Структура вируса клещевого энцефалита

Входит в состав семейства Togaviridae, объединяющего большую группу плюс- РНК- вирусы. Название “Тогавирусы” отражает особенности внешней липопротеидной оболочки, в которую, как в мантию (тогу), завернут нуклеокапсид. Интересна история обнару­жения вирусов этой группы. Эпидемиологи установили, что многие вирусы, вызывающие болезни позвоночных животных, переносятся клещами или комарами. Тогавирусы, патогенные для человека, обычно эндемичны для различных видов животных и передаются человеку случайно – через укус какого- либо членистоногого переносчика. Вирусы этой группы были названы арбовирусами

Серологически Тогавирусы поделены на 2 группы – альфавирусы и флавивирусы, причем среди них встречаются и возбудители, не являющиеся арбовирусами, например, вирус краснухи, отнесенный к флавивирусам.

Вирион. Обязательным компонентом вирионов тогавирусов является липопротеидная оболочка, формирующаяся из плазматиче­ской мембраны зараженной клетки. Внутри этой оболочки нахо­дится капсид икосаэдрической формы, содержащий вирусную РНК. В состав вириона входят 4 вирус - специфических полипептида, три из которых – это гликопротеиды, находящиеся на поверхности вириона и погруженные в двойной слой липидов. Все вместе они и образуют оболочку вириона. Четвертый белок – это белковый компонент нуклеотидной сердцевины.

Вирусы получают оболочку при прохождении через мембрану клетки хозяина. Клетка не лизируется, но, в конце концов, клетки теплокровных животных, зараженные вирусом, погибают. Напротив, в клетках членистоногих развивается персистентная инфекция, при которой в течение длительного периода происходит продукция вирионов, не разрушающая клеток. Это соответствует природной ситуации с вирусами, при которой пребывание вируса в клетках членистоногого не наносит последним видимого вреда.

Геномпредставлен одной молекулой РНК; она обладает инфекци­онными свойствами и в бесклеточной системе ведет себя как м-РНК, поэтому Тогавирусы относятся к числу + РНК-вирусов.Репродукциявирусов происходит полностью в цитоплазме заражен­ной клетки. Вслед за адсорбцией, проникновением и высвобожде­нием из оболочки РНК вириона действует как собственная м-РНК и кодирует продукцию РНК- полимеразы и структурных белков, которые будут затем включены в нуклеокапсид и оболочку полного вириона.

Клещевой энцефалит(синонимы: энцефалит русский весенне-летний, энцефалит таежный, энцефалит эндемический, клещевой весенне-летний менингоэнцефалит)– острая природно-очаговая инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи.

Эпидемиология.Клещевой энцефалит – типичная природно- очаговая зоонозная инфекция, возбудитель которой передается клещами родаIxodes(виды:Ixodespersulcatus,Ixodesricinus).

Цикл развитияклещей включает 4 стадии, 3 из них – личинка, нимфа и имаго – нуждаются для продолжения жизненного цикла в крови теплокровных. Естественно, что в циркуляцию вируса, таким образом, может быть вовлечено большое количество млекопитаю­щих и птиц. Однако постоянным и весьма опасным резервуаром инфекции являются сами клещи, передающие вирус трансовари­ально. Одна самка клеща может отложить несколько тысяч яиц, и даже небольшая часть их, трансформировавшись через стадии личинки и нимфы в имаго, способна обеспечить сохранение вируса в следующих поколениях. Поэтому зараженные вирусом клещи с исключительным постоянством обнаруживаются в эндемичной местности. Сезонность инфекции определяется периодом активно­сти перезимовавших в лесной подстилке самок, который длится от схода снега и появления первой травы до наступления жары. Погод­ные колебания могут существенно менять продолжительность этого периода и влиять на численность самого переносчика.

Патогенез и клиника. Слюна зараженного клеща содержит вирус. При присасывании хоботок клеща глубоко погружается в кожу, вокруг него образуется своеобразная цементоподобная пробка, и клещ может несколько дней находиться на теле, будучи прикреп­ленным. Кровососание клещей происходит по принципу насоса, сменой всасывания крови и введением в ранку слюны. Таким образом, в организм человека может попасть значительное количе­ство вируса.

Первичное размножение вируса происходит в месте укуса, однако, вирус быстро проникает в лимфу, затем в кровь. Вирусемия – кратковременный, но постоянный этап патогенеза этой болезни, завершает так называемую висцеральную фазу, за которой следует проникновение вируса в ЦНС и поражение различных ее отделов – невральная фаза патогенеза. Если зараженные клещи присасываются к дойным козам, то вирус может попасть в молоко. Вирус не выдер­живает кипячения, но при употреблении в пищу сырого козьего молока может произойти заражение. Вирус не разрушается пищева­рительными ферментами, чья активность в значительной мере нейтрализуется богатым лактоглобулинами и жиром молоком, размножается в стенке кишечника, попадает с лимфой в кровь и затем в ЦНС.

Клиника.Примерно у 2/3 подвергшихся присасыванию вирусо­форных клещей отмечается субклиническое течение с формирова­нием иммунного ответа. Инкубационный период составляет 7-14 дней. Инфекция начинается остро, с озноба и повышения темпера­туры до38-39 0 .

Лихорадочный период продолжается от 3 до 14 дней. У 10-20% заразившихся спустя 8 (иногда до 20) дней после стихания темпера­туры развивается симптоматика со стороны ЦНС: менингит (50-60% случаев), менингоэнцефалит (30%) и у 5% может развиться менин­гоэнцефаломиелит.

При поражении ЦНС иногда развиваются симметричные вялые парезы и параличи верхних конечностей и шейно- плечевой муску­латуры, заканчивающиеся атрофией пораженных мышц. Наиболее драматические исходы при КЭ связаны поражением черепно-мозговых нервов, чаще VII,IX,X,XIиXIIпары.

Иногда наблюдается двух волновое течение инфекции: вначале 3-7 дней лихорадки, затем 7-14 дней безлихорадочного периода (апи­рексии) и вновь повышение температуры. Такое течение характерно для заболевания, возникшего при употреблении в пищу молока зараженных коз.

Диагноз.В начале болезни возможно выделение вируса из крови и спинномозговой жидкости путем введения этих субстратов в мозг маленьким белым мышам (6- дневным). Вирусный антиген может быть обнаружен с помощью иммуноферментного анализа, а вирус­ный геном – в полимеразной цепной реакции.

Антитела удобнее всего выявлять в простой реакции торможения гемагглютинации (в первые дни – IgM, с конца первой недели –IgI).

Клиническая и лабораторная диагностикаКЭ представляет опреде­ленные сложности в связи с тем, что эндемичные очаги этой инфек­ции одновременно являются природными очагами болезни Лайма (Лайм - боррелиоз) и при присасывании клеща человек может заразиться либо тем, либо другим возбудителем или даже получить смешанную инфекцию. Зараженность клещей бореллиями выше и, соответственно, число заболевших достаточно велико. Следова­тельно, в каждом случае заболевания, возникшего после присасыва­ния клещей, необходимо точно определить, каким из возбудителей оно вызвано, так как схема лечения этих инфекций принципиально различается: для лечения Лайм - бореллиоза применяются антибак­териальные препараты, которые неэффективны при КЭ.

Профилактикавключает две группы мероприятий: специфическая профилактика с помощью вакцин и иммуноглобулина, и комплекс мер по ограничению численности переносчика и предотвращения его присасывания.

Специфическая профилактика. Иммунизация убитой вакциной. Предусмотрено трехкратное введение: первое, спустя4недели второе, после интервала в 11 месяцев проводят третье введение вакцины. Ревакцинацию проводят спустя 3 года.

После присасывания клеща рекомендовано введение специфиче­ского иммуноглобулина. Предполагается, что эта мера может предотвратить развитие инфекции в 6 из каждых 10 случаев по­тенциального заражения. Повторное введение этого же препарата менее эффективно.

Иксодовые клещи – обитатели леса, их популяция в природе поддерживалась исключительно дикими животными. Однако в последнее десятилетие произошли необратимые процессы, являю­щиеся следствием нарушения правил рационального использования лесов и пастбищ: неконтролируемый выпас скота, стихийное заселение лесных участков вблизи городов предоставили клещам новый источник питания – домашних животных. Каждая самка иксодового клеща, напитавшись кровью и отпав вблизи жилья, может дать потомство, насчитывающее сотни особей, часть из которых может быть, заражена вирусом. Таким образом, вокруг городов и на их территории происходит интенсивное формирование вторичных очагов обитания переносчика и, соответственно, перено­симого им вируса. В этих условиях затруднено осуществление эффективных мер, способных предотвратить возможность нападе­ния клещей на человека.

1Для этого вируса приняты следующие международные аббревиатуры:HAV- гепатита А вирус;HAAg- гепатита А антиген; анти -HAV- антитела кHAV(могут относиться кYgMилиYgF).

2Принятые ВОЗ аббревиатуры, касающиеся этого вируса.

HBV- гепатита В вирус;

HBsAg- гепатита В поверхностный антиген;

HBcAg- сердцевинный (core) антиген вируса гепатита В;

HBeAg- растворимый антиген, присутствующий вcore, и обнаруживаемый лишь при активной форме болезни.

Среди переносчиков инфекционных заболеваний человека клещи занимают второе место после комаров: на сегодня выявлено не менее трех вирусных, 22 бактериальные и несколько протозойных инфекций, которые переносятся иксодовыми клещами. Ситуация зачастую осложняется тем, что при укусах клещи способны передавать человеку одновременно разные виды бактерий, вирусов и простейших, вызывая смешанные инфекции, часто протекающие в более тяжелых формах. Дополнительный риск заражения возникает из-за возможной циркуляции патогенов в сельскохозяйственных и домашних животных (например, инфекционные агенты могут сохраняться в молочных продуктах), а также при переливаниях крови и трансплантации органов.

Наиболее опасными среди инфекций, переносимых клещами, считаются клещевой энцефалит, иксодовый клещевой боррелиоз, эрлихиоз, риккетсиоз и бабезиоз. Для России наиболее социально значимыми инфекционными агентами являются боррелии и, конечно же, вирус клещевого энцефалита, о котором пойдет речь ниже.

В 30-е годы XX века шло интенсивное освоение Дальнего Востока: строились дороги, вырубались леса, из-за напряженных отношений с Японией в тайге дислоцировались крупные военные части. Врачи, работавшие в то время в Приморском крае, стали регулярно сообщать о неизвестной тяжелой болезни, поражающей как местных жителей, так и военных. Заболевание, считавшееся новой разновидностью тяжелого гриппа, сопровождалось резким повышением температуры и часто приводило к параличам и даже гибели заболевших.

Правильно диагностировать неизвестную болезнь удалось лишь в 1935 году местному врачу А. Г. Панову. Заболевание оказалось воспалением мозга, то есть энцефалитом, похожим по симптомам на описанный ранее японский энцефалит. В 1936 году врачи дальневосточной пастеровской станции пытались выделить возбудителя заболевания, вводя мышам в мозг эмульсию мозга людей, погибших от энцефалита. Но, несмотря на то, что у мышей появлялись признаки заболевания, исследования не увенчались успехом.

В январе 1937 года военные медики обратились в Наркомздрав СССР, где и было принято решение об организации на Дальний Восток научной экспедиции под руководством Л. А. Зильбера. В тяжелых полевых условиях была развернута настоящая вирусологическая лаборатория. Ученые свою задачу выполнили: патоген, вызывающий тяжелые заболевания центральной нервной системы, был успешно выделен и описан. Кроме того, была четко установлена определяющая роль иксодовых клещей в передаче инфекционного агента. Выяснилось, что источником заражения клещей служили дикие позвоночные животные, на основе чего были разработаны рекомендации по необходимым профилактическим мерам.

Лев Александрович Зильбер (1894–1966) — один из основоположников медицинской науки в СССР. С его именем связаны фундаментальные исследования изменчивости у бактерий и природы иммунитета, организация первых в стране вирусологических центров, создание и экспериментальная разработка вирусо-генетической теории происхождения опухолей, а также совершенно нового направления — иммунологии рака.

За работу по выявлению возбудителя и переносчика весенне-летнего энцефалита в 1937 г. был награжден премией Наркомздрава СССР, но в том же году арестован по ложному обвинению, что экспедиция, которую возглавлял Зильбер, тайно распространяла японский энцефалит на Дальнем Востоке, и освобожден лишь через полтора года. В короткий промежуток времени между освобождением и новым арестом работал над монографией об эпидемических энцефалитах, подготовил несколько статей.

К сожалению, это поистине блестящее открытие, ставшее важной вехой в истории вирусологии, не обошлось без жертв среди самих участников научной экспедиции. Так, М. П. Чумаков — будущий академик и создатель Института по изучению полиомиелита — перенес тяжелейшую форму инфекции, перешедшую у него в хроническую пожизненную форму; последствием заболевания у В.Д. Соловьева стала шестимесячная слепота.

Что на сегодня известно о вирусе клещевого энцефалита (ВКЭ)? Вирус относится к достаточно старому в эволюционном плане семейству флавивирусов (Flaviviridae), включающему более 70 вирусов животных и человека, в том числе такие опасные, как вирус желтой лихорадки, японского энцефалита, вирус лихорадки Денге и вирус гепатита C.

Основным природным резервуаром ВКЭ служат мелкие млекопитающие (полевки, мыши, насекомоядные). Вирус способен заражать животных и размножаться в их организме, однако заболевание протекает у них зачастую без видимого вреда для здоровья. Переносчиками вируса являются клещи, питающиеся кровью лесных зверьков, — европейский лесной клещ, таежный, луговой клещи, а также ряд других, более редко встречающихся видов. ВКЭ может размножаться и в их организме. Точно не известно, был ли вирус первоначально связан только с клещами, или только с позвоночными животными, но в процессе эволюции он приспособился к существованию в организмах как тех, так и других.

В настоящее время вирус клещевого энцефалита встречается в лесных регионах по всей территории Евразии от Атлантического океана до Тихого, причем в целом область его распространения совпадает с ареалами европейского лесного и таежного клещей. В последние десятилетия ареал ВКЭ неуклонно расширяется, что связано с усилением хозяйственной деятельности человека. Так, заброшенные лесные вырубки зарастают мелкими кустарниками и заболачиваются, что создает идеальные условия для обитания мелких млекопитающих и связанных с ними клещей.

В Сибирь вирус клещевого энцефалита мог попасть с Дальнего Востока; не исключено также, что природные очаги заболевания существовали здесь задолго до появления человека.

В Институте химической биологии и фундаментальной медицины были исследованы 95 штаммов вируса клещевого энцефалита из коллекции Института систематики и экологии животных СО РАН, выделенных от взрослых особей таежного клеща, собранных с растительности в восточной части Новосибирской области в 1980–2001 гг.

Анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Е, кодирующего белок оболочки вируса, показал, что все штаммы соответствуют сибирскому генетическому типу. С другой стороны, в крови людей, госпитализированных с подозрением на клещевые инфекции, в совместных исследованиях с новосибирскими медиками были обнаружены изоляты ВКЭ, относящиеся к дальневосточному генетическому типу.

Ранее считалось, что этот тип вызывает только тяжелые формы заболевания, тогда как сибирский — преимущественно хронические. Наши исследования, подтвержденные данными других авторов, показали, что вирус дальневосточного генетического типа способен вызывать различные формы клещевого энцефалита, начиная от самых тяжелых и заканчивая стертыми, никак не проявляющимися.

Кроме того, всё большее число людей предпочитает проводить свободное время на природе, отдыхая или работая на приусадебных участках. В той же Новосибирской области около 75% населения проживает на территории, условия которой благоприятны для жизни клещей, здесь же сосредоточена и основная масса летних оздоровительных учреждений, зон массового отдыха, садово-дачных участков.

Геном вируса клещевого энцефалита был расшифрован практически одновременно в нашей стране (в том числе и в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Pletnev et al., 1990) и за рубежом (Mandl et al., 1989). На сегодня выделено три генетических типа вируса, различающихся по своим свойствам: дальневосточный, сибирский и западноевропейский. Такая привязка генетического типа к географическому местоположению достаточно условна, поскольку в одном регионе могут встречаться штаммы, относящиеся к разным типам.

Для вируса клещевого энцефалита, как и для большинства других вирусных инфекций, не существует высокоспецифических методов лечения — в этом заключается его опасность. Лечение всех вирусных заболеваний направлено в основном на стимуляцию иммунитета и устранение внешних симптомов заболевания, а дальше организм должен сам справляться с инфекцией. ВКЭ опасен еще и тем, что способен вызывать хронические формы заболевания, а его последствиями могут быть параличи и инвалидность. Поэтому важнейшим делом в исследовании этого инфекционного агента является разработка методов диагностики и профилактики заболевания.

В клинической диагностике вируса клещевого энцефалита наиболее распространены серологические методы, с помощью которых в крови пациента определяют наличие антител, специфических защитных белков, или наличие самого агента. Однако чувствительность этих методов не слишком высока, к тому же существует вероятность ошибки из-за возможных перекрестных реакций с другими патогенами. Кроме того, с их помощью невозможно получить подробную характеристику самого возбудителя (например, определить его генетический тип).

Молекулярно-генетические методы, направленные на специфическое распознавание генетического материала вируса, обладают более высокой чувствительностью. Особенно это относится к методу полимеразной цепной реакции ** (ПЦР), благодаря которой можно размножить, а потом идентифицировать ничтожное количество наследственного материала вируса, что позволяет провести диагностику в течение первых дней после заражения. Однако при некоторых обстоятельствах достоинства могут переходить в недостатки: генодиагностика ВКЭ молекулярно-генетическими методами благодаря высокой чувствительности может также приводить к ошибкам, обусловленным многочисленными новыми мутациями вирусных геномов, а кроме того, предъявляет высокие требования к чистоте экспериментов.

Живые вакцины — способ стимуляции иммунитета введением в организм ослабленных вирусов, открытый еще в 1796 году английским врачом Э. Дженнером. С тех пор была получена живая вакцина против вируса желтой лихорадки, отличающаяся от высокопатогенных штаммов многочисленными заменами нуклеотидов в геноме; продолжаются поиски ослабленных штаммов флавивирусов Денге, Западного Нила и Лангат для разработки на их основе живых вакцин.

Были предприняты попытки создания живой вакцины и против вируса клещевого энцефалита. В 1957 году в качестве такой живой вакцины было решено использовать ослабленный штамм флавивируса Лангат, вызывающий в организме выработку антител, подобных антителам к ВКЭ. Однако выяснилось, что при внутримозговом введении этот штамм сам становится патогенным и вызывает энцефалиты и атрофию участков мозга без внешних клинических проявлений. В дальнейшем были обнаружены ослабленные штаммы самого ВКЭ, но, к сожалению, все они оказались генетически нестабильными.

Вот трагический пример использования живых вакцин против ВКЭ. В 1969 году от больного, у которого после укуса клеща в течение 4 лет не было клинических проявлений заболевания, но в крови сохранялись высокие титры антител, был выделен ослабленный штамм вируса клещевого энцефалита. Лабораторные исследования выявили его низкую нейровирулентность, после чего были проведены клинические испытания на добровольцах, давшие положительные результаты. В конечном счете ослабленным штаммом ВКЭ было иммунизировано около 650 тыс. человек. Однако 35 вакцинированных получили тяжелые осложнения в виде менингитов и менингоэнцефалитов, причем у 22 из них тяжелые последствия заболевания остались на всю жизнь, а один человек умер. Использование этого штамма в качестве живой вакцины было прекращено (Timofeev, Karganova, 2003).

Ослабленные штаммы вирусов раньше получали путем отбора после длительного культивирования, сейчас же широкое распространение получил метод так называемого сайт-направленного мутагенеза.

В 1993 году появился новый подход к профилактике инфекционных заболеваний — генная иммунизация, основанная на прямом введении в организм генно-инженерной ДНК, рекомбинантных плазмид (векторов-переносчиков), содержащих не весь геном, но отдельные гены возбудителя заболевания.

С помощью подобных манипуляций были созданы живые химерные вакцины, содержащие, например, часть генов вируса желтой лихорадки и часть генов других флавивирусов. При этом в функционально важные участки их геномов были введены точечные мутации, вызывающие ослабление патогенности (Pletnev et al., 2006).

Тем не менее в настоящее время применение ослабленных живых вакцин, в том числе и против ВКЭ, ограничено, поскольку существует вероятность превращения ослабленных штаммов в высокопатогенные штаммы дикого типа. Это происходит потому, что в клетке-хозяине отсутствуют системы коррекции мутаций, которые могут возникнуть в вирусной РНК. Гарантией безопасности таких вакцин могла бы служить утрата больших фрагментов вирусных геномов, однако это приводит к значительному снижению жизнеспособности самих вирусов-мутантов.

Нужно отметить, что исследования флавивирусов, как и многих других патогенов, осложняются их высокой инфекционностью, следствием которой являются строгие требования безопасности, а также дороговизной самих вирусных препаратов. И в этом смысле использование неинфекционных ДНК-копий генома ВКЭ является очень перспективным направлением.

В ИХБФМ был получен ряд генно-инженерных ДНК, содержащих в том числе и полноразмерную ДНК-копию генома вируса клещевого энцефалита (Dobrikova et al., 1996). Конструирование подобных стабильных ДНК-копий вирусных геномов открывает широкие возможности для исследования хода размножения вируса в клетках, изучения функций отдельных вирусных белков и их комплексов.

Учеными из ИХБФМ были сконструированы четыре таких плазмиды, содержащие различные гены одного из штаммов вируса клещевого энцефалита. Для оценки эффекта генной иммунизации привитых мышей заражали летальными дозами того же штамма ВКЭ. В результате оказалось, что некоторые плазмиды обладают определенным защитным эффектом.

Чтобы изучить возможные нежелательные эффекты этих вакцин, плазмиды вводили в различные клеточные культуры. В результате выяснилось, что при увеличении времени культивирования клеток до нескольких месяцев наблюдалась существенная модификация плазмид и встраивание их в хозяйский геном.

Таким образом, несмотря на положительные результаты генной вакцинации, вопрос о применении ДНК-вакцин в настоящее время остается открытым, поскольку препятствием к их использованию также является проблема безопасности. Возможно, преодолеть это препятствие удастся созданием РНК-вакцин с аналогичным принципом действия, для которых не существует риска интеграции в ДНК-геном хозяйской клетки. Но это уже задачи будущих исследований.

Возможно ли полностью избавиться от ВКЭ, например, уничтожив его основных переносчиков, иксодовых клещей? В свое время такая попытка была сделана с использованием печально известного ДДТ, но последствия массовой обработки лесов сильнейшим ядом были поистине ужасающими.

Проведен анализ кодирующих последовательностей генома вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), депонированных в международный банк данных (GenBank). При сопоставлении полипротеиновых структур 113 штаммов ВКЭ, изолированных из разных очагов Европы и Азии, выявлены генотипспецифические сочетания аминокислотных замен. Показано, что штаммы Buzuuchuk из Киргизии и 178–79 из России (Восточная Сибирь) имеют уникальные геномные структуры.

Ключевые слова: КЭ, ВКЭ, генотип, генетическая вариабельность, полипротеин, аминокислотные замены

We have conducted an analysis of encephalitis virus (TBEV) coding sequences that are available via international data bank (GenBank). Upon comparison of polyprotein structures of 113 TBEV strains from various sites from Europe and Asia we have detected combinations of aminoacid substitutions. It was shown that strains Buzuuchuk from Kyrgyzstan and 178–79 from Russia (Eastern Siberia) have unique genomic structures.

Keywords: TBE, TBEV, genotype, genetic variability, polyprotein, amino acid substitutions

Введение

Вирус клещевого энцефалита, передающийся через укусы иксодовых клещей, является причиной тяжелой нейроинфекции, поражающей население более чем 25 стран северной Евразии, включая большую часть территории России [5, 10]. С сентября 2012 года клещевой энцефалит (КЭ) включен в список заболеваний, подлежащих регистрации в Европейском Союзе [5].

Для понимания функционирования природных очагов КЭ, клинических особенностей заболевания, совершенствования средств диагностики, противоэпидемических и противоэпизоотических мероприятий необходим регулярный мониторинг его возбудителя, важной составляющей которого является анализ штаммов и изолятов вирусной РНК.

В соответствии с официально принятой классификацией, признано существование вида — вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) и трех его представительных и эпидемически значимых субтипов: дальневосточного, сибирского и европейского. Эти подтипы вируса соответствуют трем одноименным генотипам [3]: 1 -(дальневосточный с прототипным штаммом Sofjin); 2 -(западный, штамм Neudoerfl) и 3 -(сибирский или , штамм Vasilchenko). Однако есть основания полагать, что официально признанная внутривидовая классификация ВКЭ не является окончательной. Так, одни исследователи считают, что следует различать не один, а три вида ВКЭ [1], а другие предлагают понизить до уровня подвида ВКЭ некоторые официально признанные виды вирусов из комплекса КЭ [6]. Кроме того, нами установлено наличие в природе и других генетических вариантов вируса (генотипы 4 и 5) [2, 3], что само по себе, и вне зависимости от того, какую роль они играют в эпидемиологии КЭ, указывает на необходимость пересмотра классификационной схемы ВКЭ.

Таким образом, изучение генетической вариабельности возбудителя диктуется не только напряженностью эпидемической ситуации в отношении КЭ и разнообразием его проявлений на разных территориях, но также противоречивостью предлагаемых классификационных схем и необходимостью уточнения таксономического статуса вируса КЭ.

Цель исследования

Цель представляемого исследования — оценка генетической вариабельности и выявление генотипспецифических маркеров ВКЭ на основе анализа материалов международной базы данных (GenBank).

Материалы и методы

Материалом для исследования послужили кодирующие полногеномные структуры, фрагменты генома штаммов и изолятов РНК вируса КЭ, депонированные в GenBank по состоянию на сентябрь 2014 года, а также полногеномные структуры вируса ОГЛ (OHF) и штамма ВКЭ Sofjin [4].

Метод исследования: компьютерный анализ с помощью программы MEGA [7].

Первая полногеномная структура ВКЭ была расшифрована в 1988 году (штамм Neudoerflиз Австрии), а депонирована в GeBank в 1996 г. По данным на сентябрь 2014 г. в международном банке (GenBank) зарегистрированы полногеномные последовательности 113 штаммов вируса КЭ, изолированных из разных частей его обширного ареала (таблица 1). Примечательно, что около половины последовательностей (56 или 48,7%), депонированы в 2013 и 2014 годах (до октября 2014 года).

Таблица 1 — Генотипическая принадлежность штаммов ВКЭ с расшифрованными полногеномными последовательностями (на сентябрь 2014 г.)

Австрия, Чешская Республика, Германия,

Норвегия, Швеция, Финляндия

Наибольшая часть этих штаммов (числом 66) относится к генотипу 1 ВКЭ, 27 — к генотипу 2, 18 — к генотипу 3 (рисунок 1). Места их изоляции указаны в табл. 1. Остальные 2 штамма, причем выделенные в одном и том же природном очаге на территории России — в районе Иркутской области, являются представителями генотипа 4 (штамм 178–79, выделен от клещей I.persulcatus) и 5 (штамм 886–84, изолированный от грызуна).

Рисунок 1 — Сопоставление 113 полногеномных структур штаммов ВКЭ с помощью компьютерной программы MEGA [7]

Большая часть полных нуклеотидных последовательностей генотипа 1 (около 40) установлена и соавторами. Эта группа исследователей целенаправленно осуществила сравнительный анализ полных геномов штаммов ВКЭ генотипа 1, различающихся по патогенным свойствам. Ими установлено, что внутри дальневосточного генотипа (авторы именуют его субтипом) между группами штаммов различной вирулентности (выделенных из крови больных с инаппарантной формой заболевания и из мозга умерших от КЭ с очаговой формой) 17 из 3414 аминокислотных остатков (около 0,5%) соотносятся с изменением патогенности в организме человека [8]. В капсидном белке длиной 112 а.о. у ряда штаммов имеется существенная замена в виде делеции аминокислоты в предпоследней позиции (111). По мнению авторов, эта делеция в совокупности с другими заменами, расположенными как в белке С, так и в неструктурных белках NS3 и NS5 может уменьшить вирулентность ВКЭ, приводя к образованию дефектных частиц. Заметим, что наличие в геноме ВКЭ такой делеции обнаружено только у штаммов генотипа 1 и все они (числом 21), изолированы на территории Приморья. Их инвентарные номера: AY169390, GQ228395, EU816450- EU816452, EU816455, FJ997899, , JQ825148, JQ825152, JQ825153 и (Genbank). При построении филогенетических деревьев на основе разных фрагментов генома эти штаммы четко группируются в единый кластер (данные не показаны).

Из представителей дальневосточного генотипа, не имеющих описанной делеции, наиболее интересен штамм (выделен на Дальнем Востоке в 1994 из крови человека), который меняет местоположение на разных филогенетических схемах внутри кластера своего генотипа, примыкая то к группе штаммов с той же делецией, то к другой группе. При сравнении полипротеиновых структур оказалось, что в позиции 108 белка С у штамма (инв. номер в GenBankJQ825147) расположен аланин (А) так же, как у штамма Buzuuchuk(KJ626343) генотипа 3 и штамма 886–84 (EF496662) -прототипа генотипа 5. Ранее эта замена была установлена как строго специфическая для генотипа 5 [2]. и др. [8] отмечают, что штамм образует отдельную ветвь филогенетического древа между штаммами, выделенными от больных с энцефалитной формой заболевания (ЭФЗ), и штаммами от больных с субклинической формой заболевания (СФЗ). Этот штамм отличается от штаммов ЭФЗ наличием ключевых аминокислот в позициях 16 К (аминокислота лизин) и (фенилаланин) в вирусной протеазе NS3, которые характерны для штаммов СФЗ. По мнению и др. именно эти замены — 16K и в вирусной протеазе NS3 — способствуют уменьшению патогенности штаммов дальневосточного субтипа.

Активные перестройки (перемена местоположения) при сопоставлении филогенетических схем, построенных на основе полных геномных структур (ПГС) и на основе разных генов, наблюдаются внутри кластера генотипа 2 (данные не показаны). Это указывает на их очень близкое родство. Весьма вероятно, что причина таких тесных взаимоотношений кроется в длительной эволюционной истории генотипа 2 и существовании на сравнительно более ограниченной, чем весь остальной ареал ВКЭ, территории. По нашему мнению, это также свидетельствует в пользу гипотезы о том, что рекомбинация у ВКЭ, возможно, не редкое событие [2]. Вероятно, наличием более ограниченного ареала сравнительно с генотипами 1 и 3, объясняется и тесное родство генотипа 2 ВКЭ с представителями комплекса КЭ — вирусами турецкого и испанского энцефалитов овец, а также, шотландского энцефаломиелита овец, ареалы которых перекрываются с ареалом ВКЭ. Так, шотландский энцефаломиелит регистрируется во многих европейских странах, хотя чаще встречается в Шотландии, северной Англии и Ирландии, где отсутствуют природные очаги КЭ. В то же время, на фоне этих рассуждений неожиданным представляется следующий факт. При сопоставлении фрагментов гена Е длиной 1419 н.о. (позиции с 37 по 1455) выявляется 100% гомологии между последовательностями четырех штаммов, изолированных на территории России (3) и Беларуси (1). Это алтайский штамм 84.2 (изолирован от клещейI.persulcatus в 2007 г.(HM120875)), два штамма из Иркутской области — и (Citellusundulates-суслик длиннохвостый), 1971 (FJ214154 и FJ214155) и белорусский штамм 265 (I.ricinus, 1940 (GU125718 иAF091014)). Как видим, очаги изоляции гомологичных последовательностей располагаются на значительном удалении друг от друга (например, от Беларуси до Алтая не менее четырех тысяч км.).

При сравнении полипротеиновых структур всех 113 исследуемых штаммов наибольшее количество строго консервативных генотипспецифических аминокислотных замен выявлено для представителей генотипа 2, а именно 63, в то время, как для штаммов генотипа 1 и 3 установлено по 22 таких замены. Это еще одно свидетельство высокой генетической однородности представителей генотипа 2.

Таблица 2 — Аминокислотные замены у штамма Buzuuchuk, не характерные для генотипа 3