определения вирусов растений Разработка ОТ-ПЦР-МГА-ИФА-технологии для диагностики вирусов
Глава 8. Диагностика вируса шарки сливы с помощью полимеразной цепной реакции
Глава 9. Диагностика вирусов и вироида картофеля с помощью ДНКмикроплаты
Глава 10. Применение разработанных методов диагностики для решения 165 практических задач безвирусного растениеводства
Диагностика вирусных инфекций в элитном семеноводстве картофеля 165 Диагностика вирусных инфекций плодовых и ягодных культур для получения безвирусного посадочного материала Применение тест-системы для диагностики вируса шарки сливы в карантинных исследованиях Диагностика вирусных инфекций цветочно-декоративных культур для 173 получения безвирусного посадочного материала
Глава 11. Индукция у растений устойчивости к заражению вирусами
Характеристика противовирусной устойчивости, индуцированной 178 хитозаном
Роль структуры в противовирусной активности хитозана
Изучение механизма противовирусной активности хитозана
Вирусные инфекции культурных растений вызывают ощутимые потери урожая, заметно ухудшают качество сельскохозяйственной продукции и все чаще рассматриваются как серьезная угроза продовольственной безопасности. Эта проблема касается всех продовольственных, кормовых и технических культур, возделываемых в любом регионе мира, и особенно актуальна для вегетативно размножаемых растений, поскольку прогрессирующее накопление вирусов в ряду поколений приводит к полному заражению и вырождению сорта. Ежегодные убытки (когда их удается оценить), причиняемые вирусами одной культуре в определенном регионе, нередко выражаются сотнями миллионов и миллиардами долларов (Кеглер и др., 1986; Hull & Davies, 1992; Waterworth & Hadidi, 1998; Strange & Scott, 2005).
Прогнозируется, что в обозримом будущем роль вирусных заболеваний растений будет возрастать. Глобализация сельского хозяйства, развитие международной торговли продуктами растениеводства и расширение международного обмена семенным и посадочным материалом способствуют интродукции вирусов в новые регионы. Особую опасность в этом отношении могут представлять цветочно-декоративные культуры, часто зараженные комплексом вирусов, в связи с огромными объемами торговли и динамично меняющимся разнообразием видов, вовлеченных в обмен. При этом возникают резервуары новых для данного региона вирусных инфекций, имеющих экономическое значение также для продовольственных и садоводческих культур. Среди обнаруженных за последнее десятилетие новых (emerging) инфекционных болезней растений почти половина имеет вирусную природу. Непрерывно увеличивается число известных вирусов, а глобальное потепление расширяет ареалы насекомых — переносчиков и способствует увеличению их численности (Thresh, 1982; Rodoni, 2007; Boonham et al., 2007).
В настоящее время производство безвирусного семенного и посадочного материала основано главным образом на выбраковке зараженных и отборе здоровых растений с целью их последующего размножения. Очевидно, что для осуществления такого отбора необходимо располагать чувствительными методами массовой диагностики вирусов.
При тотальном заражении сорта, когда отбор неэффективен, растения оздоравливают от вирусов с помощью термотерапии и культуры меристем. Однако, существующие методы оздоровления не гарантируют полного избавления от патогена. Поэтому все этапы получения безвирусных растений должны сопровождаться анализами на присутствие вирусов с помощью высокочувствительных методов лабораторной диагностики вирусных инфекций.
Полученные здоровые растения поддерживаются в условиях защиты от повторного заражения и перед дальнейшим размножением подлежат сертификации, т.е. определению соответствия степени их зараженности требованиям государственных и отраслевых стандартов. Процедура сертификации предполагает тестирование большого количества образцов за короткое время, т.е. требует наличия быстрых и чувствительных методов массовой диагностики вирусных инфекций.
Поскольку безвирусное растениеводство обычно сосуществует с традиционными технологиями, при размножении, безвирусных растений не исключено их повторное заражение ввиду высокого инфекционного фона. Для постоянного мониторинга вирусных инфекций в насаждениях культурных растений (и в окружающей дикорастущей флоре) с целью своевременного выявления и ликвидации очагов инфекции, ограничения распространения вирусов и предупреждения эпифитотий нужны чувствительные методы точной идентификации вирусов.
Хорошо известно, что возделывание устойчивых сортов существенно снижает урон от вирусных заболеваний. Для обеспечения селекционной и генноинженерной работы по выведению новых сортов, устойчивых к вирусам, и изучения механизмов противовирусной устойчивости необходимы высокочувствительные методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.
Важнейшую роль в предупреждении распространения вирусных инфекций играет карантинный контроль продукции растениеводства, особенно импортируемого семенного и посадочного материала. Для предотвращения интродукции вирусов карантинная служба должна располагать быстрыми и чувствительными методами их диагностики.
Таким образом, массовая диагностика вирусных инфекций является ключевой задачей безвирусного растениеводства, успешное решение которой зависит от доступности быстрых, чувствительных, специфичных, легко-выполнимых и недорогих методов детекции и идентификации вирусов. Следует подчеркнуть, что, как показывает весь мировой опыт, затраты на диагностику несоизмеримы с потерями от заражения вирусами и с расходами на искоренение инфекции (Martin et al., 2000).
В России большинство вегетативно размножаемых культур хронически заражено вирусами (Атабеков, 1984). Повсеместное использование зараженного семенного материала является главной причиной того, что Россия занимает одно из последних мест в мире по урожайности картофеля. Отмечается распространение и возрастание вредоносности тяжелых форм вирусного заражения на многих сортах картофеля, находящихся в хозяйственном и торговом обороте. В ряде случаев вызываемые ими потери достигают 90% (Малько и др., 2003; Симаков, 2004; Анисимов и др., 2005). Вирусные заболевания существенно снижают продуктивность плодовых, ягодных и овощных культур, возделываемых в РФ (Кашин, 2001; Белошапкина, 2005; Ахатов и др., 2006). Серьезной фитосанитарной проблемой для нашей страны является интродукция из-за рубежа зараженного семенного и посадочного материала (Санин и Филиппов, 2003).
В то же время, в связи с ростом экономического значения вирусных инфекций, увеличением объема анализов и количества подлежащих определению вирусов существенно возрастали требования к чувствительности и специфичности методов массовой диагностики, обеспечивающих однозначность получаемых результатов. Первостепенное значение приобретала производительность метода, т.е. возможность выполнять большое количество анализов за короткое время, которая определяется не только скоростью выполнения анализа и подготовительных процедур, но и удобством в работе при массовом применении. Все большее внимание уделялось созданию таких методов анализа, которые позволяют одновременно выявлять все известные или, по крайней мере, наиболее вредоносные вирусы данной культуры в одном образце, что существенно ускоряет и удешевляет процедуру лабораторной диагностики. Отчетливо обозначилась потребность в быстрых и простых методах внелабораторного анализа, которые дают возможность проводить анализ самостоятельно, непосредственно в месте нахождения образца, и для применения которых не требуется высокой профессиональной подготовки.
Таким образом, было совершенно очевидно, что для устойчивого развития безвирусного растениеводства в РФ необходима разработка новых высокочувствительных, производительных и надежных методов диагностики и средств для их применения с учетом реальных запросов сельскохозяйственной практики, нормативной базы отрасли и современных тенденций в развитии методов массовой
диагностики вирусных инфекций растений.
Целью наших исследований* являлась разработка высокочувствительных методов массовой экспресс-диагностики вирусных инфекций сельскохозяйственных культур для развития безвирусного растениеводства в РФ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Усовершенствование известных и разработка новых эффективных методов препаративного выделения вирусов важнейших сельскохозяйственных культур с целью получения высокоочищенных вирусных препаратов и моноспецифических кроличьих антисывороток с высоким титром; >
2) Разработка методов лабораторной диагностики вирусных инфекций картофеля, плодовых, ягодных, овощных и цветочно-декоративных культур на основе иммуноферментного анализа, полимеразной цепной реакции и дот-гибридизации;
3) Разработка методов внелабораторной диагностики вирусных инфекций на основе реакции агглютинации и иммунохроматографического анализа, а также наборов для иммуноферментного определения основных вирусов картофеля и вируса шарки сливы;
4) Практическое применение разработанных методов и средств диагностики вирусных инфекций для оздоровления, контроля качества и сертификации семенного и посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных и цветочных культур, а также для изучения распространенности ряда вирусных инфекций.
5) Изучение возможности индукции у растений устойчивости к вирусным инфекциям с помощью биогенного элиситора (хитозана).
К настоящему времени разработаны различные методы детекции вирусов, большинство из которых основано на обнаружении вирусспецифических антигенов (иммунохимические методы) или вирусной нуклеиновой кислоты (молекулярные методы) (Cheng et al., 2009). Однако, с учетом поставленных в диссертационной работе задач, целесообразно проанализировать в первую очередь те из них, которые широко используются для массовой диагностики вирусных инфекций растений или имеют необходимый для этого потенциал.
Безусловно доминирующими в лабораторной диагностике вирусов являются метод иммуноферментного анализа (ИФА), различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР) и молекулярно-гибридизационный анализ (МГА) ввиду их высокой чувствительности, специфичности и производительности. Для одновременного выявления нескольких патогенов в одном образце предложены различные технические решения, из которых наиболее перспективным представляется развитие чиповой технологии. Ведущую роль среди методов внелабораторной диагностики играет в настоящее время метод иммунохроматографии (ИХА) в пористых мембранах (тест-полосках).
Таким образом, предметом данного обзора является сопоставление аналитических характеристик, диагностического потенциала и ближайших перспектив этих методов для массовой диагностики вирусных инфекций растений.
Читайте также:
