Продуцент вакцины против гепатита в

В.Н.Борисова, В.А.Мельников, АОЗТ НПК "Комбиотех Лтд.", Академия медико-технических наук, Москва

ОТЕЧЕСТВЕННАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ГЕПАТИТА В

В Российской Федерации, как и в большинстве стран мира, гепатит В давно стал общегосударственной проблемой (экономический ущерб в России составляет не менее 2 млрд. рублей в год). Снизить заболеваемость гепатитом В и затем ликвидировать ее на всей территории Российской Федерации можно, главным образом, с помощью массовой вакцинопрофилактики высокоэффективными вакцинами.

Отечественная вакцина против гепатита В разрабатывалась с учетом того, что в России наибольшее распространение (95-98%) имеет вирус гепатита В с субтипом HBsAg - "ayw" [3]. Хотя детерминанта "a" является основной в формировании иммунного ответа, обеспечивающей перекрестный иммунитет к различным субтипам антигена, по мнению ряда авторов [7, 9, 10], рационально применять вакцину, соответствующую серотипу вируса, наиболее распространенному на данной территории. Это подтверждается последними наблюдениями об изменении субтипа поверхностного антигена вируса гепатита В с "adw" на "ayw" в связи с изменениями геном вируса в организме больных гепатитом В [10].

Разработка первой отечественной рекомбинантной дрожжевой вакцины против гепатита В была завершена НПК "Комбиотех Лтд." в 1992 году и после полного цикла государственных испытаний внесена в Государственный реестр лекарственных средств. При иммунизации отечественной вакциной против гепатита В можно рассчитывать на защиту от инфекции практически 90% привитых в течение 7-10 лет.

Вакцина по своим характеристикам соответствует требованиям ВОЗ, не уступая зарубежным аналогам, зарегистрированным в России. Вакцина НПК "Комбиотех Лтд." утверждена также в качестве отраслевого стандартного образца для определения иммуногенной активности вакцины против гепатита В рекомбинантной дрожжевой жидкой (ОСО 42-28-202-98).

Рекомбинантная дрожжевая вакцина против гепатита В производства НПК "Комбиотех Лтд." представляет собой поверхностный антиген HBsAg (подтип "ayw") вируса гепатита В, выделенный из штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae, сорбированный на геле алюминия гидроксида.

Антиген, синтезируемый рекомбинантными клетками пекарских дрожжей в оптимальных условиях культивирования, выделяют из дрожжевого экстракта и очищают с использованием различных видов хроматографии и ультрацентрифугирования в градиенте плотности. В технологической схеме очистки не используется аффинная хроматография, при применении которой возможно загрязнение вакцинного препарата чужеродными белками. Схема очистки аппаратурно проста, включает применение отечественных сорбентов и ультрафильтрационных материалов. Все используемые реактивы разрешены для фармацевтической промышленности и безопасны. Степень чистоты вакцины превышает 98%.

Процедура контроля качества обеспечивает выпуск вакцины, соответствующей по своим параметрам всем требованиям Национального органа контроля и рекомендациям ВОЗ. Все серии выпускаемой вакцины в обязательном порядке проходят предреализационный контроль в Национальном органе контроля (ГИСК им. Л.А.Тарасевича).

Вакцина выпускается по 1 мл с содержанием HBsAg 20 мкг (взрослая доза) и 0,5 мл с содержанием HBsAg 10 мкг (детская доза). Консервант - мертиолят в концентрации 0,005%. Срок годности вакцины - 3 года. Схемы применения вакцины аналогичны схемам для зарубежных аналогов (0-1-6 мес. - стандартная, "классическая" схема и 0-1-2 мес. - "короткая", экстренная).

В период с 1992-1999 гг. компания реализовала в России и за рубежом более 500 тыс. взрослых доз вакцины (рекламаций не было). В настоящее время производственные мощности НПК "Комбиотех Лтд." позволяют выпускать ежегодно свыше 1,5 млн. взрослых доз вакцины в условиях GMP.

Государственные клинические испытания отечественной рекомбинантной вакцины против гепатита В, проведенные ГИСК им. Л.А.Тарасевича под руководством проф. М.А.Горбунова в условиях строго контролируемого эпидемиологического опыта, позволили сделать вывод о низкой реактогенности, специфической безопасности и высокой иммунологической активности вакцины [8]. Под наблюдением находились 234 человека в возрасте 20-22 лет, из которых методом случайной выборки были сформированы 4 группы по 58 человек в каждой (единица выборки - 1 человек).

Изучение наличия и степени побочного действия вакцины, проведенное в условиях клинико-лабораторного наблюдения за привитыми, не выявило каких-либо отклонений от физиологической нормы показателей периферической крови и мочи, частоты и характера интеркуррентных заболеваний при практически полном отсутствии местных проявлений поствакциональных реакций.

При иммунизации 952 человек в возрасте 20-22 лет в закрытом организованном коллективе не было зарегистрировано ни одного случая повышения температуры выше 37,5°С, жалоб на плохое самочувствие и каких-либо местных проявлений постпрививочных реакций.

Оценка иммунологической активности отечественной рекомбинантной вакцины против гепатита В в условиях контролируемых испытаний выявила 92,5% положительных реакций у серонегативных лиц, определенных через месяц после иммунизации по схеме 0-1-2 мес., а через месяц после иммунизации по схеме 0-1-6 мес. - 97,5%. При этом учитывались только лица, у которых титр антител превышал защитный уровень (10 МЕ/л).

При иммунизации по схеме 0-1-6 мес. 66,6% привитых имели титры более 1000 МЕ/л.

Учитывая связь уровня специфических антител с продолжительностью иммунитета, можно рассчитывать на защиту от гепатита В практически у 90% привитых, по крайней мере в течение 7-10 лет.

Результаты применения вакцины для иммунизации новорожденных и детей в возрасте от 6 мес. до 4,5 лет, полученные также ГИСК им. Л.А.Тарасевича, подтвердили низкую реактогенность и высокую иммуногенность вакцины (серопротекция составила 100%).

Высокая эффективность и хорошая переносимость производственных серий вакцины НПК "Комбиотех Лтд." была подтверждена в клинических исследованиях [1, 2, 4]. В.Г.Акимкиным. и соавт. в 1996-1997 гг. в условиях крупного стационара оценены различные схемы вакцинации. При вакцинации 1492 сотрудников крупного стационара выявлена высокая иммунологическая активность как при стандартной, так и при экстренной схемах вакцинации. Частота сероконверсий составила от 93,8 до 98,5%. Реакции на введение вакцины отмечались у 0,8±0,05% иммунизированных, проявляясь в виде местного воспаления. Серологические исследования, проведенные через 2 года в изучаемых группах, не позволили выявить значимых отличий от показателей коллективного иммунитета, установленных сразу после вакцинации. Средние геометрические титры в группах вакцинированных по стандартной и экстренной схемам, составили 1649±70,1 и 442±31,8 МЕ/л соответственно. При этом не выявлено ни одного вновь зарегистрированного случая заболевания или инфицирования вирусом гепатита В сотрудников, получивших полный или рудиментарный (двукратное введение) курс вакцинации. В результате проведенного мероприятия заболеваемость желтушными формами вирусного гепатита В и частота впервые выявленного носительства HBsAg среди сотрудников стационара в целом уменьшилась в 3,5-5 раз, а среди ряда отделений особого риска заражения гемодиализа, гематологии и др.) - в 10-20 раз при охвате вакцинацией 98-100% [2]. Авторы особо подчеркивают результативность применения двукратной схемы вакцинации с интервалом 4-5 мес. от первого введения. Несмотря на незавершенность курса иммунизации, более 80% лиц имели уровень специфических антител в крови, превышающий защитный и сохраняющийся в течение всего периода наблюдения.

Отечественная вакцина против гепатита В безопасна и защищает от инфекции детей с онкогематологической патологией.

Вакцина против гепатита В производства НПК "Комбиотех Лтд.", кроме того, является основой для разрабатываемых новых комбинированных вакцин и готовых форм препарата. Так, в настоящее время проходит государственную регистрацию комбинированная вакцина против гепатита В, дифтерии и столбняка.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Столбиков А. С., Рекославская Н. И., Саляев Р. К.

воздействий внешней среды развитием большей доли неассимилирующих тканей, что можно рассматривать как проявление защитной функции. Фотосинтетический аппарат ели сибирской состоит главным образом из ассимилирующей ткани. Можно предположить, что эволюция фотосинтетического аппарата сосны обыкновенной шла в направлении увеличения доли структурных тканей и повышения фотосин-тетической активности мезофилла, а у ели сибирской — по пути увеличения массы ассимилирующей ткани, без усиления структуры хвои и повышения активности работы мезофилла. Возможно, большая уязвимость мезофилла ели сибирской к неблагоприятному воздействию внешних факторов, таких как засуха и высокая температура, объясняет ее мезофитность, строгую приуроченность к увлажненным местам произрастания. У сосны обыкновенной большая защищенность мезофилла и его высокая фото-синтетическая активность позволяет ей произрастать в более широком ареале, что объясняет ее распространение не только в районе проведения исследований, но и за его пределами.

1. Фурст Г.Г. Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей / Г.Г. Фурст.

- М.: Наука. 1979. - 153 с.

2. Щербатюк А.С. Многоканальные установки с СО2 — газоанализаторами для лабораторных и полевых исследований / А.С. Щербатюк // Инфракрасные газоанализаторы в изучении газообмена растений. — М.: Наука, 1990. — С. 38 — 54.

А.С. Столбиков, Н.И. Рекославская, Р.К. Саляев

получение растений томата, трансформированных геном pRES2-S-HDEL, с целью разработки кандидатной съедобной вакцины против гепатита в

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН (Иркутск)

Г епатит В — очень распространенная и опасная вирусная инфекция. Каждый год в мире фиксируется 50 млн. заболевших только острой формой гепатита В. Из них до 600 тыс. больных умирает (Амосов, 2006). Число носителей этого заболевания возросло за 10 лет с 200 млн. до 300 млн. человек (Purcell, 1994; Thanavala et al., 1995).

Целью настоящей работы явилось получение трансгенных по гену preS2-S-HDEL растений томата, продуцирующих основной антигенный белок вируса гепатита В HBsAg.

Целевой ген preS2-S кодирует 2 поверхностных полипептида оболочки гепатита В. Исследования показывают, что при совместной экспрессии генов S и preS2 иммунный ответ проявляется сильнее (Jilg, 1998; Joung et al., 2007). Из этого следует, что при введении двух этих генов в геном растения, можно получить более эффективную вакцину против гепатита В. Для большей стабильности и увеличения содержания антигенного белка в ряде работ используют сигнальную последовательность HDEL (гистидин-аспартат-глутамат-лейцин), адресующую синтезируемый антиген в эндоплазматический ретикулум. Поэтому в настоящей работе в качестве целевого гена использована последовательность preS2-S-HDEL.

Трансформация эксплантов проводилась уколом инфицированной Agrobacterium tumefaciens иглой в верхушечную точку роста между семядолями. Затем трансформированные проростки помещали на

селективную среду, содержащую 50 — 60 мг/л канамицина, где в течение 2 — 4 недель у них образовывались зачатки корешков, в случае если трансформация прошла успешно.

Устойчивость к антибиотику определяли по способности растений к корнеобразованию и дальнейшему росту, а также отсутствию хлороза. После того как у эксплантов образовывались корешки, растения пересаживались с селективной среды в воду на одни сутки, а затем в сосуды с влажной фильтровальной бумагой, где они находились до тех пор, пока у них не образовывалась разветвленная корневая система, обычно этот процесс занимал от 2 до 4 недель.

После того, как растения образовали хорошо разветвленную корневую систему, их пересаживали в сосуды с влажным стерильным песком. В этих сосудах растения подвергались адаптации к внешним условиям, в особенности к воздействию более сухой атмосферы. Затем растения пересаживали в почву. Образовавшиеся плоды в недозрелом и зрелом состояниях собирали и помещали на хранение в холодильную камеру с температурой воздуха —20 °С.

Успешность инсерции целевого гена в ядерный геном томата выявляли с помощью ПЦР анализа листьев и плодов растений, которые прошли селекцию на канамицине. Наличие основного антигенного белка гепатита В в тканях трансформированных растений выявлялось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). После положительного ИФА, в целях избежания случайной ошибки, а также для подтверждения эффективности тест-системы, проводили подтверждающий ИФА.

Полученные результаты позволили заключить, что данный метод генетической трансформации вполне пригоден для растений томата. Эффективность трансформации составила 2,3 %. Результаты селекции на среде с канамицином подтвердили экспрессию гена npt II в трансгенных растениях. Была подобрана система адаптации растений, прошедших селекцию, к условиям внешней среды. В итоге были получены вполне здоровые и жизнеспособные трансгенные растения, обладающие нормальным плодоношением, фенотипически не отличающиеся от контрольных не трансформированных растений. С помощью ПЦР и иммуноферментного анализов установлена интеграция и экспрессия целевого гена preS2-S-HDEL в листьях и плодах трансформированных растений поколения Т0. Получены также растения поколения Т1 в листьях и плодах которых с помощью прямого и подтверждающего иммуноферментного анализа обнаружено значительное количество основного антигенного белка гепатита В HBsAg, что свидетельствует об успешной экспрессии целевого гена.

Полученные результаты открывают возможность использование в дальнейшем плодов растений томата трансгенных по гену preS2-S-HDEL, в предклинических и клинических испытаниях в качестве кандидатной съедобной вакцины против гепатита В.

Работа выполнена при поддержке гранта МНТЦ № 2176р.

2. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen / Y. Thanavala, Y-F. Yang, P. Lyons et al. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1995. - Vol. 92, N 8. - P. 3358-3361.

3. Jilg W. Novel hepatitis B vaccines / W. Jilg // Vaccine. - 1998. - Vol. 16. - P. 65-68.

4. Oral immunogenicity of potato-derived HBsAg middle protein in BALB/c mice / Y.H. Joung, J.W. Youm, J.H. Jeon et al. // Vaccine. - 2007. - Vol. 25, N 3. - P. 577-584.

5. Purcell R.H. Hepatitis Viruses: Changing Patterns of Human Disease / R.H. Purcell // PNAS. - 1994.

- Vol. 91. - P. 2401 -2406.

И.А. Теркина1, Т. Мимура2

участие микробного сообщества в мобилизации фосфатов в озере бива(япония)

1 Лимнологический институт СО РАН (Иркутск) 2 Университет г. Кобе (Кобе, Япония)

Озеро Бива - это древнее и самое большое пресноводное озеро в Японии с площадью 670 км2 и максимальной глубиной 104 м. Озеро состоит из двух бассейнов: северного (глубоководного) и южного (мелководного). В начале XX века северный бассейн был олиготрофным. В 60-х годах прошлого века над озером нависла серьезная экологическая угроза, связанная с интенсивным эвтрофированием водоема. Результатом загрязнения явилось ускоренное повышение биопродуктивности водоема в результате накопления в воде биогенных веществ. Это могло привести к нехватке кислорода в воде, заморам, гибели флоры и фауны. Японцы приняли самые решительные меры по спасению одного из древнейших озер планеты и на сегодняшний день трофический статус озера - мезотрофное. В процессе эвтрофирования водоемов особая роль принадлежит фосфору - одному из важнейших биогенных элементов, необходи-

Сравнительное изучение специфики гетерологической экспрессии гена HBsAg вируса гепатита В в дрожжах S.cerevisiae в условиях микрогравитации и земного притяжения и установление приемов оптимизации синтеза.

Использование дрожжей-сахаромицетов в качестве продуцентов разнообразных биологически активных веществ имеет большое распространение в современной биотехнологии, так как они объединяют в себе ряд ценных технологических свойств – простота и экономичность культивирования, отсутствие эндотоксинов, наличие адекватного клеточного процессинга синтезируемых продуктов. Последнее обстоятельство в большой степени определило успех применения дрожжей в качестве продуцентов генно-инженерных гетерологичных белков. В настоящее время созданы разнообразные дрожжевые рекомбинантные вакцины и диагностикумы, многие из которых успешно применяются в клинике для профилактики, лечения и диагностики различных заболеваний. Примером успешной разработки генно-инженерного препарата на основе клеток дрожжей-сахаромицетов является конструирование рекомбинантной вакцины против вируса гепатита B, эффективность и безопасность которой доказана многими исследованиями.

Разрабатываемая в СПбНИИВС технология получения рекомбинантной вакцины гепатита B основана на использовании в качестве продуцентов трансформированных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae,

Процесс культивирования продуцентов в промышленных и полупромышленных условиях является двустадийным и не оптимален, поскольку занимает значительное время и требует ряда малоэффективных и трудоемких операций. Одним из возможных путей оптимизации процесса является создание условий для повышения стабильности и продуктивности работы участка генома, контролирующего выработку HBs-антигена вируса гепатита B. Этого можно достичь, варьируя различные факторы окружающей среды, как биотические, так и абиотические. В качестве таких факторов предлагается использовать условия космического полета на борту космических кораблей.

В эксперименте решались следующие задачи:

- создание коллекции клонов штамма-продуцента с наследуемыми отклонениями в уровне экспрессии гена HBsAg;

- проведение генетического анализа и рестрикционного картирования плазмид в мутантных клонах;

- определение экспрессирующей активности и параметров культивирования в наземных условиях;

- представление схемы экспериментов по анализу синтеза HBsAg в условиях микрогравитации и обработка данных.

Проводимые исследования по сравнительному анализу специфики генноинженерного анализа синтеза рекомбинантного HbsAg вируса гепатита В дрожжах как в земных условиях, так и в условиях микрогравитации являются оригинальными и не имеют аналогов. Новизна экспериментов заключается не только в выборе объекта исследования, но и в постановке конкретных задач КЭ, а именно, определить влияние факторов космического полета на все этапы гетерологической экспрессии HbsAg и стадии промышленного культивирования продуцентов.

- двенадцать пробирок, в каждой пробирке находится по 1 ампуле с лиофильно высушенным материалом;

- 4 тубы, в каждой тубе находится 1 пробирка с биообъектами на питательной среде.

- регистратор температуры (РТ).

Пробирки и тубы герметичны.

Проведение эксперимента позволит получить максимально полную характеристику потенциала гетерологической экспрессии гена HbsAg в дрожжах сахаромицетах, как для отдельных внутриклеточных этапов синтеза, так и стадии промышленного культивирования. В итоге, будут сформулированы принципы повышения продуктивности штаммов-продуцентов, стабильности их экспрессии и оптимизации производства вакцины против гепатита В.

Объектом исследований в КЭ были клоны промышленного рекомбинантного штамма Y-1678 дрожжей S.cerevisiae – продуцента поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). Предварительно в ФГУП СПбНИИ вакцин и сывороток ФМБА была получена коллекция клонов штамма-продуцента с измененным уровнем синтеза HBsAg, проведен анализ параметров культивирования продуцента и выделены клоны, представляющие интерес для дальнейших исследований в наземных и космических условиях. Штаммы представляли собой клоны промышленного рекомбинантного штамма Y-1678: диплоидные клетки, гетерозиготные по типу спаривания, трансформированные плазмидой pSc 3954, в составе которой клонированы гены HBsAg и лактамазы Е. coli. Отличия между штаммами заключались в разном наборе мутаций в гетерозиготном состоянии и различном уровне экспрессии HBsAg. Для космического эксперимента клетки штаммов были представлены в трёх вариантах: лиофильно высушенные, посеянные на плотную среду YEPD и внесённые в жидкую среду YEPD.

Анализ летных и наземных серий штаммов проводился по следующим параметрам:

1) морфологическая характеристика клеток;

2) уровень накопления биомассы при росте в жидкой среде;

3) уровень синтеза вирусного антигена;

4) Показатели митотической стабильности экспрессирующего вектора по признаку сохранения LEU+-фенотипа;

5) уровень гетерогенности популяции клонов штамма по признаку количества синтезируемых гетерологичных белков HBs-антигена и лактамазы Escherichia coli.

Показано, что условия микрогравитации являются вполне адекватными для функционирования живых микроорганизмов и могут служить дополнительным фактором отбора для селекционной работы. Лиофильно высушенные штаммы проявляют стабильность и устойчивость к стрессовым воздействиям космического полета по признаку накопления биомассы в жидкой среде после оживления культур и нескольких пассажей: уровень накопления биомассы не отличается у наземных и летных вариантов.

В случае лётных серий штаммов S. cerevisiae D24 и S. cerevisiae D25 происходит статистически достоверное увеличение числа клонов фенотипических групп с крайними показателями уровня экспрессии. Увеличение степени гетерогенности при сохранении типов фенотипических групп свидетельствует о наличии факторов в условиях космического полёта, усиливающих генетическую нестабильность генно-инженерного синтеза. Данное явление имеет положительную сторону, так как в популяции растёт число клонов с увеличением продукции вирусного белка, которые могут рассматриваться как перспективные суперпродуценты в промышленных масштабах.

В КЭ отмечается сохранение высокого уровня митотической стабильности в случае штаммов S. cerevisiae D26 и S. cerevisiae D27.

Степень гетерогенности популяции клеток дрожжевого продуцента по уровню синтеза HBsAg является, с одной стороны, его стабильным признаком, а с другой – может служить основой селекции суперпродуцентов. Условия микрогравитации могут влиять на показатели гетерогенности популяции продуцентов, что может служить важной предпосылкой отбора суперпродуцентов.

Обобщение многолетних исследований позволило постановщику КЭ сделать следующие выводы.

1. Нахождение на борту космического корабля дрожжей сахаромицетов в жидкой среде и на поверхности плотного агара не является оптимальным. Тем не менее, лётные образцы штаммов Saccharomyces cerevisiae могут быть взяты для дальнейшего анализа. Лиофильно высушенные штаммы проявляют стабильность и устойчивость к стрессовым воздействиям космического полета по этому признаку сохранения жизнеспособности.

2. Морфология клеток зависит от жизнеспособности жидких культур, а регидратированные культуры лётных и наземных образцов на уровне светового микроскопа явных отличий не имеют.

3. Уровень накопления биомассы разными штаммами S. cerevisiae при росте в жидкой среде после пребывания в условиях космического полёта в лиофильно высушенном состоянии снижается на 1–3 порядка в зависимости от штамма и, главным образом, сроков полёта. Это может иметь двоякое значение. С одной стороны, если уменьшается максимальный урожай клеток при сохранении значений титра антигена, это облегчает процесс очистки антигена. С другой стороны, при снижении уровня накопления биомассы и одновременном снижении титра антигена процесс становится экономически не выгодным.

4. Стабильность антигенных характеристик HBs-антигена не зависит от времени хранения на Земле и в условиях полета и определяется главным образом свойствами штамма. В некоторых случаях длительное, более 6 месяцев, пребывание в условиях космического полёта снижает антигенные характеристики штаммов S. cerevisiae.

5. Полученные в земных условиях данные по оптимизации параметров культивирования некоторых штаммов-продуцентов сохраняют свою актуальность и для летных серий штаммов: в модифицированной среде HPi' уменьшается максимальный урожай клеток при сохранении значений титра антигена, что облегчает процесс очистки антигена.

6. При длительных полётах более 6 месяцев снижается митотическая стабильность экспрессирующего вектора по признаку сохранения LEU+-фенотипа штаммов S. cerevisiae. В то же время сохраняется тенденция более высокого уровня стабильности в случае штаммов S. cerevisiae D26 и S. cerevisiae D27.

7. По уровню синтеза вирусного антигена выявлены три фенотипические группы: со среднестатистическими показателями экспрессии, с превышением уровня экспрессии на 2 титра и с уменьшением уровня экспрессии на 2 титра. С этими клонами в СПбНИИСВ ведется дальнейшая селекционная работа и отбор перспективных вариантов. Пребывание в космосе, также как и хранение в земных условиях для дрожжей S. cerevisiae, служит определённым фактором отбора клонов с нужными свойствами.

8. В результате полученных экспериментальных данных по лиофильно высушенной биомассе из ампулы №8, пенал № 18, экспонировавшейся на МКС в течение 10 месяцев (июль 2006г. – апрель 2007г.), после предварительного пребывания в космосе в течение 1 недели (экспедиции МКС-12 – МКС-13), были отобраны клоны, показавшие повышенную активность HBs- антигена вируса гепатита В. Из этих клонов была приготовлена экспериментальная серия вакцины гепатита В, соответствующая всем показателям качества и обладающая высокой активностью: уровень экспрессии Hbs-антигена был выше среднего на 30 %.

9. В процессе наземной селекции космических мутантов планируется стабилизировать свойства продуцентов HBs-антигена, провести депонирование этих клонов в музее производственных штаммов и на их основе отработать промышленную технологию производства вакцины против гепатита В для нужд здравоохранения.

Список публикаций в процессе редактирования.

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Нынь И. В.

В серии космических экспериментов установлено, что время пребывания на борту влияет на характер изменений, произошедших с Saccharomyces cerevisiae, рекомбинантными продуцентами HBs-антигена вируса гепатита B. Не обнаружено ярко выраженных отличий в морфологии клеток и в характере деления. Уровень накопления биомассы при росте в жидкой среде снижается на 1-3 порядка. Стабильность характеристик HBs-антигена не зависит от времени полета и определяется главным образом свойствами штамма. Растёт число клонов с увеличением продукции вирусного белка, которые могут рассматриваться как перспективные суперпродуценты в промышленных масштабах.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Нынь И. В.

обонятельных луковиц, так и головного мозга в целом от массы семенников, причем индексы показывают более выраженную связь между данными характеристиками. Можно предположить, что размеры центральных отделов обонятельного анализатора зависят от уровня продукции половых стероидов.

Что касается возможности использования аногенитального расстояния как способа оценки репродуктивной функции, то данный способ, возможно, не всегда корректен.

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика. 1998. -459 с.

2. Давыдова Ю.А. Изменение индекса семенника рыжей полевки в разные фазы популяционного цикла // Научные чтения памяти проф. В.В. Стан-чинского. - Смоленск: Из-во Смоленского гос. Пед. университета. 2004. -Вып. 4. - С. 353-356.

3. Попова Н.В., Полетаева И.И., Астаурова Н.В. Селекция мышей на вес мозга // Генетика. - 1997. - Т. 3, № 3. - С. 413-416.

4. Роговин К.А. Социальная среда и морфофизиологический статус молодых самцов в осенних группах большой песчанки (Rhombomys opimus Licht) // Журнал общ. биологии. - 2004. - Т. 65, № 5. - С. 426-432.

5. Drickemer L.C. Anogenital distance and dominance status in male house mice (Mus domesticus) // Aggress. Behav. - 1995. - Vol. 21, № 4. - P. 301-309.

6. Frinta D., Slabova M., Vohralik V. Why do male house mice have such small testes? // Zoological Science. - 2009. - V 26 (1). - P. 17-23.

7. Ophir A.G., delBarco-Trillo J. Anogenital distance predicts female choice and male potency in prairie voles // Physiol Behav. - 2007. - V 92 (3). - P. 533-540.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СИНТЕЗА HBS-АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА B В УСЛОВИЯХ ЗЕМЛИ И МИКРОГРАВИТАЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫМИ ПРОДУЦЕНТАМИ SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов Федерального медико-биологического агентства, г. Санкт-Петербург

В серии космических экспериментов установлено, что время пребывания на борту влияет на характер изменений, произошедших с Saccha-

готусез сегеугзгае, рекомбинантными продуцентами НБ8-антигена вируса гепатита Б. Не обнаружено ярко выраженных отличий в морфологии клеток и в характере деления. Уровень накопления биомассы при росте в жидкой среде снижается на 1-3 порядка. Стабильность характеристик ИБ8-антигена не зависит от времени полета и определяется главным образом свойствами штамма. Растёт число клонов с увеличением продукции вирусного белка, которые могут рассматриваться как перспективные суперпродуценты в промышленных масштабах.

Разнообразные биологические исследования, проведённые на космических станциях, свидетельствуют о том, что комплекс факторов космиче -ского полёта может существенно менять специфику и скорость процессов. Целью исследований в данном направлении является изучение влияния факторов космического полета на биообъекты и биотехнологические процессы, поиск и экспериментальная отработка базовых технологий получения перспективных биопродуктов в условиях микрогравитации. Особое внимание уделяется влиянию космических факторов на процессы синтеза белка генно-инженерными продуцентами, имеющими производственное значение, к числу которых относится Засскаготусе^' сегеуг^чае - продуцент ИВБ-антигена вируса гепатита Б. В настоящее время созданы разнообразные дрожжевые рекомбинантные вакцины и диагностикумы, многие из которых успешно применяются в клинике для профилактики, лечения и диагностики различных заболеваний. Примером успешной разработки генно-инженерного препарата на основе клеток дрожжей-сахаромицетов является конструирование рекомбинантной вакцины против вируса гепатита Б, эффективность и безопасность которой доказана многими исследованиями.

Для оптимизации крупномасштабного производства дрожжевой ре-комбинантной вакцины против гепатита Б актуальным является изучение специфики и факторов стабильности экспрессии гена ИВБ-антигена вируса гепатита Б в дрожжевых клетках. Сравнительный анализ синтеза нвб-антигена в условиях земли и микрогравитации, при наличии адекватных методик, позволит выявить особенности экспрессии, определить новые принципы повышения эффективности процесса.

Важный результат биологических исследований в космосе - установление того факта, что невесомость не обладает мутагенной активностью, по крайней мере в отношении генных и хромосомных мутаций. В экспериментах, имитирующих условия космоса, показано, что космическая среда менее губительна для микроорганизмов, чем для других, более сложных форм жизни [1].

ции на примере синтеза HBs-антигена вируса гепатита B, оптимизации этого процесса штаммами S. cerevisiae после пребывания их в космосе и последующего выделения клонов клеток-продуцентов. Результаты этих экспериментов отражены в экспресс-отчётах и промежуточных отчётах.

Для космического эксперимента клетки штаммов были представлены в двух вариантах: лиофильно высушенные и посеянные на плотную среду YEPD. Экспериментальные лётные серии представляли собой стерильно запаянные ампулы, содержащие 300 мкл лиофильно высушенной массы в среде YEPD с глицерином в соотношении 1:1, штамм-продуцент в концентрации 2-5 х 109 кл./мл, которые находились на борту станции при температуре от 0 до минус 17 °C и температуре атмосферы станции.

Культуры дрожжей выращивали на следующих средах: а) полная среда (YEPD); б) минимальная среда; в) селективная среда; г) для определения уровня экспрессии гена HBsAg дрожжи последовательно выращивали в средах с высоким (Hpi) и низким (Hpi') содержанием KH2P04; д) среды для определения в дрожжах бактериального фермента - лактамазы.

Культуры дрожжей инкубировали при температуре 30 °C, в случае жидких сред - в водяном шейкере при 200-250 об./мин.

Оценку митотической стабильности проводили двумя способами:

1. как процент клеток, сохранивших селективный маркёр плазмиды - прототрофность по лейцину или урацилу, от общего количества проанализированных клеток (не менее 300);

2. как скорость потери плазмиды на генерацию по формуле:

где i - часть клеток, которые теряют плазмиду в каждой генерации; a - фракция плазмидосодержащих клеток при посева в среду; b - фракция клеток, сохранивших плазмиду после х генераций.

Определение активности HBs-антигена проводили следующим образом. Клетки, трансформированные плазмидами pNMVG-3954, выращивали до стационарной фазы в среде YEPD, затем после отмывки засевали в среду Hpi' в концентрации 106 кл./мл и выращивали при интенсивном перемешивании. Осадок клеток растворяли в фосфатном буфере (0,1 M Na2HPO4, pH 7,5) с PMS до концентрации 109 кл./мл, после чего клетки подвергали механической дезинтеграции со стеклянными бусами.

Уровень активности антигена HBsAg определяли в осветлённых лиза-тах с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием стандартного эритроцитарного диагностикума (Горьковский ИЭМ). Для перевода титров РНГА в количественное содержание антигена использовали в качестве стандарта плазменный антиген известной концентрации того же производства.

Для трансформация дрожжей плазмидной ДНК использовали модифицированный метод Ito e. a. [2] с применением хлористого лития. Для этого: 1) ночную культуру клеток переносили в 100 мл среды YEPD в концентрации 5 х 105-106 кл./мл и выращивали при интенсивном перемешивании до Д 610 = 1,8-2,0; 2) клетки центрифугировали 10 мин при 4000 об./мин;

3) садок отмывали 10 мл ТЕ-буфера, после чего клетки оставляли на 17-20 ч в 2 мл раствора 0,2-0,45 М хлористого лития в ТЕ-буфере при +4 °C;

4) клетки осаждали на центрифуге 10 мин при 4000 об./мин, после чего к осадку прибавляли 200 мкл раствора хлористого лития и 20 мкл раствора плазмидной ДНК (1-5 мкг) и смесь оставляли на 30 мин во льду; 5) прибавляли равный объём 70 % ПЭГа на 1 ч при комнатной температуре; 6) проводили тепловой шок клеток в водяной бане при 42 °C в течение 3 мин, а затем оставляли клетки во льду на 5 мин; 7) клетки высевали на селективную среду по 50-200 мкл на чашку Петри.

Расщепление ДНК проводили с использованием реакции рестрикции. Разделение фрагментов ДНК проводили при помощи электрофореза в 0,8 % агарозном геле. После электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия.

Результаты и обсуждение. В результате подготовительных исследований, проведенных на Земле, установлено, что экспрессия HBsAg сопряжена с экспрессией гена ß-лактамазы, позволяющей фенотипически определять наличие синтеза HBsAg. Получена достаточно полная характеристика гетерологической экспрессии HBsAg в дрожжах в лабораторных и полупромышленных условиях (эксперименты по ре-трансформации LEU-клонов, культивирование на полной и селективной среде). Установлены типы мутаций и их норма реакции у штамма-продуцента (рестрикцион-ный анализ векторов показал, что мутационные изменения, обусловливающие нарушение в синтезе, затрагивают плазмидные молекулы, размер плазмиды уменьшается с 8,2 до 6,4, изменяется взаиморасположение Pst 1

и Hind III сайтов). Определены основные принципы оптимизации и стабильности синтеза: исключение аминокислот-содержащих органических компонентов среды - пептона и экстракта - приводит к росту числа клеток, содержащих плазмиду и, следовательно, к увеличению продукции в популяции.

После экспонирования материала на борту космического корабля в течение разных сроков (10 дней, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 и 24 месяцев) анализ летных и наземных серий штаммов проводился по следующим параметрам: 1) морфологическая характеристика клеток; 2) уровень накопления биомассы при росте в жидкой среде; 3) стабильность антигенных характеристик HBs-антигена; 4) Показатели митотической стабильности экспрес-сирующего вектора по признаку сохранения Leu-фенотипа; 5) уровень гетерогенности популяции клонов штамма по признаку количества синтезируемых гетерологичных белков HBs-антигена и ß-лактамазы E. coli. Клетки летных и земных серий штаммов S. cerevisiae исследовали в условиях лабораторного культивирования.

Морфологическая характеристика клеток. Клетки летных и земных серий штаммов S. cerevisiae исследовали путём микроскопирования. Было установлено, что морфология клеток зависит от жизнеспособности жидких культур, а регидратированные культуры лётных и наземных образцов на уровне светового микроскопа явных отличий не имеют. Морфологическое описание клеток следующее: округлые, с хорошо различимым ядром, размер около 7 мкм, почкующиеся формы имеют 1-2 почки. Более тонкие различия ультраструктуры клеток требуют дальнейшего исследования.

Уровень накопления биомассы при росте в жидкой среде. По данному показателю анализировали все лиофильно высушенные штаммы. Использовали среду Hpi и Hpi'. Уровень накопления биомассы разными штаммами S. cerevisiae при росте в жидкой среде после пребывания в условиях космического полёта в лиофильно высушенном состоянии снижался на 13 порядка в зависимости от штамма и, главным образом, сроков полёта.

Это может иметь двоякое значение. С одной стороны, если уменьшается максимальный урожай клеток при сохранении значений титра антигена, это облегчает процесс очистки антигена. С другой стороны, при снижении уровня накопления биомассы и одновременном снижении титра антигена процесс становится экономически не выгодным.

После 24 часов роста варианты земных и летных серий не отличались между собой по удельной скорости роста клеток д = 0,15-0,20 ч, по времени выхода на стационарную фазу роста - 15-18 часов, по максимальному урожаю клеток для соответствующих сред через 10 дней полёта. Материал через 15 месяцев полёта дал иные результаты: уровень накопления биомассы у всех штаммов был снижен на два-три порядка в лётных сериях, и на один-два порядка в контрольных наземных.

Таким образом, лиофильно высушенные штаммы проявили стабильность и устойчивость к стрессовым воздействиям кратковременного космического полета по признаку накопления биомассы в жидкой среде после оживления культур и нескольких пассажей: уровень накопления биомассы не отличался у наземных и лётных вариантов. После длительного хранения лиофильных культур на Земле уровень накопления биомассы в жидкой среде снизился незначительно. В модифицированной среде Hpi' уменьшился максимальный урожай клеток. Полученные в земных условиях данные по оптимизации параметров культивирования штамма-продуцента сохранили свою актуальность и для летных серий штаммов: в модифицированной среде Hpi' уменьшается максимальный урожай клеток при сохранении значений титра антигена, что облегчает процесс очистки антигена.

Стабильность антигенных характеристик HBs-антигена. Стабильность антигенных характеристик HBs-антигена при хранении лиофильно высушенных клеток на борту космического корабля и в земных условиях определяли путем измерения активности HBs-антигена в титрах РНГА. Полученные данные находились в пределах 1/2000-1/16000. Следовательно, стабильность антигенных характеристик HBs-антигена не зависит от времени хранения на Земле и в условиях полета и определяется главным образом свойствами штамма. В то же время, в некоторых случаях длительное, более 6 месяцев, пребывание в условиях космического полёта снижало антигенные характеристики штаммов S. cerevisiae.

Показатели митотической стабильности экспрессирующего вектора по признаку сохранения Ьеп+-фенотипа. Этот показатель изучали на лиофильно высушенном материале после его оживления. Митотическая стабильности экспрессирующего вектора по признаку сохранения Leu-фено-типа несколько снизилась, причём это касалось как лётных, так и наземных вариантов. Было замечено, что при длительных полётах более 6 месяцев этот показатель снизился у штаммов S. cerevisiae D24 и D 25. В то же время в случае штаммов D26 и D 27 наблюдали тенденцию более высокого уровня стабильности.

Уровень гетерогенности популяции клонов штамма по признаку количества синтезируемых гетерологичных белков HBs-антигена и ß-лактамазы E. coli. Уровень синтеза вирусного антигена определяли путем измерения активности HBs-антигена в титрах РНГА на лиофильно высушенных штаммах. Были выявлены три фенотипические группы:

- HBsAg+ BLA+ - со среднестатистическими показателями экспрессии;

- HBsAg++ BLA++ - с превышением уровня экспрессии на 2 титра;

- HBsAg+- BLA+- - с уменьшением уровня экспрессии на 2 титра.

Полученные данные показывают возможность анализа клонов с повышенным уровнем экспрессии нужных генов как в лётных вариантах, так и в наземных. Можно заключить, что пребывание в космосе, также как и

хранение в земных условиях для дрожжей S. cerevisiae, служит определённым фактором отбора клонов с нужными свойствами.

Среди проанализированных клонов гетерогенность популяций варьировала, тем не менее, это дало возможность провести отбор клонов уже после космического эксперимента и отобрать для дальнейшего использования варианты с превышением уровня экспрессии выше среднего на 2 и более титра. Следует отметить, что не удалось обнаружить закономерности, связанной со свойствами штамма и временем экспозиции в космосе -эта характеристика тоже варьировала.

В результате полученных экспериментальных данных, из лиофильно высушенной массы космического варианта были отобраны клоны, показавшие повышенную активность HBs-антигена вируса гепатита B. Из этих клонов была приготовлена экспериментальная серия вакцины гепатита B, соответствующая всем показателям качества и обладающая высокой активностью: уровень экспрессии HBs-антигена был выше среднего на два титра.

Полученные в результате космического эксперимента данные подтверждают возможность применения новых способов селекции суперпродуцентов HBs-антигена вируса гепатита B.

1. Воейкова Т.А., Табаков В.Ю. Сравнительный анализ влияния факторов космического полёта на процессы жизнедеятельности микроорганизмов при кратковременных космических полётах / Т. А. Воейкова, В.Ю. Табаков // Проблемы биохимии, радиационной и косметической биологии: 3 Международный симпозиум под эгидой ЮНЕСКО, посвящённый 100-летию со дня рождения академика Н.М. Сисакяна, Москва, Дубна, 24-28 января, 2007: Аннотации докладов. - Дубна, 2006. - С. 84-85.

2. Murray K. Hepatitis B virus antigens made in microbial cells immunize against viral infection / K. Murray, S.A. Bruce, H. Hinnenen et al. // EMBO. -1984. - Vol. 3/3. - P. 645-650.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЛИЯНИЯ КВЕРЦИТИНА И ДИГИДРОКВЕРЦИТИНА НА ЭРИТРОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

Самарский государственный университет, г. Самара

Для изучения влияния кверцитина и дигидрокверцитина на уровень окислительного стресса и на состояние компонентов антиоксидантной

* Профессор кафедры Биологической химии, доктор биологических наук.

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.

Шифр эксперимента:	Антиген
Информационная справка:	ИС Антиген_2013 г.doc
Направление НПИ:	4. Космическая биология и биотехнология
Секция КНТС:	Космическая биология и физиология
Наименование эксперимента:	Оптимизация гетерологической экспрессии в дрожжах-сахаромицетах в условиях микрогравитации на примере синтеза HBS антигена вируса гепатита В
Цель эксперимента:
Описание эксперимента:
Новизна эксперимента:
Научная аппаратура:
Ожидаемые результаты:
Полученные результаты: