Пцр системы для выявления вируса клещевого энцефалита

Исследование направлено на выявление антигенов и генетического материала возбудителей клещевого энцефалита и системного клещевого боррелиоза (болезни Лайма) в исследуемых клещах. Применяется в целях своевременной диагностики заболеваний, экстренной специфической профилактики и проведения целенаправленного патогенетического лечения.

Какие тесты входят в данный комплекс:

Клещевой энцефалит (ВКЭ), антиген
Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), определение РНК

Иксодовый клещ; клещевой энцефалит; вирус клещевого энцефалита; системный клещевой боррелиоз (болезнь Лайма), клещевой менингополиневрит, клещевой боррелиоз, иксодовый боррелиоз, хроническая мигрирующая эритема, эритемный спирохетоз, синдром Банноварта.

Синонимы английские

Ixodes tick; tick-borne encephalitis; tick-borne encephalitis virus; tick-borne borreliosis (Lyme borreliosis); Borrelia burgdorferi.

Иммуноферментный анализ: Клещевой энцефалит (ВКЭ), антиген
Полимеразная цепная реакция (ПЦР): Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ), определение РНК

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Общая информация об исследовании:

Клещевой энцефалит – это вирусное природно-очаговое трансмиссивное заболевание, характеризующееся преимущественным поражением центральной нервной системы. Возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Flavivirus семейства Togaviridae, группы Arboviruses. Инфекция носит сезонный (весенне-летний) характер и передается преимущественно с укусом клещей, при раздавливании внедрившегося насекомого, также возможен алиментарный путь передачи через инфицированное сырое молоко коров и коз. Основным резервуаром и переносчиком вируса являются клещи Ixodes persulcatus, Ixodes ricinus. Дополнительным резервуаром вируса являются грызуны, дикие животные и птицы. Заражение клеща происходит при укусе и кровососании инфицированных животных. При этом вирус проникает в органы и ткани клеща, преимущественно в слюнной аппарат, кишечник, половой аппарат, и сохраняется в течение всего периода жизни насекомых. Возбудитель клещевого энцефалита подразделяется на три подвида: дальневосточный, центрально-европейский и сибирский.

Инкубационный период заболевания длится от 3 до 21 дней, в среднем 10-14 дней. Клинические проявления носят разнообразный характер. Начальная фаза заболевания характеризуется лихорадкой, головной болью, миалгиями, возможно присоединение тошноты, рвоты, светобоязни. Далее развивается фаза неврологических расстройств, при которой происходит поражение центральной и периферической нервных систем. В зависимости от выраженности неврологических расстройств выделяют следующие формы заболевания: лихорадочную, менингеальную, менингоэнцефалитическую, менингоэнцефалополиомиелитическую и полирадикулоневритическую, двухволновый менингоэнцефалит. По степени тяжести инфекция может протекать в легкой, средней или тяжелой форме, что влияет на длительность заболевания, выраженность клинической симптоматики и варианты исхода болезни. В завершающую фазу заболевания может отмечаться выздоровление с угасанием неврологической симптоматики, хронизация патологического процесса или гибель больных. Возможно длительное латентное вирусоносительство, персистенция или хроническая форма инфекции.

Системный клещевой боррелиоз, или болезнь Лайма, – природно-очаговое трансмиссивное заболевание, возбудителем которого является грамотрицательная бактерия Borrelia burgdorferi семейства Spirochaetaceae. Заражение человека может происходить после укусов иксодовых клещей, инокуляции боррелий со слюной клеща, при раздавливании внедрившегося насекомого, также возможна трансплацентарная передача возбудителя от матери к плоду. Основным "резервуаром" и переносчиком вируса являются клещи Ixodes persulcatus, Ixodes ricinus, Ixodes scapularis. Чаще всего заражение происходит в весенне-летний период активности клещей.

Инкубационный период заболевания может длиться от 3 до 32 дней, по данным некоторых авторов до 60 дней. Клещевой боррелиоз имеет разнообразные клинические проявления. В первую фазу заболевания, фазу локальной инфекции, отмечаются лихорадка, интоксикация, головные боли, распространенная "мигрирующая" эритема на месте контакта клеща с кожей больного, регионарный лимфаденит. В фазу гематогенного и лимфогенного диссеминирования боррелий отмечается поражение органов и систем с развитием разнообразной клинической картины заболевания. Отмечается поражение опорно-двигательной, нервной, сердечно-сосудистой систем, глаз, печени, почек, кожи. При этом развивается клиническая картина невритов, радикулитов, энцефалитов, артритов, конъюнктивитов, миокардитов, появляется сыпь вне места укуса клеща. При прогрессировании заболевания, его осложнении и несвоевременном применении лечения могут развиться следующие процессы: неврологические нарушения в виде менингита, менингоэнцефалита, энцефалита и энцефаломиелита, тяжелые поражения сердца, рецидивирующие и/или хронические артриты. Возможно развитие непрерывного или рецидивирующего течения болезни, хронических форм поражения нервной системы.

В связи с тем что основным "резервуаром" и переносчиком клещевого энцефалита и системного клещевого боррелиоза являются иксодовые клещи, в лабораторной диагностике и выявлении возбудителей данных заболеваний используется непосредственное исследование клещей. Возможно обследование экземпляров клещей из природных очагов их распространения в целях выявления наличия возбудителей, определения процента инфицированных клещей на обследуемых территориях, количественного содержания вируса в случае клещевого энцефалита. Необходимым является исследование отдельных экземпляров клещей при их укусе человека, инокуляции вируса или боррелий со слюной клеща, при раздавливании внедрившегося насекомого. Это важно для определения возможного инфицирования клеща, своевременной диагностики заболеваний, экстренной специфической профилактике и проведении целенаправленного патогенетического лечения.

К современным методам диагностики возбудителей относятся методы твердофазного иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Они позволяют определить антиген возбудителя даже в минимальном объеме исследуемого биоматериала, характеризуются быстротой получения результата и обладают высокими показателями диагностической чувствительности и специфичности. Особенностью ПЦР-метода является возможность выявления генетического материала даже при малом его содержании в исследуемом биологическом материале. Данные методы позволяют в кратчайшие сроки определить наличие или отсутствие инфицированности клещей вирусом клещевого энцефалита и/или возбудителем клещевого боррелиоза. Но при отрицательных результатах исследований и сохранении подозрения на заболевания, а также при развитии клинической симптоматики рекомендуется исследование крови пациентов. При этом возможно определение антител классов IgM и/или IgG к антигенам возбудителей, а также выявление генетического материала возбудителей методом ПЦР.

Для чего используется исследование?

Для комплексной лабораторной диагностики клещевого энцефалита и/или системного клещевого боррелиоза;
для определения инфицированности исследуемых клещей;
для определения содержания антигенов и генетического материала возбудителей клещевого энцефалита и/или системного клещевого боррелиоза в исследуемых клещах;
для определения возможного инфицирования клеща в целях своевременной диагностики заболеваний, экстренной специфической профилактики и проведении целенаправленного патогенетического лечения;
для определения наличия и процента инфицированности клещей на исследуемой территории в природных очагах и в сезон распространения насекомых.

Когда назначается исследование?

При обследовании клеща после его укуса человека, раздавливания внедрившегося насекомого, извлечения клеща, в том числе в специализированном стационаре;
при обследовании клеща в целях диагностики антигенов и генетического материала возбудителей клещевого энцефалита и/или системного клещевого боррелиоза;
при обследовании клещей в целях определения наличия и процента инфицированности клещей на исследуемой территории в природных очагах и в сезон распространения насекомых.

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Причины положительного результата:

инфицированность исследуемого клеща вирусом клещевого энцефалита;
инфицированность исследуемого клеща возбудителем системного клещевого боррелиоза;
инфицированность исследуемого клеща вирусом клещевого энцефалита и системного клещевого боррелиоза.

Причины отрицательного результата:

отсутствие инфицированности исследуемого клеща вирусом клещевого энцефалита и/или системного клещевого боррелиоза;
содержание возбудителя в исследуемом материале ниже уровня детекции;
ложноотрицательные результаты.

При подозрении на наличие клещевого энцефалита и/или системного клещевого боррелиоза, но при отрицательных результатах исследования рекомендуется исследование крови пациентов. При этом возможно определение антител классов IgM и/или IgG к антигенам возбудителей, а также выявление генетического материала возбудителей методом ПЦР.

Кто назначает исследование?

Инфекционист, вирусолог, паразитолог, эпидемиолог.

21 Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с микроскопией мазка крови при выявлении патологических изменений)

25 Вирус клещевого энцефалита, IgM

29 Вирус клещевого энцефалита, IgG

57 Вирус клещевого энцефалита, антиген (в ликворе)

27 Белок общий в ликворе

30 Глюкоза в ликворе

50 Borrelia burgdorferi, IgM, титр

51 Borrelia burgdorferi, IgG, титр

13 Borrelia burgdorferi s.l., ДНК [ ПЦР ]

163 Серологическая диагностика клещевого боррелиоза и энцефалита

Литература

1. Wang G, Liveris D, Brei B, Wu H, Falco RC, Fish D, Schwartz I. Real-time PCR for simultaneous detection and quantification of Borrelia burgdorferi in field-collected Ixodes scapularis ticks from the Northeastern United States / Appl Environ Microbiol. 2003 Aug;69(8):4561-5.

2. Pancewicz SA, Garlicki AM, Moniuszko-Malinowska A, Zajkowska J, Kondrusik M, Grygorczuk S, Czupryna P, Dunaj J Diagnosis and treatment of tick-borne diseases recommendations of the Polish Society of Epidemiology and Infectious Diseases. Polish Society of Epidemiology and Infectious Diseases / Przegl Epidemiol. // 2015;69(2):309-16, 421-8.

3. Вирусологическое исследование отдельных экземпляров иксодовых клещей с использованием методов микроанализа. Методические рекомендации.

4. Ткачев С. Е., Ливанова Н. Н., Ливанов С. Г.Исследование генетического разнообразия вируса клещевого энцефалита сибирского генетического типа, выявленного в клещах Ixodes persulcatus на Северном Урале в 2006 году / Сибирский научный медицинский журнал, № 4 (126) – 2007.

5. Покровский В.И., Творогова М.Г., Шипулин Г.А. Лабораторная диагностика инфекционных болезней. Справочник / М. : БИНОМ. – 2013.

6. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни / М.: Медицина. – 2005. – 696 с.

Информация об исследовании

Клещевой энцефалит – менингоэнцефалит - вирусная инфекция нервной системы поражает не только человека, но и других млекопитающих. Вирус может инфицировать мозг, мозговые оболочки или то и другое вместе (менингоэнцефалит). Клещевой энцефалит - природноочаговое заболевание распространённое в России в основном в Сибири, Урале и на Дальном Востоке. В природе вирус имеет хозяина - клеща.
Этиология: возбудитель вирус клещевого энцефалита - член семейства флавивирусов (род flavivirius).

Выделяют 3 разновидности вируса:
1.Дальневосточный подвид
2.Центральноевропейский подвид
3.Возбудитель двухволнового менингоэнцефалита

Вирионы возбудителя клещевого энцефалита имеют сферическую форму с диаметром 40-50 нм. Внутренним компонентом является нуклеокапсид. Вирус длительное время сохраняется при низких температурах (оптимальный режим - 60 градусов и ниже). Быстро инактивируется при комнатной температуре.
Эпидемиология. Основными переносчикам вируса являются иксодовые клещи (Ixodes persulcatus, Ixodes nicinus). Во всех природных очагах вирус циркулирует между клещами и дикими животными (главным образом грызунами и птицами), которые являются дополнительным резервуаром. В антропурических очагах (местности сильно изменённые деятельностью человека) резервуаром могут служить домащние животные - козы и коровы. Вирус клещевого энцефалита может передоваться клещами трансовариально через яйцеклетки их потомству.

Пути передачи.
- Трансмисивный путь - через укус клеща.
- Алиментарный путь - при употреблении в пищу сырого молока и молочных продуктов инфецированных коз и коров.
Максимальный подъём заболеваемости в мае-июне. Второй менее выраженный подъём заболеваемости регистрируется в августе-сентябре, что сязанно с активностью и численностью клещей.
Клиническая картина.
Инкубационный период: при укусе клеща длится от 1-й до 2-х-3-х недель, при алиментарном способе заражения 4-7 дней. Клещевой энцефалит начинается внезапно с лихорадки, интоксикации. Температура тела повышается до 38-39 градусов. Больных беспокоят сильная головная боль, слабость, тошнота, рвота, нарушение сна. Характерен внешний вид больного — кожа лица, шеи, верхней половины грудной клетки, коньюктивы — гиперемированы, склеры инъецированы. Заболевание может завершиться в 3-5 дней.
Такая форма называется лихорадочной. Является одной из самых частых, но редко диагностируется. Поражение нервной системы при этой форме отсутствует. Менингиальная форма клещевого энцефалита характеризуется общемозговым синдромом, появляются регидность мышц затылка, симптомы Кернига и Брудзинского. Изменения в цереброспинальной жидкости свидетельствует о серозном менингите. Лихорадка длиться 10-14 дней.
Менингоэнцефалитическая форма протекает значительно тяжелее. Больной становиться вялым, заторможенным, сонливым. Усиливаются головные боли, тошнота, рвота, нередко наблюдается бред, галлюцинации, психомоторное возбуждение, нарушение сознания, у некоторых больных могут быть судороги, эпилептиформные припадки. Поражаются нервы иннервирующие лицевую и глазодвигательную мускулатуру и другие черепномозговые нервы.
Полирадикулоневритическая форма протекает с поражением периферических нервов и корешков с болями по ходу нервных стволов, нарушением чувствительности.
Полиэнцефаломиелитическая форма - наблюдаются проявления полимиелитического синдрома в виде симптома ‘’свисающей головы’’, ’’опущенных надплечий’’, ’’свисающих вдоль тела рук’’. Также периодически возникают подёргивания мышц фибриллярного или фасцикулярного характера. Полиэнцефаломиелитические нарушения могут сочетаться с проводниковыми, обычно пирамидными, вялые парезы рук и спастические ног. Комбинации амиотрофии и гиперфлексии в пределах одной паретической конечности.
Одним из методов диагностики клещевого энцефалита является ПЦР.
ПЦР (полимеразная цепная реакция) - это метод, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (ДНК) любого организма среди огромного количества других участков и многократно размножить его.

Достоинства метода:
-Более высокая чувствительность по сравнению с другими методами
-Высокая специфичность метода
-Позволяет выявить возбудитель в малом количестве пробы
-Позволяет выявить только живые микроорганизмы
-Является ранним контролем результатов проведенного лечения
-Скорость проведения анализов

Показания к исследованию.
-Выявление возбудителя при латентном и бессимптомном течении воспалительного процесса .
-Является единственным подтверждающим тестом, так как другие методы лабораторной диагностики (микроскопия и бактериологический) обладают более низкой чувствительностью по сравнению с ПЦР .
-Контроль эффективности проведенного лечения.

Изобретение относится к набору диагностических праймеров и зондов для одновременного выявления генетического материала вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий и может быть использовано в биотехнологии, в частности в генетической инженерии, в медицине для выявления генетического материала вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий в образцах клещей, в клинических или секционных пробах с целью постановки диагноза или коррекции лечения, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению клещевых инфекций, созданию диагностических, профилактических или лечебных препаратов.

На территории России широко распространены сочетанные очаги клещевых инфекций вирусной, бактериальной, риккетсиозной и протозойной природы. Имеются данные об инфицированности клещей одновременно несколькими патогенами, что ведет к возникновению микст-инфекций. Все это создает новую эпидемиологическую ситуацию, когда без решения вопросов дифференциальной диагностики невозможен успех в борьбе с этой большой группой заболеваний человека.

Клещевые инфекции поражают центральную нервную систему, различные органы и ткани. Неадекватная и запоздалая терапия может привести к развитию хронических заболеваний или инвалидности.

В настоящее время известны коммерческие наборы реагентов (аналоги) для обнаружения генетического материала возбудителей клещевых инфекций в исследуемых образцах:

Данные наборы реагентов обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, и с их помощью возможно выявление генетического материала боррелий, вирусов клещевого энцефалита и лихорадки Западного Нила. Однако все указанные наборы имеют в своем составе праймеры и зонды, позволяющие идентифицировать генетический материал инфекционных патогенов, передающихся иксодовыми клещами, только в моноплексном варианте, что требует четырех отдельных постановок ПЦР для идентификации четырех инфекционных патогенов. Использование разработанного набора олигонуклеотидных праймеров и зондов позволяет одновременно в одной реакционной ПЦР-смеси выявлять генетический материал вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий, что сокращает время проведения диагностики и делает исследование более полным, поскольку иксодовые клещи могут являться переносчиками одновременно нескольких инфекций.

Известны методы обнаружения генетического материала клещевых инфекций, предложенные в работах:

- [Hanaoka N, Matsutani M, Kawabata H, Yamamoto S, Fujita H, Sakata A, Azuma Y, Ogawa M, Takano A, Watanabe H, Kishimoto T, Shirai M, Kurane I, Ando S. Diagnostic assay for Rickettsia japonica // Emerg Infect Dis. 2009 Dec; 15(12):1994-7], где представлен набор олигонуклеотидов для диагностики риккетсиозов;

- [Yeh JY, Lee JH, Seo HJ, Park JY, Moon JS, Cho IS, Lee JB, Park SY, Song CS, Choi IS. Fast duplex one-step reverse transcriptase PCR for rapid differential detection of West Nile and Japanese encephalitis viruses // J Clin Microbiol. 2010 Nov; 48(11):4010-4], где предлагается набор праймеров для мультиплексной идентификации вируса лихорадки Западного Нила и вируса Японского энцефалита, методом ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом гель-электрофореза;

- [Schwaiger M, Cassinotti P. Development of a quantitative real-time RT-PCR assay with internal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus (TBEV) RNA // J Clin Virol. 2003 Jul; 27(2):136-45], в которой представлен набор олигонуклеотидов для детекции РНК вируса клещевого энцефалита;

- [Courtney JW, Kostelnik LM, Zeidner NS, Massung RF. Multiplex real-time PCR for detection of Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi // J Clin Microbiol. 2004 Jul; 42(7):3164-8], где представлен метод идентификации клещевых бактериальных инфекций, основанный на мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени.

Однако описанные в этих работах методы диагностики клещевых инфекций подразумевают либо моноплексный формат проведения ПЦР, либо применение набора праймеров и зондов для детекции только двух инфекций, либо применение гель-электрофоретической детекции продуктов амплификации, что делает метод более трудоемким и повышает риск контаминации продуктами амплификации ДНК.

Результаты патентного поиска по выявлению генетического материала вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий позволили определить несколько зарубежных аналогов, которые все же значительно отличаются от предлагаемого изобретения.

Известна патентная заявка США №20100278866, касающаяся метода ELISA клещевого энцефалита (КЭ), а не ПЦР диагностике, не позволяет проводить экспресс диагностику КЭ на ранних стадиях заболевания и является более затратным по времени постановки реакции и уступает методу ПЦР по чувствительности.

Известна патентная заявка США №20110143358, касается метода сравнения нуклеотидных последовательностей клещевых инфекций масс-спектрометрией и не может быть использована в практической лабораторной диагностике ввиду высокой стоимости.

Известна патентная заявка США №20120171679, касается использования мультиплексных биочипов в составе роботизированного комплекса для экспресс-диагностики инфекционных агентов, в том числе во время биотеррористических актов. Данный комплекс предусматривает использование дорогостоящего оборудования и не может быть доступен при выполнении простых диагностических задач.

Патенты Китая №CN101967513 и №CN101886113 касаются современного метода LAMP-PCR. Однако данный метод не может быть использован в лабораторной диагностике в настоящее время, поскольку предназначен для использования только в полевых условиях, не является количественным, и, кроме того, до настоящего времени ни одна LAMP-PCR тест-система не получила разрешения для использования в клинической лабораторной практике. Кроме того, метод LAMP-PCR является более дорогостоящим по сравнению с традиционным ПЦР и не может быть использован в формате мультиплексного ПЦР.

Изобретения по патенту Испании №ES2264642 и международной заявке №WO2004005479 касаются выявлению возбудителей трансмиссивных инфекций методом ПЦР, но не позволяет проводить выявления вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила. Кроме того, данный набор не зарегистрирован и недоступен на территории Российской Федерации. Стоимость диагностических тест-систем, произведенных за рубежом, значительно выше российских, что делает их недоступными в лабораторной практике.

Патент Китая №CN101629215 касается тест-системы для выявления вируса Западного Нила методом ПЦР в формате мультиплекс с инфекционными агентами, передающимися не клещами, а комарами, не являющимися эндемичными на территории России. Кроме того, стоимость диагностических тест-систем, произведенных за рубежом, значительно выше российских, что делает их недоступными в лабораторной практике.

Однако конструкция данного набора реагентов исключает возможность определения генетического материала вируса лихорадки Западного Нила и бактерий семейства Rickettsiae, являющихся возбудителями большой группы трансмиссивных острых лихорадочных заболеваний.

Техническим результатом заявляемого изобретения являлась разработка неизвесного ранее набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для мультиплексной идентификации генетического материала четырех инфекционных патогенов, передающихся клещами: вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, риккетсий и боррелий в образцах клещей, в клинических и секционных образцах и вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость и т.д.), методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Указанный технический результат достигается тем, что создан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, включающий:

- последовательности, видоспецифичные для вируса клещевого энцефалита:

- последовательности, видоспецифичные для вируса лихорадки Западного Нила:

Создание биолюминесцентной тест-системы для быстрого выявления вируса клещевого энцефалита в клещах

Наименование проекта:
Создание биолюминесцентной тест-системы для быстрого выявления вируса клещевого энцефалита в клещах

Организация/Руководитель:
ФГБУН Институт биофизики СО РАН
/ Франк Людмила Алексеевна

________________________________________
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
________________________________________

Номер: 16-44-240648
Название: Создание биолюминесцентной тест-системы для быстрого выявления вируса клещевого энцефалита в клещах
Руководитель: Франк Людмила Алексеевна
Организация-заявитель: ФГБУН Институт биофизики СО РАН
Конкурс: Конкурс проектов фундаментальных научных исследований
Объем целевого финансирования: 200 000,00 руб.
Софинансирование: 200 000,00 руб.
Тема научных исследований: Биомедицинские технологии, биотехнологические и биоинженерные основы моделирования и восстановления структуры и функций клеток, тканей и органов
Ключевые слова: Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), люцифераза, гибридный белок, твердофазный биолюминесцентный анализ, планшетный люминометр.

________________________________________
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
________________________________________

Актуальность проекта:
Исследования по созданию новых, высокочувствительных методов диагностики для медицины, санитарии и экологии края является одним из приоритетных направлений развития науки в регионе. Создание отечественной приборной базы имеет важнейшее значение как с точки зрения решения задачи импортозамещения, так и решения ряда социально-экономических проблем края.

Цель и задачи проекта:
Цель — создание тест-системы для высокочувствительного и быстрого выявления вируса клещевого энцефалита в клещах, пригодной для рутинного применения в условиях клинической лаборатории.

Задачи проекта:
1) Создать комплект реагентов, необходимых для проведения анализа; изучить свойства входящих в него реагентов — гибридного бежа (14D5a-Rm7), субстратов (целентеразин, Са2+- зависимый целентеразин-связывающий белок) при хранении в различных условиях, а также в условиях твердофазного иммуноанализа экстрактов природных клещей;
2) Разработать условия иммуноанализа и провести исследования значительного количества природных клещей (150-200 шт.). Результаты предлагаемого биолюминесцентного анализа сравнить с таковыми, полученными с использованием сертифицированного набора для колориметрического иммуноанализа (Вектор Бест, Новосибирск);
3) Определить основные параметры предлагаемого способа выявления клещей в сравнении с известными способами (колориметрический ИФА, РТ-ПЦР): достоверность выявления мишени, время и стоимость анализа;
4) Создать протокол проведения анализа и интерпретации полученных результатов;
5) Разработать техническое задание (ТЗ) для создания отечественного планшетного люминометра, пригодного для проведения измерений светового сигнала репортерных белков (люцифераз и фотопротеинов) в условиях клинической лаборатории.

Преимущества проекта перед аналогами:
Исследования биолюминесцентной реакции люциферазы Renilla в составе гибридного белка с различными субстратами – свободным целентеразином и целентеразином, связанным со специфическим кальций зависимым белком-носителем (СBP) проведены впервые и полученные результаты являются абсолютно новыми.
Создание простой и быстрой биолюминесцентной тест-системы на основе оригинального гибридного белка с использованием стабильного субстрата в виде целентеразин-связывающего белка, а также успешное тестирование этой системы для анализа природных клещей являются оригинальными и не имеют аналогов.

Основные научные публикации коллектива по теме проекта (не более десяти):
—
Перечень имеющихся у исполнителей по проекту объектов интеллектуальной собственности на научно-техническую продукцию, в том числе не защищенных:
—

Полный текст:

Обоснование. Для изучения механизмов репликации вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) в клетках позвоночных хозяев разных видов необходимо дифференциальное определение концентрации геномной и репликативной форм РНК (+РНК и –РНК соответственно). Однако имеющиеся в настоящее время подходы рассчитаны на измерение суммарного количества вирусной РНК. Для достоверного определения количества вирусной РНК на разных стадиях репликативного цикла требуется оптимизация методики ОТ-ПЦР.
Цель исследования. Разработать панель стандартных образцов синтетической ВКЭ и оптимизировать ОТ-ПЦР для специфичного количественного определения геномной +РНК вируса.
Методы. Фрагмент геномной +РНК ВКЭ синтезировали с использованием плазмидного вектора pTZ57RT\A со встроенным промотором T7 и соответствующей РНК-полимеразы. Контаминирующую ДНК удаляли с помощью обработки свободной от РНКаз ДНКазой I и дополнительного этапа выделения РНК. Обратную транскрипцию проводили с использованием специфичного антисмыслового праймера 11154R 5`- AGCGGGTGTTTTTCCG-3`, а количественное определение с помощью ПЦР выполняли согласно M. Schwaiger и P. Cassinotti (2003) с модификациями.
Результаты. В результате амплификации стандартных образцов концентрации РНК ВКЭ положительной полярности, проведённой в пяти независимых повторах в разные дни, коэффициент корреляции R2 между циклом количественного определения и концентрацией стандартного образца составил 0,99, а эффективность ПЦР составила 100%. Характеристики воспроизводимости, линейности и эффективности ПЦР свидетельствуют о валидности определения концентрации РНК ВКЭ. Коэффициент вариации при оценке межтестовой точности определения в среднем составил 2,8%, что сопоставимо с показателями оригинальнй методики.
Заключение. Оптимизированная количественная ОТ-ПЦР позволяет проводить рутинное лабораторное определение количества геномной РНК ВКЭ.

младший научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций

664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций

64003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия

доктор биологических наук, руководитель лаборатории трансмиссивных инфекций

664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, Россия

2. Ecker M, Allison SL, Meixner T, Heinz FX. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia. J Gen Virol. 1999; 80: 179-185. doi: 10.1099/0022-1317-80-1-179

3. Козлова И.В., Демина Т.В., Ткачев С.Е., Дорощенко Е.К., Лисак О.В., Верхозина М.М., и др. Характеристика байкальского субтипа вируса клещевого энцефалита, циркулирующего на территории Восточной Сибири. Acta biomedica scientifica. 2018; 3(4): 53-60. doi: 10.29413/ABS.2018-3.4.9

4. Dai X, Shang G, Lu S, Yang J, Xu J. A new subtype of eastern tick-borne encephalitis virus discovered in Qinghai-Tibet Plateau, China. Emerg Microbes Infect. 2018; 7(1): 74. doi: 10.1038/s41426-018-0081-6

5. Wallner G, Mandl CW, Kunz C, Heinz FX. The flavivirus 3’-noncoding region: extensive size heterogeneity independent of evolutionary relationships among strains of tick-borne encephalitis virus. Virology. 1995; 213(1): 169-178. doi: 10.1006/viro.1995.1557

6. Mandl CW, Kunz C, Heinz FX. Presence of poly(A) in a flavivirus: significant differences between the 3’-noncoding regions of the genomic RNAs of tick-borne encephalitis virus strains. J Virol. 1991; 65(8): 4070-4077.

7. Wallner G, Mandl CW, Ecker M, Holzmann H, Stiasny K, Kunz C, Heinz FX. Characterization and complete genome sequences of high- and low-virulence variants of tick-borne encephalitis virus. J Gen Virol. 1996; 77: 1035-1042. doi: 10.1099/0022-1317-77-5-1035

8. Chu PW, Westaway EG. Replication strategy of Kunjin virus: evidence for recycling role of replicative form RNA as template in semiconservative and asymmetric replication. Virology. 1985; 140(1): 68-79. doi: 10.1016/0042-6822(85)90446-5

9. Lindenbach BD, Thiel H-J, Rice CM. Flaviviridae: the viruses and their replication. In: Knipe DM, Howley PM (eds.). Fields Virology, 5th Edition. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia; 2007; 1101-1152.

10. Иткес А.В. Полимеразная цепная реакция. М.: Альтекс; 1999.

11. Пальцев М.А. Введение в молекулярную медицину. М.: Медицина; 2004.

12. Carnegie PR. Quality control in the food industries with DNA technologies. Australas Biotechnol. 1994; 4(3): 146-149.

13. De Vega М, Blanco L, Salas M. Processive proofreading and the spatial relationship between polymerase and exonuclease active sites of bacteriophage ø29 DNA polymerase. J Mol Biol. 1999; 292(1): 39-51. doi: 10.1006/jmbi.1999.3052

14. Dean FB, Neison JR, Giesier TL, Lasken RS. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi29 DNA polymerase and multiplyprimed rolling circle amplification. Genome Res. 2001; 11(6): 1095-1099. doi: 10.1101/gr.180501

15. Lo АС, Feldman SR. Polymerase chain reaction: basic concepts and clinical applications in dermatology. J Am Acad Dermatol. 1994; 30(2 Pt 1): 250-260. doi: 10.1016/S0190-9622(94)70025-7

16. Little MC, Andrews J, Moore R, Bustos S, Jones L, Embres C, et al. Strand displacement amplification and homogeneous real-time detection incorporated in a second-generation DNA probe system, BDProbeTecET. Clin Chem. 1999; 45(6): 777-784.

17. Schwaiger M, Cassinotti P. Development of a quantitative real-time RT-PCR assay with internal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus (TBEV) RNA. J Clin Virol. 2003; 27(2): 136-145. doi: 10.1016/S1386-6532(02)00168-3

19. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real-time quantitative PCR. Genome Res. 1996; 6(10): 986-994. doi: 10.1101/gr.6.10.986

20. Хаснатинов М.А., Болотова Н.А., Миловидов К.С., Кондратов И.Г., Данчинова Г.А. Репликация РНК вируса клещевого энцефалита в новой перевиваемой линии клеток естественного хозяина Apodemus peninsulae. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018; 36(1): 41-45. doi: 10.18821/0208-0613-2018-36-1-41-45

21. Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Злобин В.И., Ляпунов А.В., Арбатская Е.В., Чапоргина Е.А., и др. Вирус клещевого энцефалита в Монголии. Сибирский медицинский журнал (Иркутск). 2012; 4: 9-12.

22. Chung CT, Niemela SI, Miller RH. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS. 1998; 86(7): 2172-2175. doi: 10.1073/pnas.86.7.2172

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

Читайте также: