Серологическое окно гепатит пцр

Вы можете добавить к заказу еще тесты в течение 7 дней

Гепатит С — заболевание, вызываемое РНК-содержащим вирусом. Вирус может передаваться через кровь, через нестерильные медицинские инструменты, при трансплантации органов и тканей, при половом контакте, от матери к ребенку во время беременности и родов. Он размножается в клетках печени и вызывает развитие острого или хронического гепатита. Вирус гепатита С имеет несколько генотипов, вследствие частых мутаций он устойчив к воздействию механизмов иммунной защиты человека.

Вирусный гепатит С чаще всего протекает бессимптомно. Только в 15% случаев острого заболевания наблюдают тошноту, признаки интоксикации, отсутствие аппетита, желтуха бывает редко. Меньшая часть пациентов переносит гепатит С как острое заболевание и полностью выздоравливает, у большей части инфицированных развивается хронический гепатит С. Длительно текущее хроническое заболевание может привести к циррозу или раку печени.

На старте заболевания начинают образовываться антитела к компонентам вируса, сначала иммуноглобулины М, позже иммуноглобулины G. Специфические антитела к вирусу гепатита С могут быть обнаружены в крови через 3–8 недель после попадания вируса в организм, однако в некоторых случаях они могут отсутствовать в течение нескольких месяцев. В этом случае инфицирование можно подтвердить исследованием крови на РНК вируса гепатита С. После перенесенной инфекции у выздоровевших пациентов специфические антитела сохраняются в течение многих лет с постепенно снижающейся концентрацией и могут обнаруживаться в низком количестве на протяжении всей жизни. Антитела к гепатиту С не защищают от повторного заражения при новой встрече с вирусом.

В группу риска по гепатиту С входят врачи и медсестры, люди, пользующиеся медицинскими и косметическими услугами, наркозависимые, пациенты, которым проводилось переливание крови или пересадка органов, дети, рожденные зараженными матерями-носителями вируса гепатита С.

Анализ на антитела к вирусу гепатита С (HCV), суммарные, позволяет выявить специфические иммуноглобулины, наличие которых говорит о возможной инфекции или ранее перенесенном заболевании. Тест является скрининговым, сдают его обязательно при госпитализации, перед плановыми операциями и во время беременности.

В каких случаях обычно назначают исследование

при обследовании пациентов, готовящихся к плановой госпитализации или операции;
при профосмотрах и диспансеризациях;
при подозрении на контакт с инфицированной кровью или нестерильными медицинскими инструментами;
при появлении симптомов поражения печени;
при обследовании беременных.

Что именно определяют в процессе анализа

Выявляют наличие специфических суммарных антител к вирусу гепатита С методом ИХЛА — модификации иммуноферментного анализа.

Что означают результаты теста

Результат исследования (пример):

Антитела к вирусу гепатита С, сумм	ОБНАРУЖЕНО
Антитела к гепатиту С, подтверждающий тест
Core (антитела к структурным белкам вируса гепатита С)	15.26
NS3 (антитела к неструктурному белку NS3 вируса гепатита С)	0.65
NS4 (антитела к неструктурному белку NS4 вируса гепатита С)	0.02
NS5 (антитела к неструктурному белку NS5 вируса гепатита С)	0/02

Антитела могут быть выявлены у пациентов в нескольких случаях:

пациент болен в настоящее время острым или хроническим гепатитом С;
пациент когда-то перенес гепатит С как острое заболевание и теперь здоров, антитела остались как иммунологическая память о контакте с вирусом;
у пациента редкий случай неспецифической реакции сыворотки крови с используемой тест-системой.

Выявление антител к вирусу гепатита С не означает наличия заболевания и требует дополнительного обследования пациента. В случае положительного ответа необходима консультация лечащего врача или врача-инфекциониста и назначение дополнительных тестов. Может быть назначено ПЦР-исследование на HCV (выявление РНК вируса гепатита С в крови пациента), биохимические маркеры — АЛТ, АСТ, ГГТ, щелочная фосфатаза, билирубин, общий анализ крови с лейкоцитарной формулой, коагулограмма.

Сроки выполнения теста

Подготовка к анализу

Кровь можно сдавать не ранее чем через 3 часа после приема пищи в течение дня или утром натощак. Чистую воду можно пить в обычном режиме.

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Сокурова Алла Михайловна

Specific laboratory diagnosis of viral hepatitis

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ

Ключевые слова: лабораторная диагностика; вирусный гепатит; иммуноферментный анализ; полимеразная цепная реакция; маркеры инфекции.

В РФ в последние годы заболеваемость хроническими формами гепатитов возросла более чем в 2 раза. По данным Роспотребнадзора, в 2013 г. зарегистрировано 73 570 случаев хронических вирусных гепатитов (заболеваемость составляет 51 случай на 100 тыс. населения), в том числе около 500 случаев у детей до 14 лет включительно. В г. Санкт-Петербурге заболеваемость хроническими формами гепатитов значительно выше, чем в среднем по стране и составляет 184 случая на 100 тыс. населения. Заболеваемость острыми вирусными гепатитами в Российской Федерации постепенно снижается (в 2013 г. зарегистрировано 12 745 случаев острых вирусных гепатитов, в том числе около 3 тыс. случаев у детей до 14 лет включительно).

Правильно выбрать алгоритм специфической лабораторной диагностики и интерпретировать полученные результаты, что позволит выявить заболевших, предотвратить распространение вирусных гепатитов, определить схему лечения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для специфической лабораторной диагностики применяют следующие методы:

• иммунная электронная микроскопия (ИЭМ);

• иммуно-ферментный анализ (ИФА);

• полимеразная цепная реакция (ПЦР).

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Специфическая лабораторная диагностика гепатита А включает:

1. Выявление в сыворотке крови М к вирусу гепатита А (ВГА, ИДУ) (апИ-ИАУ М) — маркер острой инфекции, в том числе бессимптомной формы. Иммуноглобулины класса М присутствуют в сыворотке крови с первых дней болезни и сохраняются до 3-6 месяцев [7].

3. Исследование фекалий на наличие ВГА методом ИЭМ. Проводится с эпидемиологической целью для выявления в очаге вспышки инфицированных лиц до проявления клинических симптомов заболевания, так как к моменту проявления клинических симптомов вирус в фекалиях практически отсутствует. Дети могут выделять вирус более длительно, чем взрослые, возможно, в течение нескольких недель после появления клинических симптомов заболевания [11, 12].

Соответствие серологических маркеров HAV иммунному статусу обследуемого [11]

Серологические маркеры HAV Иммунный статус

anti-HAV ^ M ± anti-HAV ^ G Недавно перенесённый гепатит А

Отсутствие anti-HAV ^ M и anti-HAV ^ G Отсутствие иммунитета к HAV

anti-HAV ^ Иммунитет к HAV

В таблице 1 представлены основные серологические маркеры ВГА и их соответствие иммунному статусу обследуемого.

Условной защитной концентрацией специфических антител к ВГА для населения является 22 МЕ/л, а для спецконтингентов, в том числе военнослужащих, — не менее 30 МЕ/л [7].

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В

Диагностика вирусного гепатита В (ГВ) основана на выявлении антигенов вируса — HBsAg, HВeAg, антител М и С к НВсAg, С к HВeAg, С к НВэА§) методом ИФА (чувствительность 0,1 нг/мл), либо его ДНК в крови и других биологических жидкостях организма, а также в клетках и тканях органов методом ПЦР [2].

Только комплексный анализ маркеров инфекции позволяет определить наличие вируса, установить клиническую стадию протекания инфекции (табл. 2) и иммунологический статус обследуемого, а также судить об эффективности лечения [11].

Взаимоисключающие маркеры (не могут присутствовать в крови одновременно): НВэА§ и С к HBsAg, HBeAg и ^ G к HBеAg.

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ГВ

НВэА§ — основной и первый маркер инфицирования вирусом ГВ, появляется в крови в инкубационном периоде, циркулирует при остром заболевании до 5-6 месяцев. Положительный результат исследования на НВэА§ должен быть проверен путем перестановки и последующего подтверждения в одном из тестов.

HВeAg — циркулирует только при наличии HBsAg. Появляется в крови больных острым или хроническим ГВ в фазе вирусемии, указывает на репликацию вируса в гепатоцитах и высокую инфек-ционность крови (антиген инфекционности).

Тестировать кровь на наличие HBeAg необходимо лишь при положительном результате на HBsAg. Длительность циркуляции HBeAg — важный прогностический признак. Его выявление через два месяца с начала заболевания свидетельствует о вероятном развитии хронического гепатита.

НВеА§ — сердцевинный (коровый) антиген в крови в свободном виде не циркулирует и не определяется. Обнаруживается только в гепатоцитах при морфологическом исследовании биоптатов печени.

М±1§ С к НВсА§ — антитела к сердцевинному антигену — важный диагностический маркер, особенно при отрицательных результатах индикации НВэА§, свидетельствует о встрече организма с вирусом ГВ.

Схема определения стадии болезни по серологическим маркерам ВГВ [11]

Стадия болезни Маркеры ВГВ

Острая фаза болезни ДНК ВГВ HBsAg HBeAg ^ M к HBcAg

Фаза реконвалесценции/хронический гепатит ^ G к HBеAg ^ M±Ig G к HBcAg

Интерпретация сочетаний серологических маркеров вируса гепатита В [11]

Клиническое состояние Серологические маркеры

HBsAg Ig G к HBsAg Ig M к HBcAg Ig M±Ig G к HBcAg HBeAg Ig G к HBeAg

Острый ГВ, ранняя фаза ± - ± ± ± -

Острый ГВ, поздняя фаза ±/- - ± ± - ±

Острый ГВ, стадия реконвалесценции - - - ± - ±

Острый ГВ в анамнезе - ± - ± - ±/-

^ G к HBеAg — указывают на начало стадии ре-конвалесценции при остром вирусном гепатите В.

В таблице 3 представлены основные алгоритмы интерпретации сочетаний серологических маркеров вируса ГВ.

ДНК вируса ГВ обнаруживается в сыворотке или плазме крови методом ПЦР. Ее наличие свидетельствует о высокой репликативной активности вируса. Количество ДНК вируса в крови быстро возрастает в течение инкубационного периода и становится максимальным в острой фазе заболевания. Циркуляция более 5-6 месяцев является неблагоприятным прогностическим критерием и свидетельствует о переходе инфекции в хроническую форму.

Количественная характеристика содержания ДНК вируса ГВ в клинических образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии. Если концентрация вируса меньше 105 копий/мл, то прогноз курса лечения благоприятный, если выше, то необходимо применить другие схемы лечения.

Частота выявления ДНК вируса ГВ коррелирует с частотой определения HBsAg, HBeAg и ^ М к HBcAg.

Используя технику ПЦР, можно определить и подтип HBsAg.

Так как в практику отечественного здравоохранения были включены национальные стандарты обязательного обнаружения различных концентраций поверхностного антигена вируса ГВ в образцах сывороток крови (с 2003 г. — 0,1 нг/мл), решающее

значение для индикации HBsAg имеют такие методы как ИФА в различных модификациях и ПЦР [10, 12].

В исключительных случаях (если нет специального оборудования) разрешено использовать имму-нохроматографический экспресс-тест (чувствительность 5 нг/мл) [2].

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА О

Серологическое исследование крови на маркеры вируса гепатита О (ВГD) показано только у пациентов с наличием в крови HBsAg, т. е. инфицированных вирусом ГВ.

Маркеры инфицированности В^:

Методы лабораторной диагностики: антитела в крови определяют методом ИФА, РНК ВГО — методом ПЦР.

При коинфекции в желтушный период на протяжении 2 недель выявляют РНК вируса и ^ М к ВГD. Несколько позднее, через 1-2 месяца с момента появления желтухи, выявляют ^ G к ВГD. Титр ^ G снижается до практически неопределяемых уровней после выздоровления, и не сохраняется никаких серологических маркеров того, что человек был когда-либо инфицирован ВГD.

При суперинфекции в острый период РНК ВГО может не выявляться. Наряду с ^ М к ВГD выявляют ^ G к ВГD, причем в более высоких титрах, чем при коинфекции. Стойкое увеличение титра ^ М ± ^ G к ВГD является маркером хронического гепатита D [3-6, 11].

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА С

Материал для исследования — кровь и сыворотка крови.

Первый метод — ИФА — определение антител к белкам вируса гепатита С (ВГС).

Современные диагностические тест-системы ИФА в качестве антигенов должны содержать полный спектр структурных и неструктурных белков вируса. Теперь используются тест-системы 4-го поколения, содержащие рекомбинантные С-, №3-, №4-, Ш5-белки [2].

Также разработаны тест-системы ИФА и имму-ноблотинга для раздельного определения антител к различным белкам ВГС. Их используют в качестве подтверждающих тестов и устанавливают стадию инфекционного процесса, так как первыми появляются антитела к С- и ^3-белкам, а антитела к и NS5 появляются позже. Но все эти антитела являются только маркерами инфицированности ВГС и защитной роли не играют.

там до начала лечения для правильного назначения противовирусных препаратов и продолжительности терапии [9, 10].

Типируют ВГС путем обнаружения генетических изменений (мутаций) в консервативных областях вирусного генома: амплификация консервативных областей и анализ специфичных нуклеотидных последовательностей при помощи метода прямого секвенирования амплифицированных фрагментов с последующей ПЦР с типоспецифичными прайме-рами RFLP (анализ амплифицированных фрагментов с помощью ферментов рестрикции), обратной гибридизации с типоспецифичными зондами (LiPA) и SSCP (анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК).

ПЦР позволяет выявить РНК ВГС не только в сыворотке крови, но и в ткани печени, что важно в подтверждении роли вируса в формировании гепа-тоцеллюлярной карциномы при отсутствии антител к вирусу и его РНК в сыворотке крови [9, 10, 12].

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА Е

Лабораторная диагностика гепатита Е проводится методом исключения специфических маркеров острых гепатитов А, В, С, а также методом ИЭМ — обнаружение вируса гепатита Е (ВГЕ) в фекалиях. Разработана ПЦР для детекции вирусной РНК. Кроме того, разработаны тест-системы ИФА для выявления антител в сыворотке крови к ВГЕ:

• ^ М (выявление больных в острой стадии болезни);

• общие антитела (^ M±Ig G) — выявление больных в период реконвалесценции [11, 12].

Признавая огромное значение вирусных гепатитов, Всемирная ассамблея здравоохранения в 2010 году приняла резолюцию WHA63.18, призвав применять комплексный подход к профилактике вирусных гепатитов и борьбе с ними. В связи с чем необходимо обеспечить качественную и сво-

Перечень маркеров диагностики ВГС [11] Таблица 4

Цель исследования Маркер ВГС

Диагностика ВГС • 1д М ± ^ G к ВГС

Диагностика острого ВГС, мониторинг больных, определение прогноза и исхода • 1д М ± ^ G к ВГС; • РНК ВГС; • раздельное определение антител к белкам: С, ЫБЗ, ЫБ4, ЫББ

Скрининг доноров крови • 1д М ± ^ G к ВГС

Скрининг беременных • 1д М ± ^ G к ВГС

Скрининг групп повышенного риска • 1д М ± ^ G к ВГС

евременную диагностику этих заболеваний. Методы специфической лабораторной диагностики вирусных гепатитов все время совершенствуются, перечень маркеров инфицирования расширяется, и правильная интерпретация их сочетаний позволит врачам быстро оценить результаты лабораторных исследований и назначить больному лечение.

3. Положение о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 г. № 569.3.

9. Пименов Н. Н., Чуланов В. П., Комарова С. В. и др. Гепатит С в России: эпидемиологическая характеристика и пути совершенствования диагностики и надзора // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2012. - № 3. - С. 4-9.

10. Ющук Н. Д., Климова Е.А, Знойко О. О. и др. Протокол диагностики и лечения больных вирусными гепатитами В и С // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2010. - Т. 20, № 6. - С. 4-60.

12. Медицинские лабораторные технологии: руководство по клинической лабораторной диагностике: в 2 т. / В. В. Алексеев, В. Б. Сбойчаков, А. М. Сокурова и др.; Под ред. А. И. Карпищенко. - 3-е изд., пере-раб. и доп. - Т. 2. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 792 с.

SPECIFIC LABORATORY DIAGNOSIS OF VIRAL HEPATITIS

♦ Key words: laboratory diagnosis of viral hepatitis; enzyme immunoassay; polymerase chain reaction; markers of infection.

Выбор исследований и оценка результатов на вирусные гепатиты.

Применяемые лабораторные технологии:

ИХЛА (иммунохемилюминесцентный анализ) – количественный высокочувствительный анализ на выявление серологических маркеров
ИФА (иммуноферментный анализ) – полуколичественный или качественный средне-чувствительный анализ на выявление серологических маркеров
ПЦР (полимеразная цепная реакция) – качественный и количественный анализ на выявление в крови ДНК и РНК живых вирусов в период репликации

HbsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В.
Метод ИФА (отечеств.) – предел обнаружения от 0.1 нг/мл, результат (+) или (-)
Положительный тест подтверждают дополнительным исследованием. Возможно получение ложно-отрицательных результатов у 5-7% лиц, имеющих низкие уровни HBsAg или редкие субтипы вируса гепатита В.

HBsAg – метод ИХЛА (Эбботт, США) – предел обнаружения от 0.05 МЕ/мл, выявляет все мутантные формы вируса.
Результат отрицательный при уровне менее 0.05 МЕ/мл, положительный результат - более 0,05 МЕ/мл.
Появляется через 1-2 недели после инфицирования. При выздоровлении исчезает через 1.5 месяца. Выявление его после 6 месяцев означает переход заболевания в хроническую форму.
Отрицательный результат возможен у 0.01-0.05 % лиц с очень низкими уровнями HBsAg.
Положителен у больных острым ВГВ с начала заболевания и у всех больных с хроническими формами; бессимптомное носительство антигена возможно и после выздоровления у лиц с ослабленным иммунитетом в связи с низкой продукцией антиHBsAg.
AntiHBcor - суммарные антитела к сердцевинному антигену вируса гепатита В. Поскольку сам антиген (HBcor) находится в печеночной клетке и в крови не обнаруживается, о его наличии судят по появлению в крови антител к нему.
AntiHBcor - метод ИХЛА (Эбботт, США) – результат в виде цифрового коэффициента обратной реакции:
От 1 до 3 – отрицательный
От 0 до 1 – положительный. Чувствительность теста – 1РЕI unit/ml.
Тест становится положительным с 4 недели у больных острым ВГВ. Выявляется у всех переболевших ВГВ ранее с выздоровлением в течение всей жизни (даже без HBsAg в крови); у больных любыми формами хронического ВГВ.
Кровь доноров, положительных по антиHBс, считается непригодной для переливания, даже при отрицательном результате исследования на HBsAg.
AntiHBcorIgM – острофазовые антитела к сердцевинному антигену гепатита В (ИФА) отечеств. – результат (+), (-). Антитела выявляются при остром ВГВ с 2 по 8 месяц, при хроническом ВГВ указывают на наличие текущего обострения.
Оценивается только в совокупности с HBsAg и антиHBcor.
AntiHBs - антитела к поверхностному антигену гепатита В - количественно (ИХЛА) DPC, США – пределы обнаружения – от 3 до 2000 мЕ/мл
Менее 10 мЕ/мл – отрицательный результат
Более 10 мЕ/мл - положительный
Антитела появляются у больных в периоде реконвалесценции. Активная выработка антител приводит к связыванию и удалению HBsAg из кровотока при выздоровлении. Уровень их достигает пика через 6-8 месяцев; антитела могут сохраняться длительное время как показатель активации иммунитета к ВГВ у лиц, переболевших с выздоровлением. У лиц, вакцинированных против ВГВ, антитела являются показателем эффективной иммунизации при уровне от 10 мЕ/мл и более, согласно критериям ВОЗ.
Эффективный иммунитет после прививки от ВГВ сохраняется до 10 лет, контролируется по уровню антиHBs.
НВеAg – внутренний антиген вируса гепатита В - ( метод ИФА) – результат (+), (-). Антиген выявляется на неделю позже HBsAg, держится до 2 месяцев острого периода ВГВ; является маркером максимальной заразности больного, наличие его у беременной означает риск заражения плода в 60-80%.
Обнаруживается при хроническом активном гепатите, при хроническом персистирующем гепатите. Заменяется на антиНВе спустя 6 месяцев от начала заболевания.
AntiНВе IgG (ИФА) – антитела к внутреннему антигену гепатита В - появляются по окончании острого периода ВГВ, что означает благоприятный прогноз, особенно при нарастании титра. Могут обнаруживаться в крови в течение 2-5 лет.
AntiHVD суммарные - антитела к вирусу гепатита Д - (ИФА) качественно – результат (+), (-). Маркер инфицированности текущего или перенесенного ранее ВГД. Заболевание возможно только на фоне имеющегося ВГВ как суперинфекция.
AntiHCV суммарные - антитела к вирусу гепатита С - (ИФА) – результат (+) или (-). Используется как первичный скрининг на наличие ВГС; основанием для диагноза не является, так как возможны как ложно-положительные, так и ложно отрицательные результаты. Положительный результат подтверждают и повторяют анализ другой тест-системой. Появляются антиВГС не ранее, чем через 5 недель от момента заражения (возможно и через 30-50 недель). Ложно-отрицательные результаты возможны при использовании низкочувствительных тест-систем, не выявляющих вирусы некоторых генотипов, чаще 1а и 3а.
AntiHCV (ИХЛА) Эбботт, США – высокочувствительный третьего поколения количественный тест на определение антител к восьми антигенам вируса гепатита С всех генотипов: Nc, E1/s,E2/Ns1, Ns2-5. Результат (+) или (-) и в виде коэффициента позитивности, позволяющего видеть изменения в динамике. Ложноотрицательный результат возможен в самом начале заболевания (так называемое серонегативное окно).

У лиц, больных гепатитом С тест положителен как вне обострения, так и при обострении.
AntiHCVIgM - острофазовые антитела к вирусу гепатита С (ИФА) качественно – результат (+), (-).
Наличие антител характерно для острой фазы ВГС, обострения хронического ВГС.
ПЦР (полимеразная цепная реакция)– анализ на выявление ДНК-РНК (DNA-RNA) живых вирусов гепатитов В,С, Д в крови – высокочувствительный тест на наличие острого ВГ или обострения хронического заболевания. Положительный тест свидетельствует о текущей репликации вируса в печеночной ткани с выходом вируса в кровь. Тест может быть отрицательным у выздоровевших после острого ВГ (до15% случаев), при хронических гепатитах вне обострения (при отсутствии репликации и деструкции печеночной ткани), на фоне противовирусной терапии, при подавлении репликации вируса гепатита С у пациентов с сочетанным гепатитом В, Д, А.
Определение РНК вируса гепатита С в крови является золотым стандартом – наиболее чувствительным и ранним тестом для диагностики заболевания (положителен с 7-21 дня от момента инфицирования, в отличие от антител). Вирусемия в течение более 6 месяцев – свидетельство хронизации болезни. Количественный анализ (вирусная нагрузка) используется для определения показаний и контроля за лечением антивирусными препаратами гепатитов В и С.
Определение генотипа вируса гепатита С (HCV) используется для выявления устойчивых к препаратам интерферона типов вируса (1b) и выбора тактики лечения.

Автореферат диссертации по медицине на тему Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита C у доноров крови

На правах рукописи

ШУБИНА ЮЛИЯ ФЕДОРОВНА

АЛГОРИТМ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА

С У ДОНОРОВ КРОВИ

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении выс: профессионального образования «Российский государственный медицин университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развит

доктор медицинских наук, профессор

Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосов« Департамента здравоохранения г. Москвы.

диссертационного совета Д 208.072.08 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по ад 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО России! государственного медицинского университета по адресу: 117997, Москва, Островитянова, д.1.

Тогузов Руслан Тимофеевич

Семененко Татьяна Анатольевна

Кафарская Людмила Ивановна

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Вирусный гепатит С - кровяная вирусная инфекционная болезнь с контактным механизмом передачи. Она характеризуется преимущественным поражением печени и является социальнозначимой инфекционной патологией. На долю вирусного гепатита С в структуре вирусных гепатитов в нашей стране приходится от 5 до 15 % случаев [Онищенко Г .И., 2008].

Возбудитель заболевания - РНК-содержащий вирус. Источником инфекции являются люди, больные острым и хроническим гепатитом С, и вирусоносители. Вирус гепатита С (HCV) передается парентеральным путем. Один из способов передачи - трансмиссивное заражение при проведении гемотрансфузий.

Частота носительства возбудителя гепатита С у доноров крови достигает 7% [Дашкова Н.Г., Расницын С.П., и др., 2005]. Это обуславливает необходимость лабораторного тестирования крови доноров для выявления возможных вирусоносителей гепатита С и выбраковки гемопродукции, заготовленной от этих доноров.

Существовавший до последнего времени алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров включал определение антител к вирусу гепатита С путем иммуноферментного анализа и проведение подтверждающего теста - иммунологического блотинга, метода выявления антител к отдельным антигенам возбудителя. Проведенные в последнее время исследования [Дашкова Н.Г., 2006; Карслян JI.C., 2007] указывают на недостаточность использования данных методов. Они не обеспечивают максимальную безопасность реципиентов от заражения вирусным гепатитом С и не позволяют с высокой степенью надежности оценить возможность сохранения заготовленной гемопродукции от лиц, сомнительные результаты первичного обследования которых не связаны с указанным выше вирусом.

Поэтому разработка усовершенствованного алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов является актуальной, так как адекватная схема диагностики снижает риск развития посттрансфузионного вирусного гепатита С у реципиентов, по результатам

лабораторных исследований решается вопрос о возможности использования заготовленной от донора гемопродукции, и способствует сохранению кадровых доноров.

Разработать рациональный алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов в соответствии с современными достижениями в области лабораторных исследований для снижения риска его трансфузионно-трансмиссивной передачи.

1. Обобщить данные о риске развития посттрансфузионного вирусного гепатита С.

2. Провести мониторинг выявления вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов в зависимости от используемых методов лабораторной диагностики.

3. Усовершенствовать алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров в соответствии с использованием современных доступных методов.

4. Разработать алгоритм выбраковки гемопродукции по результатам лабораторного обследования донорской крови на наличие маркеров вирусного гепатита С.

5. Оценить медико-экономическую эффективность внедрения разработанного алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов.

Разработан алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови, впервые включающий процедуру повторного серологического контроля крови доноров с неоднозначными значениями по результатам первичного лабораторного скрининга и процедуру тестирования всех серонегативных на антитела к вирусу гепатита С образцов на наличие РНК вируса гепатита С (ПСУ). Разработан алгоритм выбраковки и использования заготовленной от доноров гемопродукции по итогам лабораторного

тестирования на наличие маркеров вирусного гепатита С. Рассчитаны уровни выявляемое™ вирусного гепатита С среди доноров крови г. Москвы за 20002008 гг. Рассчитан остаточный риск трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С в г. Москве.

Практическая значимость исследования

Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови, включающий повторное обследование доноров через 1-3 месяца и РНК-тестирование серонегативных на антитела к вирусу гепатита С (апй-НСУ) образцов сыворотки крови, снижает риск инфицирования реципиентов при переливании компонентов крови.

Предложенный алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови позволяет сократить количество ложноположительных результатов исследования и использовать гемопродукцию, заготовленную от неинфицированных доноров.

Разработанные методические основы вычисления остаточного риска трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С могут быть использованы на станциях переливания крови.

Положения, выносимые на защиту

1. Введение повторного серологического контроля через 1-3 месяца крови доноров с неопределенными или сомнительными результатами скринингового лабораторного исследования на наличие маркеров вирусного гепатита С позволяет снизить риск инфицирования реципиентов при применении компонентов крови.

2. Внедрение тестирования крови доноров на наличие РНК вируса гепатита С позволяет уменьшить остаточный риск инфицирования гепатитом С потенциальных реципиентов.

3. Алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита С в крови доноров, включающий повторное обследование доноров через 1-3 месяца и РНК-тестирование, позволяет увеличить безопасность гемотрансфузий и минимизировать получение ложноположительных результатов.

4. Разработанный алгоритм выбраковки гемопродукции по результатам лабораторного обследования донорской крови на наличие маркеров вирусного гепатита С позволяет сохранить пригодные к использованию компоненты крови.

5. Медико-экономическая эффективность внедрения разработанного алгоритма лабораторной диагностики вирусного гепатита С у доноров крови и ее компонентов заключается в снижении остаточного риска посттрансфузионного инфицирования ВГС, уменьшении заболеваемости в данном спектре патологии и сокращении затрат на лечение.

Внедрение результатов исследования

Методика расчета относительного риска развития трансфузионно-трансмиссивной передачи ВГС используется централизованной клинико-диагностической лабораторией станции переливания крови ДЗ. г. Москвы для оценки качества заготовленной гемопродукции.

Результаты полученные в ходе диссертационного исследования используются в процессе обучения врачей и биологов клинико-диагностических лабораторий на циклах усовершенствования и профессиональной переподготовки на кафедре клинической лабораторной диагностики ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Апробация состоялась 23 марта 2009 г. на совместном заседании кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ, ПНИЛ нуклеинового и белкового обмена ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и централизованной клинико-диагностической лаборатории (ЦКДЛ) станции переливания крови Департамента здравоохранения г. Москвы.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Личный вклад автора

Автор провел повторное серологическое обследование 99 доноров. При этом выполнил 256 исследований методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и 58 методом линейного иммунологического блотинга. В период с 2005 по 2008 г выполнил 3250 исследований методом ИФА, 4826 методом хемилюминесцентного иммунохимического анализа на микрочастицах, 568 методом линейного иммунологического блотинга. Внедрил метод тестировании РНК HCV на анализаторе Cobas Amplicor, проанализировав при этом 4248 образцов сыворотки крови доноров. Провел мониторинг выявляемое™ вирусного гепатита С у доноров крови СПК ДЗ г. Москвы за 2000-2008 гг. Рассчитал остаточный риск трансфузионно-трансмиссивной передачи вирусного гепатита С в период до и после внедрения исследования крови доноров на наличие РНК HCV. Автором проведена статистическая обработка и анализ полученных результатов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического списка, включающего 113 отечественных и 63 иностранных источника. Работа иллюстрирована И таблицами и 10 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на кафедре КЛД ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (зав. кафедрой, д.м.н., проф. Р.Т. Тогузов). Практическая часть работы проводилась на базе централизованной клинико-диагностической лаборатории станции переливания крови ДЗ г. Москвы (главный врач - д.м.н., проф. Майорова О. А., зав. ЦКДЛ- к.м.н. Тарасенко О. А.).

В исследование включены образцы крови, полученные при аллогенных донациях цельной крови, процедурах тромбоцит- и плазмафереза, проведенных на станции переливания крови и в 15 отделениях переливания крови лечебно-профилактических учреждений ДЗ г. Москвы.

Всего исследовано 164522 образца от 84396 доноров.

Из исследования были исключены гемолизированные и хилезные образцы сыворотки крови. Всего исключено 74 образца.

Лабораторные исследования выполнены с соблюдением действующего законодательства по обеспечению контроля качества лабораторных исследований с использованием тест-систем и контрольных материалов, разрешенных к применению на территории РФ.

Выявление маркеров вирусного гепатита С проводилось с использованием следующих методов:

Ретроспективный анализа выявляемое™ вирусного гепатита С у доноров проведен с использованием базы данных единого донорского центра СПК ДЗ г. Москвы. Проанализированы 341952 карты доноров за период с 01.01.2000 по 31.12.2008 г.

Оригинальные данные для повторного анализа могут быть получены в информационной базе единого донорского центра г. Москвы и архиве ЦКДЛ станции переливания крови ДЗ г. Москвы.

Статистическая обработка результатов при оценке полученных данных проводилась общепринятыми методами математической статистики с использованием программы Statistica 6.0 (Statsoft, США) и статистического пакета программы Excel 2003 (Microsoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Лабораторная диагностика ВГС у доноров крови ее компонентов регламентирована Российским законодательством и направлена на обеспечение безопасности гемотрансфузии.

В 1996 году в систему скрининга донорской крови на наличие трансфузионно-трансмиссивных инфекций было внедрено исследование на антитела к вирусу гепатита С. С этого момента произошло значительное совершенствование методов и алгоритмов лабораторной диагностики, усовершенствование методик и переход на автоматические методы анализа.

К началу данного исследования алгоритм лабораторной диагностики ВГС у доноров крови включал две постановки ИФА на наличие anti-HCV. Первая постановка проводилась для всех без исключения исследуемых образцов, вторая постановка проводилась в тот же день при получении положительных или сомнительных результатов для исключения технических ошибок анализа и

увеличения надежности полученных данных. Для подтверждения наличия инфекции, все положительные в двух постановках ИФА образцы дополнительно тестировались более чувствительным методом линейного иммунохимического блотинга для определения антител к специфическим белкам НСУ.

Основная задача при обследовании доноров на вирусные инфекции -снижение вероятности инфицирования потенциальных реципиентов. Современное законодательство регламентирует определение в крови доноров уровня АЛТ и антител к вирусу гепатита С, однако они не являются универсальными маркерами заболевания.

На каждом этапе развития инфекционного процесса присутствуют различные маркеры вирусного гепатита С, как неспецифические АЛТ, так и специфические - антитела к НСУ, вирусная РНК (рисунок 1).

Рисунок 1. Маркеры вирусного гепатита С в различные периоды инфекционного процесса.

проводить комплексное исследование маркеров ВГС крови доноров с использованием различных методов, искать новые подходы и алгоритмы лабораторной диагностики.

Процедура повторного серологического контроля

Длительность периода (в среднем 66 дней) сероконверсии, то есть периода от момента заражения до выявления апй-НСУ при вирусном гепатите С и аналитическая ограниченность современных методов лабораторной диагностики привели к необходимости поиска и внедрения новых подходов при скрининге донорской крови на ВГС. В частности, была предложена процедура повторного серологического контроля доноров.

Появление сомнительных результатов может быть связано с недостаточным уровнем антител у инфицированных пациентов на данном этапе заболевания, или наличием перекрестных реакций с другими антигенами при отсутствии выявляемой патологии. Повторное обследование доноров через промежуток времени от 1 до 3 месяцев значительно повышает вероятность появления определяемого уровня апй-НСУ у лиц с наличием инфекции.

которые расценивались как неспецифическая реакция на апИ-НСУ. Эти лица также были отстранены от донорства и направлены на клиническое обследование.

Эффективность внедрения повторного лабораторного обследования доноров на наличие маркеров вирусного гепатита С представлена на рисунке 2.

Неспецифическая реакция на апй'-НСУ 24%

Рисунок 2. Результаты повторного серологического контроля на маркеры ВГС.

После клинического обследования 24 доноров с неспецифической реакцией, двум из них был поставлен диагноз ВГС, у остальных диагноз остался неопределенным.

Результаты лабораторного исследования определяют алгоритм

дальнейшего использования заготовленной гемопродукции. Из всех

компонентов крови наибольший срок годности имеет свежезамороженная

плазма. Она подвергается глубокой заморозке и обязательному хранению

(карантинизации) до 3-х месяцев. По результатам проведенного повторного

серологического контроля плазма 70 доноров с отрицательной серологической

реакцией на ВГС была карантинизирована и впоследствии реализована, плазма

остальных 29 доноров забракована и утилизирована.

Внедрение процедуры повторного серологического контроля позволило в 2007 году возвратить в донорский контингент 70 человек, у которых был получен отрицательный результат в ходе обследования на antí-HCV, что составило 0,19 % от общего числа (37250) доноров плазмы и крови. Плазма крови этих доноров была использована для гемотрансфузии.

В то же время, доноры с положительной реакцией на anti-HCV (5 человек, 0,013%) получили абсолютный отвод от донорства, а все компоненты крови были утилизированы.

Согласно алгоритму, который использовался ранее, и был регламентирован приказами Минздрава РФ, карангинизированные и не подлежащие карантинизации компоненты крови доноров с сомнительными результатами исследований на ВГС могли быть использованы для реципиентов.

Читайте также: