Руководство по лабораторной диагностике вирусных болезней
Инфекционные болезни — это заболевания, вызванные проникновением в организм бактерий, грибков или вирусов. Самая важная часть диагностики инфекций — это определение возбудителя и его концентрации. Для этих целей используются разнообразные лабораторные методы, которые позволяют выяснить, чем именно и как давно атакован организм, а в некоторых случаях — спрогнозировать эффективность лечения тем или иным препаратом.
Особенности диагностики инфекционных заболеваний
В клинической практике данный тип заболеваний встречается очень часто. Именно они, по данным Всемирной организации здравоохранения, становятся причиной 26% всех смертей. В список самых распространенных инфекционных заболеваний входят инфекционная пневмония и другие воспалительные заболевания дыхательных путей, гепатит, ВИЧ, туберкулез, малярия, воспаления органов половой системы и мочевыводящих путей, гистоплазмоз, ротавирусные инфекционные заболевания, ветряная оспа, герпес, вирус папилломы человека и еще несколько десятков болезней. Хотя бы раз в жизни каждый из нас сталкивается с инфекционными заболеваниями и необходимостью быстрой постановки диагноза.
Все инфекционные болезни делятся на пять типов — прионные, вирусные, бактериальные, протозойные и грибковые поражения. Далее будут рассмотрены последние четыре типа как наиболее распространенные. Разные возбудители иногда могут вызывать одно и то же заболевание. В частности, пневмония может быть результатом как вирусной, так и бактериальной инфекции. Лечение зависит не от проявлений, а от возбудителя болезни. Противовирусные препараты бесполезны в борьбе с бактериями и грибками, антибиотики не действуют на вирусы. Поэтому основная задача лабораторной диагностики инфекционных заболеваний — выявление типа возбудителя.
Способы лабораторной диагностики инфекционных болезней можно разделить на два типа: неспецифические и специфические методы.
К неспецифическим относятся общий анализ крови и исследование соотношения ее белковых фракций, печеночные пробы, общий анализ мочи и кала. Эти методы не дают информации о виде возбудителя, но позволяют узнать, в какой мере болезнь затронула органы и системы организма, что именно в их работе нарушено и насколько далеко зашел процесс.
Специфические — вирусологический и бактериологический методы, микроскопическое исследование возбудителей, анализы на антигены и антитела — направлены непосредственно на обнаружение возбудителя.
Современная медицина располагает множеством методов выделения возбудителей бактериальной инфекции:
Бактериоскопический . Исследуется окрашенный специальным образом мазок.
Бактериологический . Биоматериал высеивается в питательную среду, и через некоторое время специалист исследует колонию бактерий, выросшую в ней.
Биологический . Направлен на определение патогенности микроорганизмов.
Серологический . Выявляет антитела и антигены в сыворотке крови — особые вещества, которые вырабатываются организмом при контакте с возбудителем определенной болезни.
Чаще всего для исследований используют кровь или сыворотку крови, реже — слюну, мочу, кал, клетки эпителия (мазок и соскоб) и другой биоматериал.
В лабораторной диагностике вирусных заболеваний используются:
Вирусологическое исследование . Световая и электронная микроскопия дает возможность выявить наличие вирусных включений и сами вирусы и идентифицировать их.
Серологическое исследование для обнаружения антител и антигенов. Этот метод дает возможность быстро выявить агрессора, как и в случае с бактериальными инфекциями. Для диагностики используются разнообразные способы исследования материала — реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Имунноблоттинг, в частности, позволяет выявлять антитела сразу к нескольким инфекциям и считается современным и точным диагностическим методом.
Молекулярно-генетические методы . Последнее слово в лабораторной диагностике. Позволяют обнаружить вирус даже тогда, когда его концентрация ничтожно мала — то есть на самых ранних стадиях. Самым известным из этих методов является ПЦР, при которой фрагмент вируса многократно копируется до тех пор, пока специалист не получит достаточно материала для определения типа вируса и его изначальной концентрации.
Для выявления вирусов обычно требуется сделать анализ крови.
Так называют инфекции, вызванные простейшими паразитами, например, амебами. Малярия, амёбиаз, токсоплазмоз, лямблиоз, трихомониаз, сонная болезнь — вот неполный список самых распространенных протозойных инфекций. Лабораторная диагностика таких заболеваний включает в себя следующие методы:
Микроскопический . Простейшие паразиты выявляются путем исследования под микроскопом окрашенных образцов биоматериала. Самый простой и надежный метод для многих возбудителей.
Культуральный . Посев биоматериала в питательную следу для дальнейшего исследования размножившихся простейших. У этого метода есть существенный недостаток: результатов нужно ждать долго, сам процесс может занять не менее 5-6-ти дней.
Серологический . Используют редко ввиду малой информативности.
Аллергический . Также не является распространенным. Кожные аллергопробы делают для того, чтобы подтвердить лейшманиоз и токсоплазмоз. Это вспомогательный диагностический метод.
В качестве биоматериала для исследований в основном используется кровь, иногда — – кал или моча.
Микроскопическое исследование . Препарат окрашивается и рассматривается под мощным микроскопом. Посредством иммунофлюоресцентной микроскопии исследуется проба, помеченная флюоресцеинами — специальным красителем. Наиболее быстрый способ выявления грибка по сравнению с другими методами.
Культуральный . Происходит посев пробы на питательную среду и дальнейшее исследование полученной в результате колонии грибков.
Серологический . Используется для выявления грибковых поражений, однако для микозов он считается не особенно точным.
Гибридизация нуклеиновых кислот . Самый современный способ выявления грибковых инфекций, его применяют для идентификации основных возбудителей системных микозов. Из культуры извлекается РНК и вносится особым способом помеченная молекула ДНК. Если в пробе наличествует один из основных патогенных грибков, ДНК объединится с его РНК, создав легко различимую структуру. Несомненным преимуществом метода является возможность определить инфекцию на самых ранних стадиях.
Биоматериалом для исследований являются клетки кожи, волос и ногтей, клетки слизистых оболочек (мазок или соскоб), мокрота, моча, секрет простаты, сперма, грудное молоко.
Современные методики диагностики инфекций позволяет выявить их на начальном этапе, Чем раньше болезнь будет обнаружена, тем проще ее вылечить. Поэтому сдавать анализы на инфекции желательно регулярно, даже если вы ни на что не жалуетесь и не замечаете никаких перемен в самочувствии.
Перед сдачей биоматериала для исследований иногда требуется определенная подготовка. Так, кровь обычно сдают с утра, натощак, а перед забором мазка не рекомендуется принимать душ. Эти требования очень важны: они обеспечивают точность результата, поэтому узнайте у врача заранее о подготовительных мерах и точно следуйте всем его рекомендациям.
Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций подразделяются на несколько больших групп.
- Прямые методы, состоящие в выявлении непосредственно в биологическом материале самого вируса или антител к нему.
- Непрямые методы-заключаются в искусственной наработке вируса в значительных количествах, и его дальнейшем анализе.
К наиболее актуальным в повседневной практике методам диагностики относятся:
Серологические методы диагностики - выявление в сыворотке крови пациента определенных антител или антигенов в результате реакции антиген-антитело(АГ-АТ). То есть, при поиске у пациента определенного антигена используется соответствующее искусственно синтезированное антитело, и, соответственно, наоборот-при выявлении антител используют синтезированные антигены.
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)
Основана на использовании меченых красителями антител. При наличии вирусного антигена он связывается с мечеными антителами, и под микроскопом наблюдается специфическая окраска, которая говорит о положительном результате. При этом методе, к сожалению, невозможна количественная интерпретация результата, а только лишь качественная.
Возможность количественного определения дает иммуноферментный анализ(ИФА). Он похож на РИФ, однако в качестве маркеров используют не красители, а ферменты, превращающие бесцветные субстраты в окрашенные продукты, что и дает возможность количественной оценки содержания как антигенов, так и антител.
- Отмывают не связавшиеся антитела и антигены.
- Добавляют бесцветный субстрат, и в лунках с антигеном, который мы определяем, произойдет окрашивание, т.к. там будет связанный с антигеном фермент, после чего на специальном приборе оценивают интенсивность свечения окрашенного продукта.
По похожей схеме происходит и выявление антител.
Реакция непрямой(пассивной) гемаглютинации (РПГА).
Метод основан на способности вирусов связывать эритроциты. В норме эритроциты падают на дно планшета, образуя так называемую пуговку. Однако если в исследуемом биологическом материале находится вирус, он свяжет эритроциты в так называемый зонтик, который не упадет на дно лунки.
Теперь остановимся на методах диагностики непосредственно нуклеиновых кислот исследуемых вирусов, и прежде всего о ПЦР ( Полимеразная Цепная Реакция) .
Суть этого метода заключается в обнаружении специфического фрагмента ДНК или РНК вируса путём его многократного копирования в искусственных условиях. ПЦР можно проводить только с ДНК, то есть для РНК-вирусов предварительно необходимо произвести реакцию обратной транскрипции.
Непосредственно ПЦР проводят в специальном приборе, под названием амплификатор, или термоциклер, который поддерживает необходимый температурный режим. ПЦР-смесь состоит из добавленной ДНК, которая содержит интересующий нас фрагмент, праймеров (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплиментарный ДНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплиментарной цепи), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.
Стадии цикла ПЦР:
- Деннатурация-первая стадия. Температура повышается до 95 градусов, цепочки ДНК расходятся друг относительно друга.
- Отжиг праймеров. Температуру понижают до 50-60 градусов. Праймеры находят комплиментарный участок цепи и связываются с ним.
- Синтез. Температуру вновь повышают до 72, это рабочая температура для ДНК-полимеразы, которая, отталкиваясь от праймеров, строит дочерние цепи.
Цикл многократно повторяется. Через 40 циклов из одной молекулы ДНК получается 10*12 степени копий копий искомого фрагмента.
При проведении ПЦР в режиме реального времени синтезируемые копии фрагмента ДНК метятся красителем. Прибор регистрирует интенсивность свечения и по ходу реакции строит графики накопления искомого фрагмента.
Современные методы лабораторной диагностики с высокой достоверностью позволяют выявить присутствие вируса - возбудителя в организме, нередко, задолго до появления первых симптомов заболевания.
Тихомиров Д.С., Романова Т.Ю., Игнатова Е.Н., Ярославцева Н.Г., Туполева Т.А., Гапонова Т.В.
1. Rider T.H., Zook C.E., Boettcher T.L., Wick S.T., Pancoast J.S., Zusman B.D. Broad-spectrum antiviral therapeutics. PLoS One 2011; 6(7): e22572.
2. Pawlotsky J.M. New antiviral agents for hepatitis C. F1000 biology reports 2012; 4(5): 557. DOI:10.3410/B4-5
3. Туполева Т.А., Тихомиров Д.С., Грумбкова Л.О., Игнатова Е.Н., Романова Т.Ю., Филатов Ф.П., Гаранжа Т.А. Контаминация при ПЦР-исследованиях: проблемы и решения. Клин. лаб. диагностика 2015; 60(1): 26–42.
4. Гаранжа Т.А., Тихомиров Д.С., Чернова Н.Г., Троицкая В.В., Моисеева Т.Н., Кузьмина Л.А., Филатов Ф.П., Паровичникова Е.Н. Вирусные поражения слизистых оболочек ЖКТ и дыхательных путей у онкогематологических больных. Вестник гематологии 2014; X(4): 17.
5. Storch G.A., Wang D. Diagnostic Virology. In: Knipe D.M., Howley P.M., Griffin D.E., Lamb R.A., Martin M.A., Roizman B., eds. Fields virology. Philadelphia: Lippincott Williams Wilkins, 2013. Vol. 1: 414–52.
6. Носик Н.Н., Стаханова В.М. Лабораторная диагностика вирусных инфекций. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2000; 2(2): 70–8.
7. Чернова Н.Г., Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Клясова Г.А., Рощина Л.С., Грачева А.Н, Костина И.Э., Аль-Ради Л.С., Моисеева Т.Н., Кравченко С.К. Вирусные поражения слизистых оболочек органов желудочно-кишечного тракта у больных лимфомами. Тер. архив 2014; 86(7): 93–6.
9. Pellett P.E., Roizman B. Herpes viridae. In: Knipe D.M., Howley P.M., Griffin D.E., Lamb R.A., Martin M.A., Roizman B., eds. Fields virology. Philadelphia: Lippincott Williams Wilkins, 2013. Vol. 2: 1802–2080.
11. Selim H.S., Abou-Donia H.A., Taha H.A., El Azab G.I., Bakry A.F. Role of occult hepatitis B virus in chronic hepatitis C patients with flare of liver enzymes. European Journal of Internal Medicine 2011; 22(2): 187–90. DOI:10.1016/j.ejim.2010.12.001
12. Allain J.P., Mihaljevic I., Gonzalez‐Fraile M.I., Gubbe K., Holm‐Harritshøj L., Garcia J.M. Infectivity of blood products from donors with occult hepatitis B virus infection. Transfusion 2013; 53(7): 1405–15. DOI:10.1111/trf.12096.
13. Tseng T.C., Liu C.J., Yang H.C., Su T.H., Wang C.C., Chen C.L., Fang‐Tzu Kuo S., Liu C.H., Chen P.J., Chen D.S., Kao J.H. Determinants of spontaneous surface antigen loss in hepatitis B e antigen–negative patients with a low viral load. Hepatology 2012; 55(1): 68–76. DOI: 10.1002/hep.24615.
14. Allison R.D., Conry-Cantilena C., Koziol D., Schechterly C., Ness P., Gibble J., Kleiner D.E., Ghany M.G., Alter H.J. A 25-year study of the clinical and histologic outcomes of hepatitis C virus infection and its modes of transmission in a cohort of initially asymptomatic blood donors. Journal of Infectious Diseases 2012; 206(5): 654–61. DOI: 10.1093/infdis/jis410.
15. Carreño V., Bartolomé J., Castillo I., Quiroga J.A. New perspectives in occult hepatitis C virus infection. WJG 2012; 18(23): 2887. DOI: 10.3748/wjg.v18.i23.2887
16. Tikhomirov D., Garanzha T., Troitskaya V.V., Tupoleva T., Romanova T., Galstyan G., Parovichnikova E., Filatov F. Does neutropenia affects herpes virus reactivation in critically ill patients with hematological malignancies and pneumonia? Haematologica 2015; 100(1): 474.
17. Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Троицкая В.В., Галстян Г.М., Паровичникова Е.Н., Филатов Ф.П. Лабораторные маркеры герпесвирусных инфекций при нозокомиальных пневмониях у онкогематологических больных при лейкопении. Вестник гематологии 2014; X(4): 67–8.
18. Булиева Н.Б. Эпидемиология оппортунистических инфекций при гемобластозах. Медицинский альманах 2011; 5(18): 132–7.
19. Hsu J. W., Hiemenz J. W., Wingard J. R., Leather H. Viral Infections in Patients with Hematological Malignancies. Neoplastic Diseases of the Blood 2013; 1193-1–239. DOI: 10.1007/978-1-4614-3764-2_53.
22. Ogata M., Satou T., Kadota J. I., Saito N., Yoshida T., Okumura H., Tsudo M. Human herpesvirus-6 reactivation and HHV-6 encephalitis after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a multicenter, prospective study. Clin. Infect. Dis. 2013; 57(5): 671–8. DOI: 10.1093/cid/cit358
23. DiMaio D., Fan H. Viruses, Cell Transformation, and Cancer In: Knipe D.M., Howley P.M., Griffin D.E., Lamb R.A., Martin M.A., Roizman B., eds. Fields virology. Philadelphia: Lippincott Williams Wilkins, 2013. Vol. 1: 153–88.
24. Волкова М.А., ред. Клиническая онкогематология. Руководство для врачей. М.: Медицина, 2008.
25. Туполева Т.А., Игнатова Е.Н., Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Ярославцева Н.Г., Гуляева А.А., Грумбкова Л.О., Филатов Ф.П., Молекулярные методы диагностики – удобный инструмент для выявления скрытых вирусных инфекций у доноров крови. Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. М., 2014; 1: 441.
ОРВИ и грипп имеют респираторные симптомы и общие. Их можно распознать по катаральным признакам со стороны дыхательных путей и общей симптоматике, характерной для большинства заболеваний.
Современные методы диагностики данной группы заболеваний
Различают несколько видов диагностики, которые различаются по особенностям проведения и методу выявления возбудителя. Это:
- экспресс-методы;
- серологическая диагностика;
- вирусологическая диагностика.
Первая группа - экспресс-методики. Это быстрый способ подтвердить или исключить наличие болезни. Используется метод флюоресценции и ПЦР. Рассмотрим их подробнее.
Изучение флюоресцирующих антител - МФА. Способ основан на определении антигенов к вирусу в эпителиальных клетках носовой слизистой, на конъюнктиве (если есть глазные поражения). Антитела при действии антигена реагируют специфическим свечением, которое легко заметить при микроскопическом исследовании. Этот параметр считается маркером диагностики и является основой для подтверждения результата. Способ имеет диагностическую ценность начиная с 3 и заканчивая 5 днем заболевания. Чувствителен к таким антигенам: вирус гриппа типа А, В, вирус парагриппа, аденовирусы и возбудитель РС-инфекции. Это удобный и быстрый метод, не требующий особых ресурсов, который часто применяется в ходе диагностики.
Метод полимеразно-цепной реакции базируется на основе обнаружения участков нуклеиновых кислот генетического материала вируса и определении их групповой принадлежности по этому критерию. Методика имеет высокую диагностическую ценность, является современным и качественным способом подтверждения заболевания. Считается “золотым стандартом” диагностики, так как не дает ложных результатов и является специфическим для определения конкретных патогенов, широко применяется в стационарных и амбулаторных условиях.
Вирусологические методики основаны на чистом выделении вирусных микроорганизмов и их конкретных штаммов, за чем следует их прикрепление к клеточным культурам в лабораторных условиях. Далее следует определение вида вируса с помощью ПЦР или других реакций. Метод требует значительных ресурсов, довольно длительный и трудоемкий. Его ценность заключается в получении эпидемиологических данных и основе для научных работ. То есть, детальное изучение вируса, частоты его распространения позволяет прогнозировать эпидемическую картину, создавать вакцины. Для исследования берется мазок из носа и носоглотки. Материал пригоден в течении 3-5 дня заболевания. С помощью вирусологических методов можно определить такие возбудители:
Серологические методы диагностики - это ретроспективное исследование, которое дает точные данные относительно стадии процесса, степени активности и типа возбудителя. Используется для эпидемиологических целей.
Для анализа используется сыворотка крови, в которой необходимо определить количество и виды антител. Используется известный антиген вируса. При возникновении реакции с материалом пациента формируются иммунные комплексы антиген-антитело, что подтверждает диагноз. Для диагностики также важен прирост титра антител, для чего используются парные сыворотки.
Результат имеет высокую точность и может определиться даже если все другие методы не дали результата, так как имеет высокую чувствительность. особенно важно использование метода для стертых форм с минимальными клиническими проявлениями. Сыворотки для анализа берутся в начале болезни, а также через 10-14 дней после её завершения. Используется метод для подтверждения наличия в организме таких возбудителей: вирусы гриппа А, В, возбудители парагриппа, аденовирусы и РС-вирусы.
Наличие вируса гриппа можно подтвердить с помощью РТГА - реакции торможения геммааглютинации. Метод основан на свойстве снижения гемагглютинирующих способностях вируса, если в крови есть антитела к нему. Для этого используется кровь с эритроцитами, антиген. Препараты крови берутся парными, в начале болезни, и в период выздоровления. Метод имеет высокую диагностическую ценность, точный и чувствительный.
Виды исследуемого материала и особенности сдачи
Для диагностики используются смывы из носа, мазки из носовых ходов, носоглотки, а также препараты крови.
Забор мазка и смыва проводит медицинский персонал. Он следит за тем, чтобы препараты строго соответствовали должной локализации. Забор проходит в чистых условиях, стерильными инструментами и в стерильную тару. До того, как взять мазки пациента просят высморкаться, чтобы очистить носовые ходы от слизи. Зонд вводится легко, на глубину 2-3 см. Проводится стандартное движение по нижней части носового хода и под раковиной носа. Необходимо, чтобы забор происходит в современной клинике, где есть возможность правильно хранить и транспортировать собранный материал в короткий срок до лаборатории.
Мазок из глотки берется по похожей методике, чтобы затронуть те участки слизистой, на которой скапливается возбудитель. Перед забором необходимо легко прополоскать рот, чтобы взятый материал был чистым. Желательно забирать материал на 3-й день после начал болезни.
Нормы и отклонения от них, расшифровка результатов
Экспресс-тест дает результаты сразу после диагностики, его расшифровка не вызывает трудностей, так как определяет наличие вируса или его отсутствие в организме.
Серологические реакции более сложные и могут расшифровываться по разному: наличие антител класса М говорит об острой стадии процесса, антитела G формируются при хроническом течении.
Сроки готовности результатов
Результаты исследования готовы на 1-2 день после сдачи. Экспресс-тест дает результат сразу. Серологические методы требуют больше затрат времени для сравнения титров антител. Более быстрые методы важны для диагностического процесса, а те, что более затратны - для эпидемиологического и научного исследования.
Скорость диагностики зависит от правильности сдачи препаратов, условий лаборатории, качества реактивов.
Вовремя сданный анализ позволяет точно и быстро определить диагноз. Это - залог правильного и эффективного лечения. Если болезнь запустить, она грозит осложнениями, которые особенно опасны, если у человека грипп. Это актуально для детей, пожилых людей, беременных женщин и лиц с дефицитом иммунной системы, ведь осложнения чаще всего проявляются у них.
Лаборатория АО "СЗЦДМ" предлагает услуги, обеспечивающие комплексное и преемственное лабораторное обследование пациента
Диагностика В медицинских центрах АО "СЗЦДМ" проводят качественные диагностические исследования всего организма
Лечение Наши медицинские центры ориентированы на обслуживание пациентов в амбулаторном режиме и объединены единым подходом к обследованию и лечению пациентов.
Реабилитация Реабилитация - это действия, направленные на всестороннюю помощь больному человеку или инвалиду для достижения им максимально возможной полноценности, в том числе и социальной или экономической.
Выезд на дом Внимание! Действует акция "Выезд на дом - 0 рублей"
Профосмотры АО "СЗЦДМ" проводит профилактические осмотры работников, которые включают в себя - комплексы лечебных и профилактических мероприятий, проводимых для выявления отклонений в состоянии здоровья, профилактики развития и распространения заболеваний.
Взятие и вид материала
1 . Время взятия: взятие материала следует проводить в остром периоде инфекции, а в случае серологических исследований также после 2–4 нед. (с целью выявления динамики изменений концентрации антител).
2 . Вид, способ взятия и транспортировка материала: зависит от клинической формы инфекции и этиологического фактора, а также от используемого диагностического метода →табл. 28.2-1 и ниже.
